全 文 ：双波长法用于磺酸型树脂吸附 !"#和 $%&’()*的研究
魏荣卿，邵勇军，刘晓宁，张婷婷，姚 忠!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：考察了 %&和 ’(&变化对紫外吸收单波长法、双波长法和考马斯亮蓝法的影响。结果表明双波长法比考马
斯亮蓝法和单波长法稳定性要好。选择双波长法用于磺酸型离子交换树脂吸附胰蛋白酶（)*+,-./）和牛血清白蛋白
（012）的检测，结果表明：交换容量为 3455 6678 9 :的树脂对 012和 )*+,-./的吸附速率和饱和吸附量均高于交换容
量为 ;4"< 6678 9 :的树脂。
关键词：双波长法；磺酸型离子交换树脂；牛血清白蛋白；胰蛋白酶
中图分类号：=>? 文献标识码：2 文章编号："><5（!##3）#; @ ##?> @ #3
"$+,& -* $./ ,+012304/1/*5$. (’/6$%-’.-$-7/$%)6 ,/$/%7)*0$)-* -8
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6678 9 : P(- P.:PR* 6(Z.6I6 (U-7*,).WR T(,(T.)+ (/U (U-7*,).WR WR87T.)+ 7S 012 (/U )*+,-./ )P(/ )PR *R-./ 7S
3455 6678 9 :4
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离子交换色谱是蛋白质类药物分离纯化中使用
最广泛的色谱技术之一［"］。在离子交换色谱应用
中，其介质的吸附性能决定了分离纯化的效率［!］，因
此起着关键作用。了解和预测各种酶或蛋白质在介
质中的吸附性能，将有助于过程的控制和放大。
常用于蛋白含量检测的方法有紫外吸收
法［;，3］、考马斯亮蓝法［?，>］等。!5# /6单波长紫外吸
收法简单、方便，但灵敏度不高。考马斯亮蓝法迅
速、灵敏度高，但相对紫外吸收法较复杂［<］，且易受
,%变化的影响。!5# /6和 !># /6双波长紫外吸收
法则对单波长法进行了改进，提高了灵敏度和稳定
性。由于在酸型离子交换树脂吸附过程中，树脂上
的阳离子交换基，如 ’(&、%&，与蛋白发生交换会导
致液相中 ’(&、%&浓度发生变化，从而给检测结果
带来误差。本文拟考察和比较单波长法、双波长法
及考马斯亮蓝法的稳定性，从而选择较好的检测方
法，用于酸型离子交换树脂吸附蛋白的研究。
! 收稿日期：!##3E#基金项目：江苏省科技攻关项目（0B!##"#3#）
作者简介：魏荣卿（"$?; @），女，山西人，副教授，研究方向：生物分离。
联系人：刘晓宁，教授，南京工业大学制药与生命科学学院，南京，!"###$
2I:[ !##3
·?>·
生 物 加 工 过 程
QP./R-R \7I*/(8 7S 0.7,*7TR-- B/:./RR*./:
第 !卷第 ;期
!##3年 5月
万方数据
! 材料与方法
!"! 仪器与试剂
#$!%&!型紫外 ’可见光光度计（北京普析通用
仪器责任有限公司）。牛血清白蛋白（()*）*+,-./0
公司进口分装，胰蛋白酶为上海东风生化技术有限
公司产品。考马斯亮蓝 1234&是 *+,-./0公司进口
分装。三羟甲基氨基甲烷（#,5.）为中国惠兴生化试
剂有限公司产品。磷酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、
柠檬酸均为分析纯。磺酸型聚苯乙烯2二乙烯基苯
离子交换树脂（交换容量 6"!7和 8"99 ++0: ’ ;）为南
京麦科菲高效分离载体有限公司提供。
!"3 溶液的配制
!"3"! 缓冲液的配制
所用 #,5.2<=:缓冲液（>< 7"?）和柠檬酸2磷酸缓
冲液（>< 3"?）的配制按文献［9］进行。
!"3"3 胰蛋白酶 ! +; ’ +@溶液的配制
精确称取胰蛋白酶 !&& +;，用适量 #,5.2<=: 缓
冲液溶解，充分混匀并定容至 !&& +@容量瓶。置于
& A 8 B冷藏备用。
!"3"6 ()* ! +; ’ +@溶液的配制
精确称取 ()* !&& +;，用适量柠檬酸2磷酸缓冲
液溶解，充分混匀并定容至 !&& +@容量瓶。置于 &
A 8 B冷藏备用。
!"3"8 考马斯亮蓝溶液配制及考马斯亮蓝染色法
操作
考马斯亮蓝染色液和考马斯亮蓝染色法操作按
照文献［7］进行。
!"6 蛋白浓度标准曲线的绘制［7］
以 ! +; ’ +@蛋白为母液，用缓冲液稀释配制成
不同浓度标准溶液。于波长 39& C+与 3?& C+处测
定吸光值，以吸光值 !39& C+和 !3?& C+对标准蛋白浓
度 = 回归，得双波长法标准曲线方程；以吸光值
!39& C+对标准蛋白浓度作图得单波长法标准曲线方
程；按照考马斯亮蓝法在波长 4%4 C+ 处测定吸光
值，以吸光值 !4%4 C+对标准蛋白浓度作图得考马斯
亮蓝法标准曲线方程。
!"8 样品中蛋白浓度的测定
测定样品在波长 39& C+与 3?& C+或 4%4 C+处
吸光值，通过蛋白浓度标准曲线，计算得到所测样品
的蛋白浓度值。
!"4 磺酸型阳离子交换树脂蛋白吸附速率
的测定［%］
准确称量一定量的树脂于锥形瓶中，向锥形瓶
内加入初始浓度 "0的蛋白溶液，在水浴振荡器（温
度为 34 B，振荡器转速为 !3& , ’ +5C）中不断振荡，
经不同时间取样测定其吸光值。当前后两次蛋白浓
度测定值不再变化时，即达到交换平衡。
!"? 磺酸型阳离子交换树脂蛋白吸附等温线
的测定［%］
分别向 # 个锥形瓶中加入一定量 $ 的树脂和
相同体积 % 不同初始浓度 "&#的蛋白溶液，在水浴振
荡器中不断振荡（温度为 34 B，振荡器转速为 !3&
, ’ +5C）。当前后两次蛋白浓度测定值不再变化，即
为各锥形瓶中液相的蛋白平衡浓度 "’#，根据式 ( D
（"&# E "’#）% ) $，求得树脂交换容量 (。对交换容
量和平衡浓度即可作出等温线。
" 结果与讨论
3"! 标准曲线及线性范围
在不同检测方法下的蛋白浓度标准曲线方程、
相关系数和线性范围见表 !。
表 ! 标准曲线方程和线性范围
#FG:- ! #H- /F:5G,FI50C /J,K-. FCL :5C-F, ,FC;-.
蛋白 检测方法 标准曲线方程 * 线性范围 ’（+; ’ +@）
()* 双波长法 " D 6"4&!39& C+ E 3"?3!3?& C+ &"%%%? &"&3 A &"%
单波长法 " D !"47!39& C+ &"%%%& &"! A &"9
考马斯亮蓝法 " D &"?44!4%4 C+ E &"%6& &"%%%! &"&3 A &"%
I,M>.5C 双波长法 " D !"??!39& C+ E !"?3!3?& C+ &"%%%% &"&3 A !"&
表 !结果表明，6种方法的线性均很好，但单波
长法的线性范围不如其它方法宽。
3"3 分别向相同浓度的蛋白溶液，加入相同体积不
3&&8年 9月 魏荣卿等：双波长法用于磺酸型树脂吸附 ()*和 I,M>.5C的研究 ·47·
万方数据
同浓度的 !"#溶液，用不同检测方法测定蛋白浓度，
计算相对标准偏差（!"#）值，结果见表 $。
表 $ !%浓度的影响
&’(#) $ *++),-. /+ ,/0,)0-1’-2/0 /+ !%
蛋白 检测方法 加入 !%浓度 3（4/# 3 5）!"# 3 6
789 双波长法 :;:: < :;:$ =;>
单波长法 :;:: < :;:$ $?;@
考马斯亮蓝法 :;:: < :;:$ $A;B
-1CD.20 双波长法 :;:: < :;:$ ?;E
由表 $可见，!%变化对单波长法和考马斯亮蓝
法的影响很大。对单波长法的影响是由于蛋白质的
紫外吸收会随 !%变化而变化［@］，对考马斯亮蓝法的
影响则是由于显色剂的解离平衡会因体系中!%变化
而改变［A:］。而 !%变化对双波长法的影响则很小。
$;? F’%浓度的影响
分别向相同浓度的蛋白溶液里加入相同体积不
同浓度的 F’"#溶液，用不同方法测定蛋白浓度，计
算 G8H值，结果见表 ?。
表 ? F’%浓度的影响
&’(#) ? *++),-. /+ ,/0,)0-1’-2/0 /+ F’%
蛋白 检测方法 加入 F’%浓度 3（4/# 3 5）!"# 3 6
789 双波长法 :;:: < :;E: $;:
单波长法 :;:: < :;E: $;:
考马斯亮蓝法 :;:: < :;E: >;@
-1CD.20 双波长法 :;:: < :;E: A;I
由表 ?可见，F’%变化对紫外吸收法影响较小
而对考马斯亮蓝法影响较大，这是由于 F’"#浓度的
增加导致显色剂之间疏水作用力增强，从而形成了
聚集体的原因［A:］。
综合“$;A”、“$;$”及“$;?”项结果表明，双波长
法是对 !%和 F’%变化最稳定的检测方法，故可选
择双波长法作为离子交换树脂吸附蛋白含量的检测
方法。
$;= 反应速率曲线的测定
采用双波长法，磺酸型阳离子交换树脂（交换容
量分别为 ?;A@、=;II 44/# 3 J）对胰蛋白酶和 789的
吸附速率曲线见图 A。
根据多相化学反应理论，离子交换反应是一级
可逆反应，属于外扩散控制［AA］，树脂与胰蛋白酶和
789进行交换反应的动力学方程可用下列反应速率
方程表示：
—!—=KII 44/# 3 J -1CD.20；—"—?KA@ 44/# 3 J -1CD.20
—#—=KII 44/# 3 J 789；—$—?KA@ 44/# 3 J 789
图 A 不同交换容量的磺酸树脂对蛋白的吸附速率曲线
L2J;A 9M./1D-2/0 1’-) ,N1O). /+ D1/-)20. /0 .N#+N12, ’,2M2, ,’-2/0
)P,Q’0J) 1).20. R2-Q M2++)1)0- )P,Q’0J) ,’D’,2-2).
S #0（A S $）T %& （A）
（A）式中，$ T ’ ( ’U，’ 为反应时间 & 时的交换
量（4J 3 J），’U为平衡时的交换量（4J 3 J），% 为交换
反应速率常数（QS A），以 S #0（A S $）对 & 进行线性回
归，结果见表 =。
表 = 反应速率方程拟合结果
&’(#) = &Q) 1).N#-. +2--)M R2-Q ’(./1D-2/0 1’-) )VN’-2/0
蛋白
交换容量
3（44/# 3 J）
’U
3（4J 3 J）
)
3 QS A
*
-1CD.20 ?;A@ A?;> :;:EI$ :;BB?
=;II AB;? :;AA: :;BE>
789 ?;A@ A$;? :;:?E? :;BB$
=;II AI;? :;A:: :;B@I
由图 A和表 =可见，交换容量为 =;II 44/# 3 J的
树脂对蛋白的吸附速率要高于交换容量为 ?;A@
44/# 3 J树脂。
$;E 吸附等温线的测定
采用双波长法，磺酸型阳离子交换树脂（交换容
量分别为 ?;A@、=;II 44/# 3 J）对胰蛋白酶和 789的
吸附等温线见图 $。
常见的描述蛋白质的液W固界面上吸附的
5’0J4N21方程［A$，A?］表达式为：
’ T ’+,- (（). % ,-） （$）
（$）式中 XM为吸附平衡的解离常数（4J 3 45），
’4为饱和吸附量（4J 3 J），,)为平衡浓度（4J 3 45），
’ 为吸附量（4J 3 J）。
用 5’0J4N21式对实验结果进行回归，所得结果
见表 E。
·EI· 生物加工过程 第 $卷第 ?期
万方数据
—!—!"## $$%& ’ ( )*+,-./；—"—0"12 $$%& ’ ( )*+,-./
—#—!"## $$%& ’ ( 345；—$—0"12 $$%& ’ ( 345
图 6 不同交换容量的磺酸型树脂对蛋白的吸附等温线
7.(86 9:; <=-%*,).%/ .-%):;*$- %> ,*%);./- %/ -?&>?*.@ <@.=.@
@<).%/- ;A@:>;*;/) ;A@:表 C D9.));= B.): D蛋白
交换容量
’（$$%& ’ (）
!G
’（$( ’ (）
"#
’（$( ’ $D）
$
)*+,-./ 0812 6080 H8H10 6 H8II0
!8## J#8# H8H2H # H8IJ2
345 0812 1!8# H8H6# 1 H8II6
!8## C08H H8HH! C H8I##
图 6和表 C表明，交换容量为 !8## $$%& ’ (的树
脂对蛋白的饱和吸附容量要高于交换容量为 0812
$$%& ’ (树脂。
! 结 论
（1）与考马斯亮蓝法和单波长紫外吸收法相比，
双波长紫外吸收法对 KL 和 M好，可用于酸型离子交换树脂吸附蛋白的浓度测定。
（6）交换容量为 !8## $$%& ’ (的酸型离子交换树
脂对胰蛋白酶和 345的吸附速率和饱和吸附容量
要高于交换容量为 0812 $$%& ’ (的树脂。
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