全 文 ：第７卷第５期
２００９年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０５．０１４
收稿日期：２００９－０１－２１
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０７０６０１７）
作者简介：孙爱友（１９７５—），男，山东诸城人，讲师，博士，研究方向：生物化工，Ｅｍａｉｌ：ｓｕｎａｉｙｏｕ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
乳酸片球菌素（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）效价测定的条件优化
孙爱友，秦鲁敏，宋建民，董玉国，魏东芝
（华东理工大学 生物工程学院 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７）
摘 要：目前的乳酸片球菌素（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）效价测定方法误差大、耗时较长。为了减少测定误差并缩短测定时间，研
究并优化了乳酸片球菌素（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）效价测定中的几个关键因素，得到较优的实验条件：发酵液加热时间３０ｍｉｎ、
菌体吸附２ｈ、解吸附３ｈ、指示菌加入量为４００μＬ（３０ｍＬ固体检测培养基中含菌２１×１０８个）、试样 ｐＨ为２０时，
测定的Ｐｅｄｉｏｃｉｎ效价误差较小；试样处理时间由１２ｈ缩短为约５ｈ。
关键词：乳酸片球菌素；效价；测定
中图分类号：Ｑ３３１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０５－００６９－０４
ＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＰｅｄｉｏｃｉｎｏｆｐｏｔｅｎｃｙ
ＳＵＮＡｉｙｏｕ，ＱＩＮＬｕｍｉｎ，ＳＯＮＧＪｉａｎｍｉｎ，ＤＯＮＧＹｕｇｕｏ，ＷＥＩＤｏｎｇｚｈｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｋｅｙｆａｃｔｏｒｓｉｎｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅＰｅｄｉｏｃｉｎｏｆｐｏｔｅｎｃｙｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｔｈｅｍｅａｓｕｒｅ
ｍｅｎｔｅｒｏｒｗａｓｓｍａｌｕｎｄｅｒｔｈｅｆｏｌｏｗｉｎｇｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：ｈｅａｔｉｎｇｔｈｅｂｒｏｔｈｆｏｒ３０ｍｉｎ，ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｔｉｍｅ２ｈ，
ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｔｉｍｅ３ｈ，ｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙｏｆｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ２１×１０８ｃｆｕｐｅｒ３０ｍＬ，ａｎｄｓａｍｐｌｅｐＨ２０．
Ｔｈｅｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｔｉｍｅｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ１２ｈｔｏ５ｈｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｐｅｄｉｏｃｉｎ；ｐｏｔｅｎｃｙ；ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
乳酸片球菌素（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）是由乳酸片球菌（Ｐｅ
ｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）产生的一种耐高、低温、耐酸、
在人体中可降解、安全无毒，且使用方便的抗菌短
肽。Ｐｅｄｉｏｃｉｎ能抑制包括白色念珠菌、大肠杆菌、金
黄色葡萄球菌、枯草杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌等菌
株［１］，可以用于食品保藏和人类的疾病治疗，具有
极高的使用价值和应用前景。
国内外检测Ｐｅｄｉｏｃｉｎ效价主要是应用最高稀释
倍数法［２－６］，文献［７］则采用半数抑制率来检测 Ｐｅ
ｄｉｏｃｉｎ效价。在测定过程中，影响效价测定精度和
灵敏度的因素较多，测定误差也较大，可操作性较
差。本文研究和优化Ｐｅｄｉｏｃｉｎ测定过程中的几个关
键影响因素，尤其是优化试样制备过程中的操作条
件，缩短测定时间，减小测定误差。
１ 材料与方法
１１ 菌株
Ｐｅｄｉｏｃｉｎ产生菌：乳酸片球菌（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓａｃｉｄｉ
ｌａｃｔｉｃｉ）ＬＨ３１，由华东理工大学鲁华生物技术研究所
提供；指示菌：粪肠球菌 （Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）
ＧＩＭ１２０２购自广东省微生物菌种保藏中心。
１２ 培养基
１２１ ＭＲＳ培养基（ｇ／Ｌ）
蛋白胨１００，牛肉膏１００，酵母粉５０，葡萄糖
２００，Ｔｗｅｅｎ ８０１０，柠檬酸铵 ２０，乙酸钠 ２０，
ＭｇＳＯ４０１，ＭｎＳＯ４００５，Ｋ２ＨＰＯ４２０。ｐＨ６５。
１２２ 粪肠球菌培养基
牛肉膏５ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ５ｇ／Ｌ。ｐＨ７０。
加琼脂粉 １５ｇ／Ｌ即可制作粪肠球菌固体培
养基。
１３ 菌体培养方法和效价测定方法
１３１ 乳酸片球菌培养方法
从 ２０℃冻存的乳酸片球菌甘油管中吸取
３００μＬ溶液，接种到装液量为３０ｍＬＭＲＳ培养基的
２５０ｍＬ三角瓶中，２００ｒ／ｍｉｎ的摇床上３０℃活化培
养。１０ｈ后，吸取３００μＬ发酵液，转接到装液量为
３０ｍＬ的２５０ｍＬ三角瓶中，同样条件培养１２ｈ。
１３２ 粪肠球菌培养方法和效价测定方法
从 ２０℃ 冻存的粪肠球菌甘油管中吸取
６００μＬ，接种到装液量为３０ｍＬ粪肠球菌培养基的
２５０ｍＬ三角瓶中，２００ｒ／ｍｉｎ的摇床上３０℃培养
１０ｈ，得到的即为指示菌菌液。吸取３００μＬ粪肠球
菌菌液加入到５０℃的３０ｍＬ固体粪肠球菌培养基
中，倒入预先铺好的空白琼脂平板上制作检测平
板。平板上用打孔器打出直径为２ｍｍ的小孔，加入
试样溶液５μＬ，每一菌密度做３个平行样，３０℃下
静置培养１２ｈ，根据标准曲线计算试样效价。
１４ 乳链菌肽（Ｎｉｓｉｎ）标准溶液配制［８］与标准曲线
的制作
称取０１ｇＮｉｓｉｎ（Ｓｉｇｍａ公司）溶于１０ｍＬ去离
子水中，制得效价１２０００ＡＵ／ｍＬ的标准溶液，并依
次稀释为３７５、７５０、１５００、３０００和６０００ＡＵ／ｍＬ的浓
度梯度，用０５ｍｏｌ／Ｌ的盐酸调 ｐＨ至２０。标准品
加入到含指示菌的平板上培养后，测量直径，计算
面积，做出标准曲线图，如图１所示。
图１ Ｎｉｓｉｎ效价标准曲线
Ｆｉｇ．１ ＳｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｏｆＮｉｓｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
２ 结果与讨论
２１ 优化加热灭菌时间
将片球菌发酵液于７０℃水浴中持续加热不同
时间后，分别吸取加热后的发酵液１００μＬ，于 ＭＲＳ
固体培养基平板上统计菌落数，检测残留活菌数，
同时检测发酵液效价，实验结果分别见表 １和
图２。
表１ 加热时间对灭菌效果的影响
Ｔａｂｌｅ１ Ｅｆｅｃｔｏｆｈｅａｔｉｎｇｔｉｍｅｏｆｂｒｏｔｈｏｎｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ
加热时间／ｍｉｎ 残留活菌／（个·ｍＬ－１）
０ ２１×１０９
５ ５４×１０６
１０ ９１×１０３
２０ ０
３０ ０
６０ ０
由表１可见，当７０℃水浴加热２０ｍｉｎ时，发酵
液中已无活菌存在。
图２ 加热时间对Ｐｅｄｉｏｃｉｎ效价的影响
Ｆｉｇ．２ ＥｆｅｃｔｏｆｈｅａｔｉｎｇｔｉｍｅｏｎＰｅｄｉｏｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
由图２可知，当发酵液中存在活菌（加热时间
少于２０ｍｉｎ）时，活菌会在检测平板上继续生长并持
续产生Ｐｅｄｉｏｃｉｎ，造成效价测定值偏高。由于Ｐｅｄｉｏ
ｃｉｎ具有很强的热稳定性，７０℃下加热 ０～９０ｍｉｎ
时，不影响 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ抑菌活性，因此，选取３０ｍｉｎ作
为发酵液加热灭菌时间。
２２ 吸附时间优化
由于片球菌在ｐＨ为６５时对Ｐｅｄｉｏｃｉｎ具有最强
的吸附效果［４，７］，因此，将热处理后的发酵液的ｐＨ用
４ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ调至６５，在３０℃时，２００ｒ／ｍｉｎ分别
离心０、０５、１、２、３、４５和６ｈ，将Ｐｅｄｉｏｃｉｎ吸附到菌体
表面。吸附时间对效价的影响如图３所示。
由图３可知：当吸附时间小于２ｈ时，Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的
吸附量随时间增加而递增；２ｈ以后，菌体对Ｐｅｄｉｏｃｉｎ
０７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图３ 震荡吸附时间对效价的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｏｆａｄｓｏｒｐｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎ
Ｐｅｄｉｏｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
的吸附量基本保持恒定。因此选取２ｈ作为Ｐｅｄｉｏｃｉｎ
的吸附时间。
２３ 解吸附时间优化
由于片球菌在 ｐＨ为２０时对 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的解吸
附效果最好［４，７］。因此，先将吸附Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的菌体经
１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后，洗涤２次，重悬于生理
盐水中，然后用２ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶液调ｐＨ至２０，用
生理盐水将上述溶液调整至发酵液的等体积，再
２００ｒ／ｍｉｎ离心０、０５、１、２、３、４５和６ｈ，将吸附在菌
体表面的Ｐｅｄｉｏｃｉｎ充分解吸附，结果如图４所示。
图４ 震荡解吸附时间对效价的影响
Ｆｉｇ．４ ＥｆｅｃｔｏｆｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎＰｅｄｉｏｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
由图４可知，随着解析时间的延长，从发酵液中
测得的 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ效价越高，在３ｈ时出现峰值，而后
逐渐下降，故选取３ｈ作为解吸附的最佳时间。因
此，吸附和解吸时间为５ｈ，这比文献［９］所报道的
时间少了７ｈ。
２４ 优化指示菌加入量提高检测灵敏度
指示菌接种到含３０ｍＬ培养基的三角瓶中后，
放置在３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ的摇床上分别培养 ６、８和
１０ｈ，每一瓶分别吸取３００、４００、５００μＬ加入检测培
养基中并制备平板。平板上用打孔器打孔后，加入
５μＬ标准品及待测试样，３０℃下静置培养１２ｈ，观
察抑菌圈边缘清晰度，并计算试样的效价。
由表２可知，指示菌的培养时间和加入量显著影
响了试样效价大小和抑菌圈边缘的清晰度。当加入
培养时间为８ｈ、接种量为４００μＬ的粪肠球菌（３０ｍＬ
固体检测培养基含菌体量约为２１×１０８个）作为指示
菌时，测得的试样效价和抑菌圈边缘清晰度都最高，
检测的灵敏度和测定结果的精确度都最好。
表２ 指示菌的培养时间和加入量对抑菌圈大小的影响
Ｔａｂｌｅ２ Ｅｆｅｃｔｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎｔｉｍｅ
ｏｆｉｎｄｉｃａｔｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａｏｎＰｅｄｉｏｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
培养
时间／ｈ
残留活菌数／
（１０８个·
ｍＬ－１）
加入量／
μＬ
试样效价／
（ＡＵ·ｍＬ－１）
抑菌圈边
缘清晰度
６ ０３７
３００ ２４５０±６０ ＋
４００ ２８９０±７０ ＋＋
５００ ３４７０±４０ ＋
８ ５３
３００ ２８６０±７０ ＋
４００ ３７８０±３０ ＋＋＋
５００ １９７０±７０ ＋＋
１０ １１
３００ ２１００±７０ ＋＋
４００ ２３４０±６０ ＋＋＋
５００ １５００±９０ ＋＋
注：＋表示抑菌圈边缘较模糊；＋＋表示边缘较清晰；＋＋＋
表示边缘清晰。
图５ ｐＨ对效价检测的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｏｆｐＨｖａｌｕｅｏｎＰｅｄｉｏｃｉｎｐｏｔｅｎｃｙ
２５ 试样ｐＨ的影响
将Ｐｅｄｉｏｃｉｎ试样溶液的ｐＨ用２ｍｏｌ／Ｌ的ＨＣｌ溶
液和４ｍｏｌ／Ｌ的 ＮａＯＨ溶液分别调至２、４、６、７、８、１０
和１２后，检测效价，结果如图５所示。由图５可知，
Ｐｅｄｉｏｃｉｎ试样的效价随 ｐＨ的升高呈递减趋势。在
ｐＨ为２０和４０的酸性条件下，试样表现出较高的
效价；中性环境下次之；碱性条件下，试样效价锐
减。这是由 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的空间结构性质决定的，在酸
１７ 第５期 孙爱友等：乳酸片球菌素（Ｐｅｄｉｏｃｉｎ）效价测定的条件优化
性条件下其空间结构更稳定，活性更强；而在碱性
条件下不稳定，活性降低。由于 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ都是在 ｐＨ
为２０的情况下解吸附与冻存，从操作简便性和效
价测定的灵敏度和精度考虑，确定将标准品和试样
的ｐＨ都调到２０来测其效价。
３ 结 论
在文献基础上进一步优化了加热灭菌时间
（３０ｍｉｎ），消除了活菌对效价的干扰；细化了试样处
理步骤，采用吸附和解吸附两步，排除了发酵液其
他成分对效价测定的干扰，同时也最大限度地减少
了Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的损失；确定了片球菌对 Ｐｅｄｉｏｃｉｎ的最
佳吸附和解吸附时间，分别为２ｈ和３ｈ，既让 Ｐｅｄｉｏ
ｃｉｎ在菌体表面上充分吸附和解吸附，又将吸附和缩
短为５ｈ；试样总处理时间缩短至约５ｈ；确定试样的
ｐＨ为２０；优化了指示菌的接种密度（３０ｍＬ固体检
测培养基中含菌２１×１０８个），提高了抑菌圈边缘
的清晰度，减小了效价测定误差。
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２７ 生 物 加 工 过 程 第７卷