全 文 :第 12卷第 6期
2014年 11月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 12 No 6
Nov 2014
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2014 06 004
收稿日期:2013-08-06
基金项目:科技部国际合作项目(2009DFA60890);四川省科技支撑计划(2013GZX0161)
作者简介:刘跃红(1985—),男,江西南昌人,博士研究生,研究方向:发酵工程;张文学(联系人),教授,E⁃mail:foodbitech@ 126 com
白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
刘跃红1,吴正云1,杨 健1,吴艳萍1,袁玉菊1,张文学1,2
(1 四川大学 食品工程系,成都 610065; 2 四川大学 锦江学院 白酒学院,眉山 620860)
摘 要:为有效利用纤维质原料制备可发酵性糖生产燃料酒精,通过 NaOH 过氧乙酸预处理白酒丢糟,经质量分
数 2%NaOH和体积分数 6%过氧乙酸处理后,白酒丢糟中木质素去除率达 66 13% ~ 77 02%,总纤维素回收率
78 04%~90 73%。 对处理后的白酒丢糟进行多酶复配糖化降解,通过均匀设计实验确定白酒丢糟酶降解的数学
模型,得出总糖降解率与各酶添加量之间的回归关系,在最优条件下白酒丢糟降解率为(0 432 8±0 013 5) g / g。
关键词:NaOH 过氧乙酸;白酒丢糟;多酶复配;均匀设计
中图分类号:TQ261 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2014)06-0018-05
Preparing of fermentable sugars from pretreatment Chinese liquor distillers′
grains by using multi⁃enzyme hydrolysis
LIU Yuehong1,WU Zhengyun1,YANG Jian1,WU Yanping1,YUAN Yuju1,ZHANG Wenxue1,2
(1 Department of Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China;
2 College of China Spirits,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan 620860,China)
Abstract:We used NaOH⁃peracetic acid pretreatment of distillers′ waste grains to convert holocellulose to
fermentable sugars for bioethanol production The results show that when the distillers′ grains is pretreated
with a mixture of 2% (m / m) NaOH solution and 6% (V / V) peracetic acid solution,66 13% to 77 02%
lignin was removed and 78 04%⁃90 73% cellulose was recovered The experiment of multienzyme
hydrolysis with multiple factors and multiple levels was designed by the date processing system according
to U8(85) The mathematic model for total sugars degradation rate was acquired and it showed that under
the optimal condition,the total sugars degradation rate was (0 432 8±0 013 5) g / g
Keywords:NaOH⁃peracetic acid;distillers′ grains;multienzyme;uniform design
白酒生产过程中最主要副产物之一的白酒丢糟
不及时处理,会腐败变质,不仅浪费资源,而且严重污
染环境[1]。 白酒丢糟的主要成分为纤维素、半纤维素
和木质素[2], Zhao 等[3-4]用 NaOH 过氧乙酸处理,
再用纤维素酶等相关酶系糖化,得到较好的降解效
果。 Charles等[5]研究发现纤维素经氨水处理后会产
生膨胀现象,造成原料的结晶度降低,从而显著提高
纤维素和半纤维素的反应活性,便于酶水解的进行。
Zhang 等[6]认为碱处理对连接半纤维素和其他组分
分子间的酯键起到皂化作用,膨胀纤维素,脱除木质
素,提高酶解糖化率;赵雪冰等[7]、Teixeira 等[8]利用
过氧乙酸的强氧化性和良好的脱木质素和漂白能力
的特点,通过过氧乙酸与木质素进行羟基化反应等有
效地脱除了木质素类大分子。
目前,国内外对纤维质原料生产燃料酒精的研究
主要集中在不同预处理方法对单酶糖化效果的影响
上,Tabka 等[9]、Kataria 等[10]、Rabelo 等[11]也对多酶
复配做了一定的研究,但是对多酶复合糖化降解运用
于白酒丢糟的研究报道较少。 本文中笔者研究
NaOH 过氧乙酸预处理白酒丢糟,用 4 种不同的酶
复配糖化降解白酒丢糟,以期得到较好的糖化效果。
1 材料和方法
1 1 实验材料
白酒鲜丢糟由四川水井坊股份有限公司提供,
含水率 65%左右,冷冻保存,使用前置于 70 ℃烘箱
干燥至恒质量,烘干后总纤维素质量分数(51 24±
1 7)%,木质素质量分数(18 62±2 1)%;过氧乙酸
体积分数 16%,使用前需滴定浓度[12],购于长征试
剂公司;葡萄糖试剂盒,购于长春汇力生物技术有
限公司;纤维素酶 NS22086 ( FPU 比酶活为 25 47
IU / mL)、β 葡萄糖苷酶 NS22118(比酶活为 15 12
IU / mL)、 木聚糖酶 NS22083 (比酶活为 17 08
IU / mL)、复合酶 NS22119(其中主要的 β 葡萄糖苷
酶比酶活为 6 77 IU / mL),购于诺维信天津分公司。
1 2 实验仪器
UV 1100型紫外分光光度计,上海美谱达仪器
有限公司;HZO X100 型气浴摇床,太仓市豪诚实
验仪器制造有限公司;LX 400型管式离心机,深圳
市赛亚泰科仪器设备有限公司;HWS28 型电热恒温
水浴锅,DHG 905A 型电热恒温鼓风干燥箱,上海
一恒科学仪器有限公司;100 ~ 1 000 μL 百得移液
枪,上海摩亿科贸有限公司。
1 3 实验方法
1 3 1 实验流程
白酒丢糟预处理后多酶糖化降解工艺流程如
图 1所示。 工艺流程中,白酒丢糟干燥均为 70 ℃恒
温至恒质量。
图 1 白酒丢糟降解工艺流程
Fig 1 Flow chart of distillers′ grains degradation experiment
1)鲜丢糟干燥与检测。 从酒厂提取白酒鲜丢
糟置于电热恒温鼓风干燥箱中,70 ℃恒温至恒质量
得干糟,并测定其指标。 2)预处理Ⅰ用 2%NaOH溶
液按固液比 1 ∶ 10(g / mL)添加白酒干丢糟,在 85 ℃
水浴恒温槽中处理 1 5 h。 3)预处理Ⅱ用 6%过氧
乙酸按固液比 1 ∶ 5 ( g / mL)添加白酒干丢糟,在
60 ℃水浴恒温槽中处理 5 h。 4)酶降解用 pH 4 8~
5 0的柠檬酸钠缓冲液调节白酒丢糟百分比,于
50 ℃、150 r / min的气浴摇床处理 48 h。
1 3 2 成分分析
白酒丢糟中纤维素和半纤维素含量分析参照
文献[13],酶解液中总糖、葡萄糖及木糖含量的测
定方法分别采用 3,5 二硝基水杨酸(DNS)法[14]、
葡萄糖试剂盒法和间苯三酚法测定[15]。 酶解液中
总糖、葡萄糖及木糖得率计算见式(1):
Y = 0 9m
m′
× 1 000 (1)
式中:Y为酶解液中总糖、葡萄糖或木糖产率,mg / g;
0 9为修正系数;m为酶解液中还原糖、葡萄糖或木
糖质量,g;m′为白酒丢糟预处理后干质量,g;2 次平
行实验,取其平均值。
1 3 3 木质素的测定
按照国标 GB / T 2677 8—1994 测定白酒丢糟
中木质素的含量。
R =
m0 - m1
m0
× 100% (2)
式中:R为木质素去除率,%;m0为白酒丢糟处理前木
质素质量,g;m1为白酒丢糟处理后木质素质量,g。
91 第 6期 刘跃红等:白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
1 3 4 总纤维素的测定
按照国标 GB / T 2677 10—1995测定白酒丢糟
中总纤维素的含量。
Z =
m4
m3
× 100% (3)
式中:Z为总纤维素回收率,%;m3为白酒丢糟处理
前总纤维质量,g;m4为白酒丢糟处理后总纤维质
量,g。
1 3 5 样品酶降解
白酒丢糟经预处理后用 pH 4 8 ~5 0 的柠檬酸
钠缓冲液调节底物浓度,添加 2%叠氮化钠 1 mL,同
时添加纤维素酶 NS22086、β 葡萄糖苷酶 NS22118、
木聚糖酶 22083 和复合酶 22119,于 50 ℃、 150
r / min的气浴摇床糖化降解 48 h,离心得上清
液[16-17]。 将上清液稀释一定倍数后,测定酶解液中
总糖、葡萄糖和木糖浓度及产率。
2 结果与讨论
2 1 NaOH 过氧乙酸处理白酒丢糟
根据文献[18],称取 100 g 白酒干丢糟于1 000
mL烧杯中,按照图 1所示工艺条件进行白酒丢糟预
处理,该实验进行 3次重复,处理后白酒丢糟中总纤
维素回收率和木质素去除率如表 1所示。 由表 1 可
知:总纤维素回收率为 78 04% ~90 73%,木质素去
除率为 66 13%~77 02%。
表 1 白酒丢糟预处理前后组分变化
Table 1 Different compositions of distillers′ grains
before and after the pretreatment
组分
w(组分) / %
白酒丢糟
处理前
白酒丢糟
处理后
回收率 / %
总纤维素a 56 27±2 1 47 35±1 8 78 04~90 73
纤维素 33 03±1 7 29 80±1 0 83 16~98 31
半纤维素 18 21±1 4 13 66±0 8 65 58~86 02
木质素 18 61±1 1 5 23±0 7 22 98~33 87b
水分 6 49±0 5
灰分 12 61±0 7
注:a—文献[19]的数据; b—木质素去除率= 100%-回收率。
2 2 预处理后白酒丢糟酶降解
2 2 1 均匀实验设计
通过比较前期实验结果[18] 及查阅相关文
献[20],总结 5个影响白酒丢糟复合酶糖化降解的因
素 X1、 X2、 X3、 X4、 X5。 ① X1:白酒丢糟百分比
(g / 100 mL);②X2:纤维素酶 NS211086 体积(mL);
③X3:β 葡萄糖苷酶 NS22118 体积(mL);④X4:木
聚糖酶 NS22083 体积(mL);⑤X5:复合酶 NS22119
体积(mL)。 以总糖降解率为考察指标,用 DPS(date
processing system)数据处理系统[21]设计 U8(85)均匀
设计表,设计方案结果见表 2。 根据表 2实验方案,分
别在 4、11、23、33、48 h 测定酶解液中的总糖、葡萄糖
和木糖浓度。 结果如图 2~图 4所示。
表 2 U8(85)均匀设计方案
Table 2 The experimental table of uniform design
实验水平
因素
X1 X2 X3 X4 X5
总糖降解率
Y / (g·g-1)
N1 1(12) 5(1 8) 4(0 65) 6(0 12) 8(0 8) 0 301
N2 4(15) 1(0 2) 3(0 45) 7(0 14) 2(0 2) 0 274
N3 3(14) 8(3 0) 2(0 25) 2(0 04) 4(0 4) 0 400
N4 6(17) 7(2 6) 7(1 25) 8(0 16) 5(0 5) 0 297
N5 2(13) 3(1 0) 8(1 45) 4(0 08) 3(0 3) 0 397
N6 7(18) 6(2 2) 5(0 85) 3(0 06) 1(0 1) 0 328
N7 5(16) 2(0 6) 6(1 05) 1(0 02) 7(0 7) 0 196
N8 8(19) 4(1 4) 1(0 05) 5(0 10) 6(0 6) 0 277
由图 2~图 4可以看出:酶解液中糖浓度随着酶
解时间的延长而增加。 在开始 4 h 内,酶解速率较
高,随后酶解液中葡萄糖浓度逐渐增大,葡萄糖浓
度的升高会延缓酶降解速率,在 11 ~ 23 h 内酶解速
02 生 物 加 工 过 程 第 12卷
率降低,糖浓度增加缓慢;当 33 h 时,酶解液中糖浓
度达到最高,之后糖浓度不再增加或增加很少,主
要是因为溶液中葡萄糖浓度的增大影响了酶的活
性,使得酶解速率降低直至停止。 在后续实验中,
用复配酶处理白酒丢糟 33 h,对各酶添加量进行均
匀实验设计优化,总糖降解率见表 2。 由表 2 可以
得出,总糖降解率最高为 0 4 g / g,为第 3组实验,该
组实验中,底物浓度和纤维素酶 NS22086 为主要影
响总糖降解率的因素。
图 2 酶解液中总糖浓度随时间的变化
Fig 2 Changes of total sugar over time
in the enzyme solution
图 3 酶解液中葡萄糖浓度随时间的变化
Fig 3 Changes of glucose over time
in the enzyme solution
2 2 2 回归方程的建立和分析
通过均匀设计和 DPS数据处理系统分析,根据
各因素对酶降解白酒丢糟总糖降解率的影响显著
程度进行多元二次回归,所得多元二次回归方程:
Y = 0 382 16 - 0 009 301X1 + 2 417 79X4 +
0 016 528X23-15 506 63X24-0 285 46X25+0 099 31X2X5
复相关系数 R= 0 998 6,F值为 58 125 8,显著
水平 P值为 0 007 8,剩余标准差为 0 009 5,复相关
系数 R和 F值越大。 剩余标准差越小,说明数据和
方程的拟合度越高。 从回归方程可以得出,X2与 X5
之间存在相互作用,X2、X3和 X4对酶解的作用明显,
图 4 酶解液中木糖浓度随时间变化
Fig 4 Changes of xylose over time
in the enzyme solution
因为 X2(纤维素酶 NS211086)的主要组分是葡萄糖
内切酶、葡萄糖外切酶和 β 葡萄糖苷酶。 只有当这
3 个主要组分的活性比例适当时,才能协同完成对
纤维素的高效降解[22-23]。 如果再添加因素 3(β 葡
萄糖苷酶 NS22118),会显著提高纤维素酶糖化效
率[24]。 同时半纤维素被木聚糖酶水解后,可降低物
料对纤维素酶的无效吸附,提高单糖产率[25]。 根据
回归方程,由 DPS得出最佳复配酶降解白酒丢糟组
合,见表 3。
表 3 总糖降解率最高时各个因素组合
Table 3 Combination of factors at high rate of total sugar
Y X1 X2 X3 X4 X5
0 464 8 12 000 0 2 965 5 1 303 9 0 078 4 0 633 1
2 2 3 验证实验
根据 DPS数据处理系统的分析及预测,总糖降
解率最高时,白酒丢糟百分比 0 12 g / mL,纤维素酶
NS211086 添加量 2 965 5 mL, β 葡萄糖苷酶
NS22118添加量 1 303 9 mL,木聚糖酶 NS22083 添
加量 0 078 4 mL,复合酶 NS22119 添加量 0 633 1
mL。 由回归方程计算出总糖理论最大得率为
0 464 8 g / g,在此实验条件下进行 3次重复实验,得
到总糖的实际得率为(0 432 8±0 013 5) g / g,低于
理论值,但明显高于前述各实验条件下得出的实验
数值。
3 结 论
1)用质量分数 2%NaOH溶液和体积分数 6%过
氧乙酸溶液相结合的方法对白酒丢糟进行预处理,
白酒丢糟中木质素去除率达到 66 13% ~ 77 02%,
总纤维回收率为 78 04% ~ 90 73%左右,木质素的
12 第 6期 刘跃红等:白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
脱除有利于下一步酶的糖化降解。
2)对白酒丢糟复配酶降解首次采用 DPS 数据
处理系统设计均匀试验并分析数据,通过回归分析
得出影响总糖降解得率的各因素之间存在一定的
相互作用。 根据本研究的前期实验选定主要影响
白酒丢糟总糖降解率的因素及各因素的取值范围,
由回归方程计算出总糖理论最大得率为 0 464 8
g / g,经过验证实验,得出总糖实际得率为(0 432 8±
0 013 5) g / g,与理论值接近。
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(责任编辑 管 珺)
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