全 文 ：第７卷第６期
２００９年１１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．６
Ｎｏｖ．２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０６．０１４
收稿日期：２００９－０３－１１
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００６ＡＡ０２Ｚ２０２）；江苏省自然科学基金资助项目（ＢＫ２００６１７８）
作者简介：何小丹（１９８３—），女，江苏镇江人，硕士研究生，研究方向：生物化工；何冰芳（联系人），教授，博士生导师，Ｅｍａｉｌ：ｂｉｎｇｆａｎｇｈｅ＠ｎｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
地衣芽孢杆菌 ＹＰ１Ａ耐有机溶剂蛋白酶
基因的克隆与功能表达
何小丹，李 霜，孙蓓蓓，何冰芳
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 ２１０００９）
摘 要：根据Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ来源的碱性蛋白酶具有的高强度耐有机溶剂性能及相关数据库分析，采用ＰＣＲ
克隆ＢｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ耐有机溶剂碱性蛋白酶基因，序列分析显示该基因（１２６４ｂｐ）包含启动子与编码３８０个
氨基酸的开放阅读框（ＯＲＦ），ＯＲＦ包括信号肽、前肽及编码２５４个氨基酸的成熟肽序列。相关基因分析表明，
ＹＰ１Ａ耐有机溶剂碱性蛋白酶基因与地衣芽孢杆菌 ＡＴＣＣ１４５８０的碱性蛋白酶基因仅有６个氨基酸残基差异。构
建２种含ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶ＣＤＳ的组成型穿梭表达载体ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ与ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３，前者采用ＹＰ１Ａ蛋白酶自带的
启动子，后者则采用来自于质粒ｐＰ４３ＮＭＫ的Ｐ４３强启动子。利用这２种表达载体在枯草芽孢杆菌ＷＢ８００中成功
进行蛋白酶的功能表达，其中Ｐ４３强启动子的表达能力明显优于碱性蛋白酶自带的启动子，表达的蛋白酶比酶活
为３９５Ｕ／ｍＬ。重组菌表达的碱性蛋白酶在体积分数５０％的亲水及疏水有机溶剂中表现出了很好的耐受性，验证
了克隆基因为地衣芽孢杆菌ＹＰ１Ａ的高强度耐有机溶剂碱性蛋白酶基因。
关键词：地衣芽孢杆菌ＹＰ１Ａ；耐有机溶剂蛋白酶；克隆；表达
中图分类号：Ｑ８１２；Ｑ７８ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０６－００６７－０７
Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｔｏｌｅｒａｎｔｐｒｏｔｅａｓｅ
ｆｒｏｍＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ
ＨＥＸｉａｏｄａｎ，ＬＩＳｈｕａｎｇ，ＳＵＮＢｅｉｂｅｉ，ＨＥＢｉｎｇｆａｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＮａｎｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓｅｃｒｅｔｅｄｂｙＢ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａｓｈｏｗｅｄｈｉｇｈｔｏｌｅｒａｎｃｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｔｏ
ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅａｓｅａｎｄｔｈｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｏｆｔｙｐｉｃａｌ
ｓｔｒａｉｎＡＴＣＣ１４５８０ｉｎＧｅｎｅＢａｎｋ，ｔｈｅａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ（ＡＰＲ）ｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｉｔｓｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｗｅｒｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｄ．ＳｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｔｈｅＡＰＲｇｅｎｅｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆ１２６４ｂｐｔｈａｔｅｎｃｏｄｅｄｉｔｓｐｒｏｍｏｔｅｒ
ａｎｄａｎＯＲＦｏｆ３８０ａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓ．ＴｈｅＯＲＦｃｏｎｔａｉｎｅｄｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ，ｐｒｅｃｕｒｓｏｒａｎｄｍａｔｕｒｅｐｅｐ
ｔｉｄｅｏｆ２５４ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．Ｔｈｅｒｅａｒｅ６ｍｕｔａｔｉｏｎｓｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｒｅｓｉｄｕｅｓｂｅｔｗｅｅｎａｐｒＹＰａｎｄｋｅｒＡｆｒｏｍＢ．ｌｉ
ｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ１４５８０．ＴｈｅｐｌａｓｍｉｄｓｐＨＹ／ａｐｒＹＰａｎｄｐＨＹ／ａｐｒＰ４３ｃａｒｙｉｎｇａｐｒＹＰｗｉｔｈａｐｒＹＰｕｐ
ｓｔｒｅａｍｐｒｏｍｏｔｅｒａｎｄｗｉｔｈＰ４３ｐｒｏｍｏｔｅｒｆｒｏｍｔｈｅｖｅｃｔｏｒｏｆｐＰ４３ＮＭＫｗｅｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｔｒａｎｓｄｕｃｅｄｉｎｔｏ
Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓＷＢ８００，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅａｃｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｐｒＹＰｉｎｔｈｅｓｅｔｗｏｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ．
ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＷＢ８００ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３ｗｉｔｈＰ４３ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｈｏｗｅｄａｒｅｌａｔｉｖｅｅｆｉｃｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄ
ｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅａｃｈｅｄ３９５Ｕ／ｍＬ．ＴｈｅｐｒｏｔｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｎｃｏｄｉｎｇａｐｒＹＰｗａｓｒｅ
ｍａｒｋａｂｌｙｔｏｌｅｒａｎｔｉｎｓｏｍｅｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃａｎｄｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓａｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆ５０％ （Ｖ／Ｖ）．
ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｔｈａｔｔｈｅｇｅｎｅｏｆＡＰＲｅｎｃｏｄｅｄｔｈｅｐｒｅｖｉｏｕｓｒｅｐｏｒｔｅｄｓｏｌｖｅｎｔｓｔａｂｌｅａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｏｆ
Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ；ｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｔｏｌｅｒａｎｔｐｒｏｔｅａｓｅ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
非水相酶催化有众多优点［１－２］，耐有机溶剂酶
类的独特性能越来越引起国内外研究者的高度
重视［３－７］。
１９９５年Ｏｇｉｎｏ等［８］首次报道了１株耐有机溶剂蛋
白酶产生菌Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＳＴ ０１，随后的研究阐明了
该蛋白酶的基因及耐有机溶剂的结构基础［９－１１］。地衣
芽孢杆菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ产耐有机溶剂蛋白酶的报道
则很少，Ｓａｒｅｅｎ等［１２］从突变的地衣芽孢杆菌中筛选到
１株能分泌耐有机溶剂蛋白酶的菌株ＲＳＰ ０９ ３７，利
用所产的粗蛋白酶在体积分数９０％乙腈的溶剂中合成
了京都肽前体，产率达９３％；随后报道的纯化蛋白酶的
相对分子质量为５５×１０４，该酶在己烷及异辛烷中保
持了较高的转酯催化活力，而在乙腈等亲水性溶剂中
仅有微弱的活性［１３］。
笔者所在实验室自行筛选出１株耐有机溶剂的
地衣芽孢杆菌 ＹＰ１Ａ，所产胞外蛋白酶显示了对高
浓度亲水及疏水有机溶剂的高度耐受性以及极端
的耐碱性［１４］，耐有机溶剂蛋白酶纯酶的亚基相对分
子质量约２８×１０４［１５］，本文克隆 Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ的
耐有机溶剂蛋白酶基因，分析氨基酸序列的同源
性，并在枯草芽孢杆菌中进行功能表达与耐有机溶
剂性能验证。
１ 材料与方法
１１ 菌株与质粒
耐有机溶剂蛋白酶产生菌Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ
自行筛选并寄存于中国典型菌种保藏中心（保藏登记
号为ＣＣＴＣＣＮＯ：Ｍ２０７０２１）［１６］；载体ｐＨＹ３００（穿梭克隆
载体）与克隆宿主ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＨ ５α由笔者所在
实验室保存，质粒ｐＰ４３ＮＭＫ（含Ｐ４３启动子）和枯草芽
孢杆菌宿主 ＷＢ８００（ｎｐｒＥ，ａｒｐＡ，ｅｐｒ，ｂｐｆ，ｍｐｒ，ｎｐｒＢ，
Ｃｍｒ）由南京农业大学李顺鹏教授惠赠。
１２ 培养基及培养条件
Ｓｕｐｅｒｉｃｈ改善培养基：在 Ｓｕｐｅｒｉｃｈ培养基［１７］
中，添加００１％（质量分数，下同）ＭｎＳＯ４与１％酪蛋
白水解物；ＬＢ培养基［１８］；ＬＢ牛奶平板：在ＬＢ培养基
中添加质量分数１％的脱脂奶粉与质量分数１５％的
琼脂。抗生素添加量：氨苄青霉素终质量浓度为１００
μｇ／ｍＬ，四环素终质量浓度为２０μｇ／ｍＬ；培养基均在
１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ，１％脱脂奶粉溶液在１１５℃下灭
菌２０ｍｉｎ，抗生素采用过滤灭菌。采用摇瓶间歇培
养，培养温度为３７℃，转速为１８０ｒ／ｍｉｎ。
１３ 主要试剂
ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶、限制性内切酶ＢｇｌⅡ、ＢａｍＨⅠ、
Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＤＮＡＭａｒｋｅｒ、Ｔ载体（ｐＭＤ１８ ＴＳｉｍ
ｐｌｅＶｅｃｔｏｒ）、胶回收试剂盒购于宝生物工程有限公司
（ＴａＫａＲａ）；质粒提取试剂盒购于上海博彩生物技术有
限公司；ＰＣＲ引物由上海英俊生物技术有限公司合成；
其余试剂和药品均为进口或国产分析纯。
１４ 分子操作
基因组的提取、大肠杆菌感受态细胞的制备和
转化均参照实验指南［１８］；枯草芽孢杆菌感受态的制
备按照文献［１９］报道的方法；质粒提取与酶切均按
试剂盒上的要求操作。
１５ 目标蛋白酶基因的扩增
姚忠等［１５］研究表明ＢｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ耐有
机溶剂碱性蛋白酶为胞外酶，其亚基相对分子质量
为２７×１０４～２８×１０４，根据 ＧｅｎＢａｎｋ数据库中已
公布的Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ１４５８０菌株的全基因组
序列，检索蛋白酶相关基因，去除胞内蛋白酶、ＡＴＰ
依赖蛋白酶以及膜金属蛋白酶后尚有６条编码胞外
蛋白酶的基因，其中成熟蛋白酶相对分子质量低于
３０×１０４的对应基因仅有碱性蛋白酶基因 ｋｅｒＡ
（ＧｅｎｅＢａｎｋ号：ＹＰ＿０７８３０７１），除耐有机溶剂性能
未见报道外，该蛋白酶具有高度的耐碱性等性质与
笔者所在实验室研究的ＹＰ１Ａ蛋白酶相似。根据该
碱性蛋白酶（ａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ，简称 ＡＰＲ）的含启动
子区域的全序列设计引物，Ｆ：５′ＧＣＡＧＡＴＣＴＴＴＧ
ＧＣＣＧＴＴＣＡＡＡＡＡＡＡＴＧＧＧＴ３′，下划线部分为引入
的 ＢｇｌⅡ酶切位点；Ｒ：５′ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＧＡＧＣＧ
ＧＣＡＧＣＴＴＣＧ３′，下划线部分为引入的ＢａｍＨⅠ酶切
位点。以菌株 ＢｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ的总 ＤＮＡ为模
板，采用 ＬＡＴａｑＤＮＡ聚合酶进行 ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ
产物回收后克隆到 ｐＭＤ１８ ＴＳｉｍｐｌｅ载体上，获得
质粒ｐＭＤ１８ Ｔ／ａｐｒＹＰ并导入ＥｃｏｌｉＤＨ ５α。取３
个阳性重组子所提质粒ｐＭＤ１８ Ｔ／ａｐｒＹＰ送上海英
８６ 生 物 加 工 过 程 第７卷
俊生物技术有限公司测序。
１６ 重组菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ及 ＷＢ８００
ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３的构建
１６１ 利用天然耐有机溶剂蛋白酶启动子构建表
达载体ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ
用限制性内切酶 ＢｇｌⅡ与 ＢａｍＨＩ酶切质粒
ｐＭＤ１８ Ｔ／ａｐｒＹＰ，并与相同酶切的 ｐＨＹ３００质粒连
接，质粒构建具体过程如图１（ａ）所示。产物导入到
枯草芽孢杆菌 ＷＢ８００感受态中，并涂布于含
２０μｇ／ｍＬ四环素的 ＬＢ牛奶平板上，挑取有透明圈
的转化子。提取质粒 ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ并进行酶切验证
阳性克隆。
图１ 重组质粒ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ和ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３的构建
Ｆｉｇ．１ ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｓｐＨＹ／ａｐｒＹＰａｎｄｐＨＹ／ａｐｒＰ４３
１６２ 利用枯草杆菌强启动子 Ｐ４３构建蛋白酶表
达载体ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３
根据 Ｂｓｕｂｔｉｌｉｓ１６８中 Ｐ４３启动子的基因序列
（ＧｅｎＢａｎｋ号为Ｋ０２１７４），设计引物Ｆ１：５′ＧＣＡＧＡＴ
ＣＴＴＧＡＴＡＧＧＴＧＧＴＡＴＧＴＴＴＴＣＧＣＴ３′；Ｒ１：５′ＣＴＣＴ
ＴＴＴＴＣＣＴＣＡＴＣＡＴＧＴＧＴＡＣＡＴＴＣＣＴＣ３′，下划线部分
为引入的ＢｇｌⅡ酶切位点，以载体ｐＰ４３ＮＭＫ为模板扩
增Ｐ４３启动子基因；根据地衣芽孢杆菌ａｐｒＹＰ全编码
区（ＣＤＳ区）的序列，设计引物Ｆ２：５′ＧＡＧＡＧＧＡＡＴＧ
ＴＡＣＡＣＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＡＡＡＡＧ３′；Ｒ２：５′ＣＧＧＡＴＣＣＴ
ＴＡＴＴＧＡＧＣＧＧＣＡＧＣＴＴＣ３′，下划线部分为引入Ｂａｍ
ＨＩ酶切位点，以质粒ｐＭＤ１８ Ｔ／ａｐｒＹＰ为模板扩增
该碱性蛋白酶基因的 ＣＤＳ区域。通过 ｏｖｅｒｌａｐＰＣＲ
连接Ｐ４３启动子与碱性蛋白酶ＣＤＳ区域。产物纯化
后，用限制性内切酶ＢｇｌⅡ与ＢａｍＨＩ酶切，并与同样
酶切的ｐＨＹ３００质粒连接，载体构建示意图如图１（ｂ）
所示。连接液导入到枯草芽孢杆菌 ＷＢ８００感受态
中，在含２０μｇ／ｍＬ四环素的ＬＢ牛奶平板上，挑取有
透明圈的转化子。提取质粒 ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３送上海英
俊生物技术有限公司测序。
１７ 碱性蛋白酶基因在重组菌中的表达
将重组菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ、ＷＢ８００
ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３与对照菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ３００分别接入
ＬＢ培养基（含四环素 ２０μｇ／ｍＬ）中培养过夜，次
日以２％接种量接入 Ｓｕｐｅｒｒｉｃｈ改善培养基（含四
环素２０μｇ／ｍＬ），于３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ条件下发酵
培养，每隔１２ｈ取样一次，测定菌体生长 ＯＤ６６０及
上清液中的蛋白酶酶活。酶活测定按 Ｔａｎｇ等［２０］
报道的方法，反应体系采用ｐＨ１０的００５ｍｏｌ／Ｌ的
Ｇｌｙ ＮａＯＨ缓冲液。蛋白酶酶活定义：在 ４０℃，
每分钟催化酪蛋白水解生成１μｇ酪氨酸所需要的
酶量为１Ｕ。
１８ ＳＤＳ ＰＡＧＥ检测表达产物
将发酵液上清液用截留相对分子质量为１０４的
超滤管离心浓缩（约 ５倍）后的试样，进行 １２５％
的ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳分析。
９６ 第６期 何小丹等：地衣芽孢杆菌ＹＰ１Ａ耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达
１９ 有机溶剂对重组菌表达蛋白酶的影响
重组菌发酵液上清液作为表达蛋白酶酶液，加
入等体积有机溶剂，体积分数为５０％，于３７℃、１８０
ｒ／ｍｉｎ振荡１ｈ后测量残留蛋白酶活力。选择前期
研究天然ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶所用的典型溶剂。其中
亲水有机溶剂选择了ＤＭＦ和ＤＭＳＯ，对照组为加入
体积分数５０％缓冲液的酶液；疏水有机溶剂选用癸
烷和正辛烷，酶活测定时取水相，以无溶液添加的
发酵上清液为对照。
２ 结果与讨论
２１ 目的蛋白酶基因的克隆
按照１５介绍的方法扩增ＢｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓＹＰ１Ａ
碱性蛋白酶的基因，ＰＣＲ产物的电泳图谱如图２中
的１泳道所示，由图２可以看出在约１３００ｂｐ处有
明显条带，与推测的目的基因大小一致。将纯化的
ＰＣＲ产物连接到ｐＭＤ １８ＳｉｍｐｌｅＴ载体，阳性克隆
测序结果表明扩增序列共有１２６４ｂｐ，有１个１１４０
ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），将该基因序列提交 Ｇｅｎ
Ｂａｎｋ，登录号为 ＥＵ０９０９０８１。该基因含有启动子、
信号肽、前肽和成熟肽序列，成熟肽由７６５ｂｐ编码
２５４个氨基酸构成，该蛋白酶基因编码序列的功能
示意图见图３。
１—ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ；Ｍ—ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００
图２ ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶基因ＰＣＲ克隆产物
Ｆｉｇ．２ ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｏｆＹＰ１Ａａｌｋａｌｉｎｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ
通过 Ｂｌａｓｔ检索，该蛋白酶基因与 Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓＡＴＣＣ１４５８０菌株的碱性蛋白酶基因ｋｅｒＡ核苷酸
序列同源性为９６４％，氨基酸同源性为９８４％；与
其他芽孢杆菌的碱性蛋白酶同源性较低，仅在６５％
图３ ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶编码序列的功能
Ｆｉｇ．３ ＦｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅＹＰ１Ａａｌｋａｌｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ
ｃｏｄｉｎｇｓｅｑｕｅｎｃｅ
左右，如图 ４所示。与 ＡＴＣＣ１４５８０碱性蛋白酶相
比，ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶序列中有６个氨基酸残基发
生了变化，其中Ｇｌｕ８５→Ｌｙｓ８５、Ｉｌｅ１１３→Ｖａｌ１１３变化发生
在前肽序列，成熟蛋白酶的氨基酸残基变化共有４
处：Ｔｙｒ１２６→Ｐｈｅ１２６、Ａｓｎ１９１→Ｓｅｒ１９１、Ｐｒｏ２３３→Ａｌａ２３３、
Ｓｅｒ３１６→Ａｓｎ３１６，在图４中以小框表示，其中 Ａｓｎ１９１→
Ｓｅｒ１９１、Ｐｒｏ２３３→Ａｌａ２３３在保守序列附近。
２２ 重组菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ及 ＷＢ８００
ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３的构建和鉴定
按照１６１的方法构建重组菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ／
ａｐｒＹＰ，将重组菌涂布在含有四环素的牛奶 ＬＢ平板
上，培养 ２４ｈ后出现较小的水解圈。提取质粒
ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ，双酶切产物电泳图如５所示。在１３００
ｂｐ左右有明显条带，说明目的基因已经成功插入到
载体ｐＨＹ３００中。
按照１６２的方法构建重组子 ＷＢ８００ ｐＨＹ／
ａｐｒＰ４３。重组质粒 ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３经上海英俊生物技
术有限公司测序，验证插入的外源基因 Ｐ４３启动子
与ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶 ＣＤＳ区基因的连接，与设计序
列一致。
２３ 碱性蛋白酶基因在重组菌中的表达
以枯草芽孢杆菌为宿主的重组菌 ＷＢ８００
ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ、ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３在 ＬＢ牛奶平板
上均能进行蛋白酶分泌表达，如图６所示，（ａ）为带
有天然 ＹＰ１Ａ碱性蛋白酶启动子的重组子，１２ｈ培
养后有微弱的透明圈；（ｂ）为带有空质粒的对照，因
宿主敲除了多种蛋白酶基因，在平板上无透明圈显
示；（ｃ）为带有强启动子 Ｐ４３的碱性蛋白酶重组子，
在１２ｈ培养后有显著的透明圈。表明采用强启动
子Ｐ４３的重组子在牛奶ＬＢ平板上表达效率显著高
于采用天然启动子重组子的表达。
０７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图４ ＹＰ１Ａ蛋白酶与其他碱性蛋白酶氨基酸序列的比对
Ｆｉｇ．４ ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔｏｆＹＰ１Ａｐｒｏｔｅａｓｅａｎｄｏｔｈｅｒａｌｋａｌｉｎｅｐｒｅｏｔａｓｅｓ
１—ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ（ＢｇｌⅡ＋ＢａｍＨⅠ）；Ｍ—ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２０００
图５ 质粒ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ酶切图
Ｆｉｇ．５ ＤｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｏｌａｓｍｉｄｐＨＹ／ａｐｒＹＰ
图６ 重组质粒重组菌在ＬＢ牛奶平板上的水解透明圈
Ｆｉｇ．６ ＨｙｄｒｏｌｙｚｅｄｚｏｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓｉｎｃｕｂａｔｅｄｏｎｔｈｅＬＢｍｉｌｋｐｌａｔｅ
重组菌ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ与 ＷＢ８００ ｐＨＹ／
ａｐｒＰ４３经发酵培养后，上清液中蛋白酶活力以及菌
体生长曲线见图７，而对照菌ＷＢ８００ ｐＨＹ３００经同
样条件发酵培养后，无蛋白酶酶活。由图７可知：２
个重组菌在菌体生长后期，酶活逐渐上升，并都在
１４０ｈ左右达到最高，其中 ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ最
高比酶活达到９０Ｕ／ｍＬ，表明 ＹＰ１Ａ的天然碱性蛋
白酶所带启动子是一个相对较弱的启动子。
ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３最高比酶活达到 ３９５Ｕ／ｍＬ，
由于Ｐ４３是组成型重叠启动子，它具有双重识别特
性，在对数生长期时就起始表达，并在稳定期后期
１７ 第６期 何小丹等：地衣芽孢杆菌ＹＰ１Ａ耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达
能达到较高的表达效率［２１］，表达蛋白酶活性为重组
菌ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ的４４倍，但因蛋白酶的早
期表达影响了菌体的生长，菌体生长量低。后续研
究可考虑严谨型启动子以控制生长与蛋白酶表达
之间的矛盾。
图７ 重组菌蛋白酶酶活及ＯＤ６６０随时间变化曲线
Ｆｉｇ．７ Ｃｅｌｇｒｏｗｔｈａｎｄｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｓ
１—ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｆＷＢ８００ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３；
２—ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｏｆＷＢ８００ｐＨＹ００；Ｍ—ＰｒｏｔｅｉｎＭａｒｋｅｒ
图８ 重组菌表达蛋白的ＳＤＳＰＡＧＥ电泳图谱
Ｆｉｇ．８ ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
２４ ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测表达蛋白
重组菌ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３的发酵液上清浓
缩液的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳结果如图 ８所示，以
ＷＢ８００ ｐＨＹ３００在同样条件下的浓缩试样为对照
（泳道２），ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３发酵液上清浓缩酶
液在２７×１０４～２８×１０４有１个明显的条带（泳道
１），与碱性蛋白酶成熟肽基因对应的相对分子质量
大小一致，说明该碱性蛋白酶基因在枯草杆菌
ＷＢ８００中，能够正确地利用其自身的信号肽将蛋白
酶分泌到胞外，同时剪切掉前肽成为成熟蛋白酶。
表达蛋白酶亚基相对分子质量与前期本研究报道
并纯化的ＹＰ１Ａ耐有机溶剂蛋白酶的亚基相对分子
质量［１５］一致。而对照菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ３００有较多
的胞外蛋白，但无显著相关相对分子质量大小的蛋
白条带，重组菌发酵浓缩液仅呈２７×１０４～２８×
１０４的蛋白主带，可能是表达蛋白酶对其他分泌蛋白
降解所致。
２５ 有机溶剂对表达蛋白酶的影响
在体积分数５０％的有机溶剂体系中培养１ｈ，
剩余蛋白酶酶活如图９所示。图９数据显示该蛋白
酶在所选用的典型亲水与疏水有机溶剂中具有很
好的耐受性，尤其是亲水性有机溶剂 ＤＭＦ与 ＤＭＳＯ
对其蛋白酶活性具有很好的促进作用，而在疏水有
机溶剂癸烷与正辛烷中，该酶也具有较好的耐受
性。其影响趋势与前期研究的ＹＰ１Ａ天然耐有机溶
剂纯蛋白酶的溶剂耐受性一致［１５］。
图９ 重组菌表达蛋白酶在有机溶剂中剩余酶活
Ｆｉｇ．９ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｓｅｖｅｒａｌｏｒｇａｎｉｃｓｏｌｖｅｎｔｓｏｎｔｈｅ
ｐｒｏｔｅａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
３ 结 论
本研究设计引物扩增了ＹＰ１Ａ的胞外碱性蛋白
酶基因，该序列共有１２６４ｂｐ（含１１４０ｂｐ的ＯＲＦ），
含启动子、信号肽、前肽和成熟肽序列。成熟肽含
７６５ｂｐ，编码２５４个氨基酸。通过比对发现该碱性
基因序列与数据库 ＡＴＣＣ１４５８０菌株碱性蛋白酶
ｋｅｒＡ核苷酸序列的同源性最高为９６４％，氨基酸同
源性为９８４％。共有６处氨基酸残基发生变化，其
中 Ｇｌｕ８５→Ｌｙｓ８５、Ｉｌｅ１１３→Ｖａｌ１１３发生在前肽序列，
Ｔｙｒ１２６→ Ｐｈｅ１２６、Ａｓｎ１９１→Ｓｅｒ１９１、Ｐｒｏ２３３→Ａｌａ２３３、Ｓｅｒ３１６→
Ａｓｎ３１６发生在成熟蛋白区。这４个氨基酸残基的变
化是否与耐有机溶剂性能相关还需作进一步研究。
该基因的解析与功能表达为后续的蛋白酶耐有机
溶剂结构的分子机理研究奠定了基础。
对重组菌 ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＰ４３发酵表达的碱
性蛋白酶耐有机溶剂性能的研究表明：该碱性蛋白
２７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
酶在亲水有机溶剂 ＤＭＦ与 ＤＭＳＯ中处理后酶活显
著提高，在疏水有机溶剂癸烷与正辛烷中也具有较
好的耐受性，与本研究室前期研究纯化的耐有机溶
剂碱性蛋白酶性能一致，进一步验证了克隆基因为
前期研究的耐有机溶剂碱性蛋白酶的相应基因。
通过ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ与ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐ
ｒＰ４３这２个重组菌的构建与表达，表明 ＹＰ１Ａ的天
然碱性蛋白酶启动子能够在枯草杆菌体系中启动，
该信号肽也能有效将蛋白酶输送到胞外。同时
ＷＢ８００ ｐＨＹ／ａｐｒＹＰ的表达效率较低，这表明野生
型地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶的启动子是个弱启动
子，可以通过诱变或启动子置换等手段改造原始菌
株ＹＰ１Ａ的产耐有机溶剂碱性蛋白酶性能，为高强
度耐有机溶剂蛋白酶的开发应用提供酶制剂。
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３７ 第６期 何小丹等：地衣芽孢杆菌ＹＰ１Ａ耐有机溶剂蛋白酶基因的克隆与功能表达