全 文 ：第 １２卷第 ３期
２０１４年 ５月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ３
Ｍａｙ ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０３􀆰 ００２
收稿日期：２０１３－０２－２２
基金项目：国家自然科学基金（２０５７６０５５）
作者简介：贾全栋（１９８９—），男，山东青岛人，硕士研究生，研究方向：生物化工；张伟国（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｗｇ１６８＠ １２６．ｃｏｍ
谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件
贾全栋，刘学胜，郭燕风，徐建中，张伟国
（江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：考察谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ厌氧产丁二酸的发酵条件。 结果发现：补加 ＮａＨＣＯ３的效果最好，并
且考察了 ＮａＨＣＯ３浓度对葡萄糖转化速率及丁二酸生成速率的影响。 运用代谢流分析方法分析了乳酸脱氢酶基因
敲除对谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢的影响，发现乳酸脱氢酶基因敲除导致磷酸烯醇式丙酮酸生成丁二酸的流量提高
了 ２１４􀆰 ３％，流向乳酸的流量变为 ０；分批厌氧转化 ３６ ｈ生成 ４１􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ丁二酸，产率 ４５􀆰 ０％。
关键词：厌氧转化；谷氨酸棒状杆菌；乳酸脱氢酶基因；代谢流；丁二酸
中图分类号：ＴＱ９２１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０３－０００７－０５
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｏｎ ａｎａｅｒｏｂｉｃ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＪＩＡ Ｑｕａｎｄｏｎｇ，ＬＩＵ Ｘｕｅｓｈｅｎｇ，ＧＵＯ Ｙａｎｆｅｎｇ，ＸＵ Ｊｉａｎｚｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉｇｕｏ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ􀆰 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｅ ｏｆ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ􀆰 Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌａｃｔａｔｅ
ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｗｅｒｅ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｔｏ ｔｈｅ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ
２１４􀆰 ３％， ｗｈｉｌｅ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｔｏ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｐａｔｈｗａｙ ｂｅｃａｍｅ ｚｅｒｏ􀆰 Ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｒｅａｃｈｅｄ ４１􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈｉｎ ３６ ｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ４５􀆰 ０％􀆰
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ；ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｇｅｎｅ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ
ｆｌｕｘ；ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
　 　 丁二酸又称琥珀酸、二元羧酸，其作为 Ｃ４ 平台
化合物，在食品、医药、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶
剂、生物可降解塑料和动植物生长刺激物等领域有
广泛的应用前景［１］。 化学法生产丁二酸成本高，对
环境污染严重［２］，抑制了其作为大宗化学品的发展
潜力；生物法生产丁二酸具有低成本、污染小的优
点，越来越受到人们的重视［３］。
谷氨酸棒状杆菌是一种生长快、好氧和不产
芽胞的革兰氏阳性微生物。 在 Ｏ２ 充足条件下，以
葡萄糖为原料，发酵生产各种氨基酸［４－５］ ；在厌氧
条件下，谷氨酸棒状杆菌不生长，但可以转化葡萄
糖为乳酸、丁二酸和乙酸等物质［６－７］ 。 谷氨酸棒状
杆菌生物转化法生产丁二酸，主要是通过三羧酸
循环途径 （ ＴＣＡ） 的还原支路，将糖酵解途径
（ＥＭＰ）中得到的磷酸烯醇式丙酮酸或丙酮酸经过
一步 ＣＯ２固定和两步还原反应生成丁二酸，该过程
涉及的关键酶主要有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激
酶、丙酮酸羧化酶、苹果酸脱氢酶、延胡索酸酶和
琥珀酸脱氢酶［８］ 。
本文中，笔者研究温度和 ＮａＨＣＯ３等环境条件
对谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ 产丁二酸的影
响，通过代谢流分析比较原始菌株谷氨酸棒状杆菌
ＡＴＣＣ１３０３２与 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ 在厌氧条件下的代
谢流分布情况。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种
谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２ 和谷氨酸棒状杆
菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ（工业生物技术教育部重点实验
室构建并保藏）。
１􀆰 １􀆰 ２　 主要试剂及仪器
葡萄糖（食品级），山东西王集团；玉米浆，潍坊
金玉米有限公司；高效液相色谱仪，美国 Ｄｉｏｎｅｘ 公
司；ＳＢＡ ４０Ｃ生物传感分析仪，山东省科学院生物
研究所；冷冻离心机，美国 Ｂｅｃｋｍａｎ公司。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 培养基
种子培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ２５，玉米浆 ３０，尿素
６􀆰 ０，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ ２􀆰 ０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ６；ｐＨ ７􀆰 ２。
０􀆰 １ ＭＰａ灭菌 ２０ ｍｉｎ。
发酵培养基 （ ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 ７０， ＫＨ２ Ｐ０４ １􀆰 ０，
Ｋ２ＨＰＯ４ １􀆰 ０，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ６，ＭｎＳＯ４·４Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ０２，
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ０２，ＶＢ１ ０􀆰 ０００ ２，ＶＨ ０􀆰 ０００ ２；ｐＨ ６􀆰 ５。
０􀆰 ０７ ＭＰａ灭菌 １０ ｍｉｎ，发酵过程中间歇性补加ＮａＨＣＯ３。
１􀆰 ２􀆰 ２　 培养方法
种子液培养方法：挑取活化后的菌种接入装有
５０ ｍＬ种子培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶中，在 ３１ ℃、
１００ ｒ ／ ｍｉｎ条件下培养 １０ ｈ。
将种子液离心（６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃、１０ ｍｉｎ），收
集菌体，然后用发酵培养基将菌体重新悬浮成菌悬
液；干菌体质量浓度 ４０ ｇ ／ Ｌ，将菌悬液接种到 ３１ ℃
有盖子的瓶子中厌氧转化 ３６ ｈ，转化过程间歇性补
加 ＮａＨＣＯ３。
１􀆰 ２􀆰 ３　 菌体生长曲线测定
将样品用蒸馏水稀释 ２６ 倍，在 ６１０ ｎｍ 波长下
测量吸光度（Ａ６１０）。
１􀆰 ２􀆰 ４　 菌体干质量测定
称出 １００ ｍＬ离心管的质量（ｍ１），取 ５０ ｍＬ 种
子液置于离心管中，６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ，蒸馏
水洗涤 ２次，于 １０５ ℃烘箱中干燥至恒质量后称质
量（ｍ２），菌体干质量＝ ｍ２－ｍ１。
１􀆰 ２􀆰 ５　 样品处理
发酵结束后，收集发酵液 ６ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心，上
清液用蒸馏水稀释 １０倍后用于有机酸含量测定。
１􀆰 ２􀆰 ６　 葡萄糖、有机酸含量的测定
葡萄糖含量利用 ＳＢＡ ４０Ｃ 生物传感反应仪
（山东省科学院生物研究所）测定；有机酸含量测
定［９］：采用高效液相色谱法（戴安 Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ６８０ 系
列），色谱柱为 ＣＯＳＭＯＳＩＬ反相色谱柱（４􀆰 ６ ｍｍ×２５０
ｍｍ，５ μｍ），流动相为体积分数 ０􀆰 ５％乙腈 － ２０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４溶液，ｐＨ ２􀆰 ５，流速 ０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ，进
样体积 １０ μＬ，柱温 ２５ ℃，紫外检测器检测，检测波
长为 ２１０ ｎｍ。
１􀆰 ２􀆰 ７　 谷氨酸棒状杆菌厌氧产酸代谢流分析方法
代谢流分析（ＭＦＡ）是代谢工程中用以指导遗
传操作的重要工具，是代谢网络定量分析的基本方
法之一［１０］。 ＭＦＡ根据胞内主要反应构建的代谢网
络模型和胞内代谢产物的质量平衡来计算物质代
谢流分布情况，对于理解细胞的代谢调控机制具有
重要意义。 根据文献［１１］以及发酵实验分析，建立
了谷氨酸棒状杆菌以葡萄糖为 Ｃ 源，在厌氧条件下
合成丁二酸的代谢网络，如图 １ 所示。 主要包括糖
酵解途径、部分 ＴＣＡ 途径、Ｃ３、Ｃ４ 的合成途径。 代
谢流平衡模型的建立：代谢节点处反应速率方程见
表 １。 方程组由 ４ 个方程构成，８ 个未知数，通过测
定厌氧转化反应速率确定代谢网络流量分配，在谷
氨酸棒状杆菌厌氧转化前期（０～６ ｈ）离线测定葡萄
糖、乳酸、丁二酸和乙酸的浓度。 在谷氨酸棒状杆
菌厌氧代谢过程中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶对
ＣＯ２的固定起主要作用，占有主导地位，丙酮酸羧化
酶的敲除对菌株产生丁二酸没有影响［１２］，因此以
Ｊ６ ＝ ０，作为已知参量，代入上述代谢速率平衡方程
组，通过以上数据可以计算代谢流分布。 在代谢流
的计算中，均以 １００ ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｈ）的葡萄糖为计算基
准，所有代谢流量的单位均为 ｍｍｏｌ ／ （Ｌ·ｈ）。
基于以下原则建立代谢网络［１３］：①代谢流分析是
基于拟稳态假设基础上的分析方法；②反应途径中消
耗的 ＮＡＤＨ与代谢产生的 ＮＡＤＨ总数相等，即 ＮＡＤＨ
供需平衡；③忽略乙醛酸循环，不考虑 ＥＭＰ 途径；④按
８ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
Ｇｌｃ—葡萄糖；Ｇ６Ｐ—葡萄糖 ６ 磷酸；
ＧＡ３Ｐ—３ 磷酸甘油醛；ＰＥＰ—磷酸烯醇式丙酮酸；Ｐｙｒ—丙酮酸；
ＡｃＣｏＡ—乙酰辅酶 Ａ；Ａｃｅ—乙酸；Ｓｕｃ—丁二酸；Ｌａｃ—乳酸
Ｊ１：Ｇｌｃ ＋ ＡＴＰ→Ｇ６Ｐ ＋ ＡＤＰ； Ｊ２： Ｇ６Ｐ ＋ ＡＴＰ→２ＧＡ３Ｐ ＋ ＡＤＰ； Ｊ３：
ＧＡ３Ｐ＋ＮＡＤ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ→ＰＥＰ＋ＡＴＰ＋ＮＡＤＨ＋Ｈ２Ｏ；Ｊ４：ＰＥＰ＋ＡＤＰ→
ＡＴＰ＋Ｐｙｒ；Ｊ５：ＰＥＰ ＋ＣＯ２ ＋ ２ＮＡＤＨ→Ｓｕｃ＋ ２ＮＡＤ＋Ｈ２ Ｏ； Ｊ６：Ｐｙｒ ＋
２ＮＡＤＨ＋ＡＴＰ＋ＣＯ２→Ｓｕｃ ＋ＡＤＰ＋Ｐｉ＋２ＮＡＤ＋Ｈ２Ｏ；Ｊ７：Ｐｙｒ＋ＣｏＡ＋
ＮＡＤ→ＡｃＣｏＡ＋ＮＡＤＨ＋ＣＯ２； Ｊ８：ＡｃＣｏＡ ＋ＡＤＰ ＋Ｐｉ→Ａｃｅ ＋ＣｏＡ ＋
ＡＴＰ；Ｊ９：Ｐｙｒ＋ＮＡＤＨ→Ｌａｃ＋ＮＡＤ
图 １　 谷氨酸棒状杆菌厌氧代谢流量分布
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
固定比例进行的反应及无分支点的中间反应，尽量简
化为一个反应方程；⑤细胞生长停滞阶段，由于大量无
效循环的存在，所以不考虑 ＡＴＰ总量的平衡。
表 １　 代谢节点反应速率方程
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｎｏｄｅｓ
代谢节点 反应速率方程
ＧＡ３Ｐ ２Ｊ２ Ｊ３ ＝ ０
ＰＥＰ Ｊ３ Ｊ４ Ｊ５ ＝ ０
Ｐｙｒ Ｊ４ Ｊ６ Ｊ７ Ｊ９ ＝ ０
ＡｃＣｏＡ Ｊ７ Ｊ８ ＝ ０
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌生长
的影响
　 　 测定菌株的生长曲线，每 ２ ｈ 取样，绘制生长曲
线，见图 ２。 由图 ２可知，菌株 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ和原
始菌株进入对数生长期和稳定期时间是一致的，但
最终敲除菌的生物量比原始菌明显减少，说明乳酸
脱氢酶基因的敲除对菌株生长上有一定的负面
影响。
图 ２　 谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２及其突变株
ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ的生长曲线
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２
ａｎｄ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
２􀆰 ２　 碳酸盐对丁二酸产量的影响
在谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ 转化葡萄
糖产丁二酸过程中，主要通过磷酸烯醇式丙酮酸羧
化酶固定 ＣＯ２生成丁二酸的前体物质草酰乙酸。 碳
酸盐对丁二酸产量的影响见图 ３。 由图 ３ 可知：在
ｐＨ ８􀆰 ０条件下，发现补加 ＮａＨＣＯ３的效果最好，丁二
酸产量为 ３３􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ；而补加 ＣａＣＯ３和 Ｎａ２ＣＯ３，丁二
酸产量很低。
图 ３　 碳酸盐对丁二酸产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎａｔｅｓ ｏｎ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
２􀆰 ３　 ＮａＨＣＯ３质量浓度对厌氧转化的影响
ＮａＨＣＯ３作为 ＣＯ２的来源，对于丁二酸厌氧转化非常
重要［１４］。 考察ＮａＨＣＯ３的添加量对代谢的影响，一次性
添加不同质量浓度（０、１０、２０、３０、４０和 ５０ ｇ ／ Ｌ）ＮａＨＣＯ３，
初始 ｐＨ ８􀆰 ０，厌氧转化 ２０ ｈ，结果如表 ２所示。
９　 第 ３期 贾全栋等：谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件
由表 ２可知：ＮａＨＣＯ３的浓度影响葡萄糖转化速
率，在 ０～５０ ｇ ／ Ｌ的范围内，ＮａＨＣＯ３的浓度越高，葡萄
糖的转化速率越快；ＮａＨＣＯ３的浓度也影响代谢流的
分布，ＮａＨＣＯ３浓度低时，代谢流较多流向丙酮酸，转
化为大量乙酸。 随着 ＮａＨＣＯ３浓度的提高，流向丁二
酸的代谢流增加，ＮａＨＣＯ３浓度的增加使葡萄糖更多
地转化为丁二酸，丁二酸与乙酸的摩尔比增加。 但是
添加 ５０ ｇ ／ Ｌ ＮａＨＣＯ３，丁二酸浓度降低，丁二酸与乙
酸的摩尔比也有所降低，说明过高的 ＮａＨＣＯ３对菌体
转化造成抑制，ＮａＨＣＯ３不仅是丁二酸的合成来源，也
是影响厌氧代谢流向的重要因素，因此在厌氧转化过
程中必须合理补加 ＮａＨＣＯ３。
表 ２　 ＮａＨＣＯ３浓度对厌氧代谢的影响
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ ｏｎ Ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
ρ（ＮａＨＣＯ３） ／
（ｇ·Ｌ－１）
葡萄糖转化速率 ／
（ ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
ρ（丁二酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
丁二酸产生速率 ／
（ｇ·Ｌ－１·ｈ－１）
ｎ（丁二酸） ∶
ｎ（乙酸）
０ １􀆰 ３０ ３􀆰 ８２ ９􀆰 ３５ ０􀆰 １９ ０􀆰 ２１ ∶１
１０ １􀆰 ４３ ７􀆰 ４５ ５􀆰 ２４ ０􀆰 ３７ ０􀆰 ７２ ∶１
２０ １􀆰 ６８ ９􀆰 ２８ ５􀆰 ８５ ０􀆰 ４６ ０􀆰 ８１ ∶１
３０ １􀆰 ８５ １２􀆰 ４ ７􀆰 ６８ ０􀆰 ６２ ０􀆰 ８２ ∶１
４０ １􀆰 ９８ １８􀆰 ３ ８􀆰 １４ ０􀆰 ９２ １􀆰 １４ ∶１
５０ ２􀆰 ０８ １７􀆰 ３ ８􀆰 ８２ ０􀆰 ８７ １􀆰 ００ ∶１
２􀆰 ４　 温度对厌氧转化的影响
微生物的产物合成需要在合适的温度下进行，
温度对微生物的影响是多方面的，如酶活、传质等
方面。 温度对发酵的影响是各种因素综合变化的
结果，因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温
度环境［１５］。 笔者考察温度对丁二酸转化的影响，结
果如图 ４所示。 由图 ４可知：随着温度的升高，丁二
酸质量浓度不断增加，当温度达到 ３３ ℃后，再升高
温度，丁二酸质量浓度反而有所下降。 所以，选取
３３ ℃作为丁二酸发酵的最佳温度。
图 ４　 温度对丁二酸产量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｂｙ Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
２􀆰 ５　 代谢流分析
代谢流分析可以直观地反映不同途径的相互
作用以及围绕代谢分支点的物质流分布，进而表征
细胞的代谢能力［１６］。 通过研究谷氨酸棒状杆菌厌
氧代谢转化葡萄糖前期的代谢流，分析乳酸脱氢酶
基因敲除对代谢流分布的影响。 对厌氧转化前期
（０～６ ｈ）代谢流量进行分析，选择 ０和 ６ ｈ离线测定
葡萄糖、丁二酸、乙酸和乳酸的浓度。 代谢流量分
布情况如图 ５所示。
图 ５　 谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２与 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
厌氧代谢流量分布比较
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｆｌｕｘ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ
Ｃ􀆰 ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ ＡＴＣＣ１３０３２ ａｎｄ ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
从图 ５可以看出：乳酸脱氢酶基因的敲除对谷氨
酸棒状杆菌的代谢流有很大影响，流向乳酸的代谢流
变为 ０，流向丁二酸的代谢流大幅提高，乳酸脱氢酶
基因敲除导致 ＰＥＰ 生成丁二酸的代谢流增加了
０１ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２１４􀆰 ３％。 ＰＥＰ 和 Ｐｙｒ 是代谢流中的关键节点，磷酸
烯醇式丙酮酸羧化酶将 ＰＥＰ 转化为丁二酸，流向丙
酮酸的代谢流转化为乙酸。 乳酸脱氢酶基因敲除导
致流向乳酸的代谢流为 ０，经过酶活测定谷氨酸棒状
杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ的乳酸脱氢酶活性为 ０（数据未
显示），说明谷氨酸棒状杆菌在厌氧条件下没有其他
的途径产生乳酸，乳酸脱氢酶没有其他的同工酶。
２􀆰 ６　 分批发酵实验结果
通过实验对谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
厌氧转化过程进行分析，添加 ９０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖的发酵
液，干菌体质量浓度 ４０ ｇ ／ Ｌ，温度 ３３ ℃，５００ ｍＬ 厌
氧瓶装液 １００ ｍＬ，转化过程中取样分析葡萄糖和有
机酸浓度变化，结果如图 ６所示。 由图 ６可知：经过
３６ ｈ的厌氧转化，丁二酸质量浓度 ４１􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，转化率
达到 ４５􀆰 ０％，产酸速率 １􀆰 １４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），较原始菌株
有大幅提高。
图 ６　 谷氨酸棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ
厌氧分批转化过程曲线
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｂａｔｃｈ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｎｄｅｒ ｏｘｙｇｅｎ ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
３　 结　 论
谷氨酸棒状杆菌厌氧转化葡萄糖产丁二酸过程
中，补加 ＮａＨＣＯ３，丁二酸的产量最高。 ＮａＨＣＯ３不仅
影响葡萄糖转化速率和丁二酸生成速率，而且影响丁
二酸与乙酸生成的摩尔比。 最佳转化温度是 ３３ ℃。
乳酸脱氢酶基因敲除对谷氨酸棒状杆菌代谢流分布
有很大影响，流向丁二酸的代谢流提高了 ２１４􀆰 ３％，
流向乳酸的代谢流为 ０。 在以上条件控制下谷氨酸
棒状杆菌 ＡＴＣＣ１３０３２Δｌｄｈ分批转化 ３６ ｈ，产丁二酸
４１􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，转化率 ４５􀆰 ０％，较原始菌株有很大提高。
参考文献：
［ １ ］ 　 詹晓北，朱一晖，Ｗａｎｇ Ｄｏｎｇｈａｉ．琥珀酸发酵生产工艺及其产
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（责任编辑　 管　 珺）
１１　 第 ３期 贾全栋等：谷氨酸棒状杆菌厌氧产丁二酸的发酵条件