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Preparing of fermentable sugars from pretreatment Chinese liquor distillers’ grains by using multi-enzyme hydrolysis

白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖



全 文 :第 12卷第 6期
2014年 11月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 12 No􀆰 6
Nov􀆰 2014
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2014􀆰 06􀆰 004
收稿日期:2013-08-06
基金项目:科技部国际合作项目(2009DFA60890);四川省科技支撑计划(2013GZX0161)
作者简介:刘跃红(1985—),男,江西南昌人,博士研究生,研究方向:发酵工程;张文学(联系人),教授,E⁃mail:foodbitech@ 126􀆰 com
白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
刘跃红1,吴正云1,杨 健1,吴艳萍1,袁玉菊1,张文学1,2
(1􀆰 四川大学 食品工程系,成都 610065; 2􀆰 四川大学 锦江学院 白酒学院,眉山 620860)
摘  要:为有效利用纤维质原料制备可发酵性糖生产燃料酒精,通过 NaOH 过氧乙酸预处理白酒丢糟,经质量分
数 2%NaOH和体积分数 6%过氧乙酸处理后,白酒丢糟中木质素去除率达 66􀆰 13% ~ 77􀆰 02%,总纤维素回收率
78􀆰 04%~90􀆰 73%。 对处理后的白酒丢糟进行多酶复配糖化降解,通过均匀设计实验确定白酒丢糟酶降解的数学
模型,得出总糖降解率与各酶添加量之间的回归关系,在最优条件下白酒丢糟降解率为(0􀆰 432 8±0􀆰 013 5) g / g。
关键词:NaOH 过氧乙酸;白酒丢糟;多酶复配;均匀设计
中图分类号:TQ261        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2014)06-0018-05
Preparing of fermentable sugars from pretreatment Chinese liquor distillers′
grains by using multi⁃enzyme hydrolysis
LIU Yuehong1,WU Zhengyun1,YANG Jian1,WU Yanping1,YUAN Yuju1,ZHANG Wenxue1,2
(1􀆰 Department of Food Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China;
2􀆰 College of China Spirits,Jinjiang College,Sichuan University,Meishan 620860,China)
Abstract:We used NaOH⁃peracetic acid pretreatment of distillers′ waste grains to convert holocellulose to
fermentable sugars for bioethanol production􀆰 The results show that when the distillers′ grains is pretreated
with a mixture of 2% (m / m) NaOH solution and 6% (V / V) peracetic acid solution,66􀆰 13% to 77􀆰 02%
lignin was removed and 78􀆰 04%⁃90􀆰 73% cellulose was recovered􀆰 The experiment of multienzyme
hydrolysis with multiple factors and multiple levels was designed by the date processing system according
to U8(85)􀆰 The mathematic model for total sugars degradation rate was acquired and it showed that under
the optimal condition,the total sugars degradation rate was (0􀆰 432 8±0􀆰 013 5) g / g􀆰
Keywords:NaOH⁃peracetic acid;distillers′ grains;multienzyme;uniform design
    白酒生产过程中最主要副产物之一的白酒丢糟
不及时处理,会腐败变质,不仅浪费资源,而且严重污
染环境[1]。 白酒丢糟的主要成分为纤维素、半纤维素
和木质素[2], Zhao 等[3-4]用 NaOH 过氧乙酸处理,
再用纤维素酶等相关酶系糖化,得到较好的降解效
果。 Charles等[5]研究发现纤维素经氨水处理后会产
生膨胀现象,造成原料的结晶度降低,从而显著提高
纤维素和半纤维素的反应活性,便于酶水解的进行。
Zhang 等[6]认为碱处理对连接半纤维素和其他组分
分子间的酯键起到皂化作用,膨胀纤维素,脱除木质
素,提高酶解糖化率;赵雪冰等[7]、Teixeira 等[8]利用
过氧乙酸的强氧化性和良好的脱木质素和漂白能力
的特点,通过过氧乙酸与木质素进行羟基化反应等有
效地脱除了木质素类大分子。
目前,国内外对纤维质原料生产燃料酒精的研究
主要集中在不同预处理方法对单酶糖化效果的影响
上,Tabka 等[9]、Kataria 等[10]、Rabelo 等[11]也对多酶
复配做了一定的研究,但是对多酶复合糖化降解运用
于白酒丢糟的研究报道较少。 本文中笔者研究
NaOH 过氧乙酸预处理白酒丢糟,用 4 种不同的酶
复配糖化降解白酒丢糟,以期得到较好的糖化效果。
1  材料和方法
1􀆰 1  实验材料
白酒鲜丢糟由四川水井坊股份有限公司提供,
含水率 65%左右,冷冻保存,使用前置于 70 ℃烘箱
干燥至恒质量,烘干后总纤维素质量分数(51􀆰 24±
1􀆰 7)%,木质素质量分数(18􀆰 62±2􀆰 1)%;过氧乙酸
体积分数 16%,使用前需滴定浓度[12],购于长征试
剂公司;葡萄糖试剂盒,购于长春汇力生物技术有
限公司;纤维素酶 NS22086 ( FPU 比酶活为 25􀆰 47
IU / mL)、β 葡萄糖苷酶 NS22118(比酶活为 15􀆰 12
IU / mL)、 木聚糖酶 NS22083 (比酶活为 17􀆰 08
IU / mL)、复合酶 NS22119(其中主要的 β 葡萄糖苷
酶比酶活为 6􀆰 77 IU / mL),购于诺维信天津分公司。
1􀆰 2  实验仪器
UV 1100型紫外分光光度计,上海美谱达仪器
有限公司;HZO X100 型气浴摇床,太仓市豪诚实
验仪器制造有限公司;LX 400型管式离心机,深圳
市赛亚泰科仪器设备有限公司;HWS28 型电热恒温
水浴锅,DHG 905A 型电热恒温鼓风干燥箱,上海
一恒科学仪器有限公司;100 ~ 1 000 μL 百得移液
枪,上海摩亿科贸有限公司。
1􀆰 3  实验方法
1􀆰 3􀆰 1  实验流程
白酒丢糟预处理后多酶糖化降解工艺流程如
图 1所示。 工艺流程中,白酒丢糟干燥均为 70 ℃恒
温至恒质量。
图 1  白酒丢糟降解工艺流程
Fig􀆰 1  Flow chart of distillers′ grains degradation experiment
    1)鲜丢糟干燥与检测。 从酒厂提取白酒鲜丢
糟置于电热恒温鼓风干燥箱中,70 ℃恒温至恒质量
得干糟,并测定其指标。 2)预处理Ⅰ用 2%NaOH溶
液按固液比 1 ∶ 10(g / mL)添加白酒干丢糟,在 85 ℃
水浴恒温槽中处理 1􀆰 5 h。 3)预处理Ⅱ用 6%过氧
乙酸按固液比 1 ∶ 5 ( g / mL)添加白酒干丢糟,在
60 ℃水浴恒温槽中处理 5 h。 4)酶降解用 pH 4􀆰 8~
5􀆰 0的柠檬酸钠缓冲液调节白酒丢糟百分比,于
50 ℃、150 r / min的气浴摇床处理 48 h。
1􀆰 3􀆰 2  成分分析
白酒丢糟中纤维素和半纤维素含量分析参照
文献[13],酶解液中总糖、葡萄糖及木糖含量的测
定方法分别采用 3,5 二硝基水杨酸(DNS)法[14]、
葡萄糖试剂盒法和间苯三酚法测定[15]。 酶解液中
总糖、葡萄糖及木糖得率计算见式(1):
Y = 0􀆰 9m
m′
× 1 000 (1)
式中:Y为酶解液中总糖、葡萄糖或木糖产率,mg / g;
0􀆰 9为修正系数;m为酶解液中还原糖、葡萄糖或木
糖质量,g;m′为白酒丢糟预处理后干质量,g;2 次平
行实验,取其平均值。
1􀆰 3􀆰 3  木质素的测定
按照国标 GB / T 2677􀆰 8—1994 测定白酒丢糟
中木质素的含量。
R =
m0 - m1
m0
× 100% (2)
式中:R为木质素去除率,%;m0为白酒丢糟处理前木
质素质量,g;m1为白酒丢糟处理后木质素质量,g。
91  第 6期 刘跃红等:白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
1􀆰 3􀆰 4  总纤维素的测定
按照国标 GB / T 2677􀆰 10—1995测定白酒丢糟
中总纤维素的含量。
Z =
m4
m3
× 100% (3)
式中:Z为总纤维素回收率,%;m3为白酒丢糟处理
前总纤维质量,g;m4为白酒丢糟处理后总纤维质
量,g。
1􀆰 3􀆰 5  样品酶降解
白酒丢糟经预处理后用 pH 4􀆰 8 ~5􀆰 0 的柠檬酸
钠缓冲液调节底物浓度,添加 2%叠氮化钠 1 mL,同
时添加纤维素酶 NS22086、β 葡萄糖苷酶 NS22118、
木聚糖酶 22083 和复合酶 22119,于 50 ℃、 150
r / min的气浴摇床糖化降解 48 h,离心得上清
液[16-17]。 将上清液稀释一定倍数后,测定酶解液中
总糖、葡萄糖和木糖浓度及产率。
2  结果与讨论
2􀆰 1  NaOH 过氧乙酸处理白酒丢糟
根据文献[18],称取 100 g 白酒干丢糟于1 000
mL烧杯中,按照图 1所示工艺条件进行白酒丢糟预
处理,该实验进行 3次重复,处理后白酒丢糟中总纤
维素回收率和木质素去除率如表 1所示。 由表 1 可
知:总纤维素回收率为 78􀆰 04% ~90􀆰 73%,木质素去
除率为 66􀆰 13%~77􀆰 02%。
表 1  白酒丢糟预处理前后组分变化
Table 1  Different compositions of distillers′ grains
before and after the pretreatment
组分
w(组分) / %
白酒丢糟
处理前
白酒丢糟
处理后
回收率 / %
总纤维素a 56􀆰 27±2􀆰 1 47􀆰 35±1􀆰 8 78􀆰 04~90􀆰 73
纤维素 33􀆰 03±1􀆰 7 29􀆰 80±1􀆰 0 83􀆰 16~98􀆰 31
半纤维素 18􀆰 21±1􀆰 4 13􀆰 66±0􀆰 8 65􀆰 58~86􀆰 02
木质素 18􀆰 61±1􀆰 1 5􀆰 23±0􀆰 7 22􀆰 98~33􀆰 87b
水分 6􀆰 49±0􀆰 5
灰分 12􀆰 61±0􀆰 7
  注:a—文献[19]的数据; b—木质素去除率= 100%-回收率。
2􀆰 2  预处理后白酒丢糟酶降解
2􀆰 2􀆰 1  均匀实验设计
通过比较前期实验结果[18] 及查阅相关文
献[20],总结 5个影响白酒丢糟复合酶糖化降解的因
素 X1、 X2、 X3、 X4、 X5。 ① X1:白酒丢糟百分比
(g / 100 mL);②X2:纤维素酶 NS211086 体积(mL);
③X3:β 葡萄糖苷酶 NS22118 体积(mL);④X4:木
聚糖酶 NS22083 体积(mL);⑤X5:复合酶 NS22119
体积(mL)。 以总糖降解率为考察指标,用 DPS(date
processing system)数据处理系统[21]设计 U8(85)均匀
设计表,设计方案结果见表 2。 根据表 2实验方案,分
别在 4、11、23、33、48 h 测定酶解液中的总糖、葡萄糖
和木糖浓度。 结果如图 2~图 4所示。
表 2  U8(85)均匀设计方案
Table 2  The experimental table of uniform design
实验水平
因素
X1 X2 X3 X4 X5
总糖降解率
Y / (g·g-1)
N1 1(12) 5(1􀆰 8) 4(0􀆰 65) 6(0􀆰 12) 8(0􀆰 8) 0􀆰 301
N2 4(15) 1(0􀆰 2) 3(0􀆰 45) 7(0􀆰 14) 2(0􀆰 2) 0􀆰 274
N3 3(14) 8(3􀆰 0) 2(0􀆰 25) 2(0􀆰 04) 4(0􀆰 4) 0􀆰 400
N4 6(17) 7(2􀆰 6) 7(1􀆰 25) 8(0􀆰 16) 5(0􀆰 5) 0􀆰 297
N5 2(13) 3(1􀆰 0) 8(1􀆰 45) 4(0􀆰 08) 3(0􀆰 3) 0􀆰 397
N6 7(18) 6(2􀆰 2) 5(0􀆰 85) 3(0􀆰 06) 1(0􀆰 1) 0􀆰 328
N7 5(16) 2(0􀆰 6) 6(1􀆰 05) 1(0􀆰 02) 7(0􀆰 7) 0􀆰 196
N8 8(19) 4(1􀆰 4) 1(0􀆰 05) 5(0􀆰 10) 6(0􀆰 6) 0􀆰 277
    由图 2~图 4可以看出:酶解液中糖浓度随着酶
解时间的延长而增加。 在开始 4 h 内,酶解速率较
高,随后酶解液中葡萄糖浓度逐渐增大,葡萄糖浓
度的升高会延缓酶降解速率,在 11 ~ 23 h 内酶解速
02 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
率降低,糖浓度增加缓慢;当 33 h 时,酶解液中糖浓
度达到最高,之后糖浓度不再增加或增加很少,主
要是因为溶液中葡萄糖浓度的增大影响了酶的活
性,使得酶解速率降低直至停止。 在后续实验中,
用复配酶处理白酒丢糟 33 h,对各酶添加量进行均
匀实验设计优化,总糖降解率见表 2。 由表 2 可以
得出,总糖降解率最高为 0􀆰 4 g / g,为第 3组实验,该
组实验中,底物浓度和纤维素酶 NS22086 为主要影
响总糖降解率的因素。
图 2  酶解液中总糖浓度随时间的变化
Fig􀆰 2  Changes of total sugar over time
in the enzyme solution
图 3  酶解液中葡萄糖浓度随时间的变化
Fig􀆰 3  Changes of glucose over time
in the enzyme solution
2􀆰 2􀆰 2  回归方程的建立和分析
通过均匀设计和 DPS数据处理系统分析,根据
各因素对酶降解白酒丢糟总糖降解率的影响显著
程度进行多元二次回归,所得多元二次回归方程:
Y = 0􀆰 382 16 - 0􀆰 009 301X1 + 2􀆰 417 79X4 +
0􀆰 016 528X23-15􀆰 506 63X24-0􀆰 285 46X25+0􀆰 099 31X2X5
复相关系数 R= 0􀆰 998 6,F值为 58􀆰 125 8,显著
水平 P值为 0􀆰 007 8,剩余标准差为 0􀆰 009 5,复相关
系数 R和 F值越大。 剩余标准差越小,说明数据和
方程的拟合度越高。 从回归方程可以得出,X2与 X5
之间存在相互作用,X2、X3和 X4对酶解的作用明显,
图 4  酶解液中木糖浓度随时间变化
Fig􀆰 4  Changes of xylose over time
in the enzyme solution
因为 X2(纤维素酶 NS211086)的主要组分是葡萄糖
内切酶、葡萄糖外切酶和 β 葡萄糖苷酶。 只有当这
3 个主要组分的活性比例适当时,才能协同完成对
纤维素的高效降解[22-23]。 如果再添加因素 3(β 葡
萄糖苷酶 NS22118),会显著提高纤维素酶糖化效
率[24]。 同时半纤维素被木聚糖酶水解后,可降低物
料对纤维素酶的无效吸附,提高单糖产率[25]。 根据
回归方程,由 DPS得出最佳复配酶降解白酒丢糟组
合,见表 3。
表 3  总糖降解率最高时各个因素组合
Table 3  Combination of factors at high rate of total sugar
Y X1 X2 X3 X4 X5
0􀆰 464 8 12􀆰 000 0 2􀆰 965 5 1􀆰 303 9 0􀆰 078 4 0􀆰 633 1
2􀆰 2􀆰 3  验证实验
根据 DPS数据处理系统的分析及预测,总糖降
解率最高时,白酒丢糟百分比 0􀆰 12 g / mL,纤维素酶
NS211086 添加量 2􀆰 965 5 mL, β 葡萄糖苷酶
NS22118添加量 1􀆰 303 9 mL,木聚糖酶 NS22083 添
加量 0􀆰 078 4 mL,复合酶 NS22119 添加量 0􀆰 633 1
mL。 由回归方程计算出总糖理论最大得率为
0􀆰 464 8 g / g,在此实验条件下进行 3次重复实验,得
到总糖的实际得率为(0􀆰 432 8±0􀆰 013 5) g / g,低于
理论值,但明显高于前述各实验条件下得出的实验
数值。
3  结  论
1)用质量分数 2%NaOH溶液和体积分数 6%过
氧乙酸溶液相结合的方法对白酒丢糟进行预处理,
白酒丢糟中木质素去除率达到 66􀆰 13% ~ 77􀆰 02%,
总纤维回收率为 78􀆰 04% ~ 90􀆰 73%左右,木质素的
12  第 6期 刘跃红等:白酒丢糟的多酶复配降解制备可发酵性糖
脱除有利于下一步酶的糖化降解。
2)对白酒丢糟复配酶降解首次采用 DPS 数据
处理系统设计均匀试验并分析数据,通过回归分析
得出影响总糖降解得率的各因素之间存在一定的
相互作用。 根据本研究的前期实验选定主要影响
白酒丢糟总糖降解率的因素及各因素的取值范围,
由回归方程计算出总糖理论最大得率为 0􀆰 464 8
g / g,经过验证实验,得出总糖实际得率为(0􀆰 432 8±
0􀆰 013 5) g / g,与理论值接近。
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(责任编辑  管  珺)
22 生  物  加  工  过  程    第 12卷