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Effects of extraction systems on compositions of oil-extracted algae-residues from Chlorella phyrenoidosa

不同萃取体系对小球藻藻渣成分的影响



全 文 :第 11 卷第 6 期
2013 年 11 月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol. 11 No. 6
Nov. 2013
doi:10. 3969 / j. issn. 1672 - 3678. 2013. 06. 002
收稿日期:2012 - 10 - 10
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划)(2011CB200906)
作者简介:尹丰伟(1985—),男,山东青岛人,硕士研究生,研究方向:生物化工;高  振(联系人),副研究员,E⁃mail:gaozhen@ njut. edu. cn
不同萃取体系对小球藻藻渣成分的影响
尹丰伟1,段  珺1,高  振1,郑洪立1,郑艳萍1,黄  和1,2
(1.南京工业大学 生物与制药工程学院,南京 211800;
2.南京工业大学 材料化学工程国家重点实验室,南京 210009)
摘  要:考察 5 种萃取体系(A:正己烷,B:正己烷 /乙醇,C:正己烷 /异丙醇,D:氯仿 /甲醇,E:氯仿 /乙醇)对小球藻
(Chlorella phyrenoidosa)油脂的提取效果及藻渣成分的影响。 实验结果表明:不同的萃取体系下,油脂得率为 D
(12􀆰 27% )、E(8􀆰 87% )、C (7􀆰 71% )、B (6􀆰 80% )、A (3􀆰 91% ),藻渣蛋白含量为 A (52􀆰 60% )、 E (46􀆰 23% )、 B
(40􀆰 19% )、C (39􀆰 52% )、 D (32􀆰 52% ),藻渣碳水化合物含量为 A (23􀆰 28% )、 E (16􀆰 15% )、 B (13􀆰 24% )、 D
(13􀆰 50% )、C(9􀆰 06% );藻渣色素含量为 A(1􀆰 75% )、E(1􀆰 29% )、B(1􀆰 14% )、C(0􀆰 96% )、D(0􀆰 58% );藻渣灰分含
量为 D(3􀆰 63% )、E(2􀆰 94% )、C(2􀆰 23% )、B(2􀆰 25% )、A(1􀆰 48% )。 综合考虑微藻生物柴油的生产及藻渣的可利
用性,V(氯仿) / V(乙醇) = 1 是一种油脂萃取效果较好,藻渣营养成分损失较小的小球藻油脂萃取体系。
关键词:小球藻;萃取;油脂;微藻;营养成分
中图分类号:Q819        文献标志码:A        文章编号:1672 - 3678(2013)06 - 0009 - 06
Effects of extraction systems on compositions of
oil⁃extracted algae⁃residues from Chlorella phyrenoidosa
YIN Fengwei1,DUAN Jun1,GAO Zhen1,ZHENG Hongli1,ZHENG Yanping1,HUANG He1,2
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211800,China;
2. State key Laboratory of Materials⁃Oriented Chemical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 210009,China)
Abstract:The effects of five kinds of extraction systems (A:n⁃hexane,B:n⁃hexane / alcohol,C:n⁃hexane /
isopropyl,D:chloroform / methanol,E:chloroform / alcohol) on lipid extraction and nutrient compositions of
algae⁃residues from Chlorella phyrenoidosa were studied. By different extraction systems,the lipid yield
were:D(12􀆰 27% ),E(8􀆰 87% ),C(7􀆰 71% ),B(6􀆰 80% ),A(3􀆰 91% ); the crude protein content of
algae⁃residues were:A(52􀆰 60% ),E(46􀆰 23% ),B(40􀆰 19% ),C(39􀆰 52% ),D(32􀆰 52% ); the total
carbohydrates of algae⁃residues were:A(23􀆰 28% ),E(16􀆰 15),B(13􀆰 24% ),D(13􀆰 50),C(9􀆰 06% );
the pigments contents of algae⁃residues were:A(1􀆰 75% )),E(1􀆰 29% ),B(1􀆰 14% ),C(0􀆰 96% ),D
(0􀆰 58% ); the ash contents of algae⁃residues were:D(3􀆰 36% ),E(2􀆰 94% ),C(2􀆰 23% ),B(2􀆰 25% ),
A(1􀆰 48% ). The extraction system V ( chloroform) / V ( alcohol) = 1 was suitable for microalgae lipid
extraction because of its higher lipid yield and much less influence on nutrient composition of algae⁃
residues.
Key words:Chlorella phyrenoidosa;extraction;lipid;microalgae;nutrient composition
    当前,由于全球能源、资源和环境压力,使研
究者的目光投向了对生物质资源的开发与利
用[1] ,在众多的生物质原料中,微藻光合效率高、
生长速度快、油脂含量高,具有开发成生物柴油原
料的潜能[2] ,但因生产成本高[3] ,未能实现规模化
生产。 微藻柴油生产中,油脂的提取是其中一个
关键环节,有机溶剂萃取法因成本较低、溶剂可回
收利用等优势[4] ,是微藻油脂提取中的常用方法。
前人关于微藻油脂的提取做了大量研究,并针对
不同的微藻提出了不同的有机溶剂萃取体系和提
取方法[5 - 7] ,其中以混合萃取体系(极性与非极性
有机溶剂混合)的提取效果最好[8] 。 微藻除了含
有可供生产生物柴油的油脂外,还含有大量的蛋
白、多糖、色素、矿质元素等,因此藻渣中会残留丰
富的营养成分,并且微藻油脂提取后会产生
50% ~ 80%的藻渣[9] 。 有报道指出将微藻油脂生
产和藻渣的利用结合起来是降低生物柴油生产成
本的有效途径之一[10] ,同时也可避免藻渣堆积带
来的环境污染。
虽然有关微藻油脂提取方面的研究已取得很
大的进展,但这些研究很少涉及并考虑到不同萃取
方法对提油之后藻渣的影响。 针对该问题,笔者拟
在前人研究的基础上,综合目前实验中常用的萃取
体系,考察不同萃取体系对蛋白核小球藻(Chlorella
phyrenoidosa)藻渣成分的影响,为小球藻油脂的提
取和藻渣利用提供参考。
1  材料与方法
1. 1  小球藻
实验 所 用 的 蛋 白 核 小 球 藻 ( Chlorella
phyrenoidosa)由笔者所在课题组培养。
1. 2  油脂的提取
根据前人研究,拟采用 5 种不同的萃取体系
(所用的试剂均为分析纯,以后皆用A ~ E表示):A
正己烷[11],B 正己烷 /乙醇(体积比1∶ 1) [6],C 正己
烷 /异丙醇(体积比 1 ∶ 1) [7],D 氯仿 /甲醇(体积比
1∶ 1) [5],E氯仿 /乙醇(体积比1∶ 1,由笔者根据文献
[8]提出)。
称 2 g藻粉,液氮破壁[6]后收集于 50 mL 具塞
三角瓶中,分别加入 20 mL A ~ E 的萃取体系,
25 ℃、200 r / min条件下振荡萃取 2 h. 萃取结束后
加 10 mL 蒸馏水分层[8],分别取正己烷层和氯仿层
于 25 mL圆底烧甁中,并再用相同体积的正己烷和
氯仿萃取 2 次。 有机溶剂经减压蒸馏去除,即得粗
油脂,具体流程见图 1。
图 1  小球藻油脂的提取与藻渣获取路线
Fig. 1  Roadmap of lipid extraction and algae⁃residues
obtained from C. phyrenoidosa
1. 3  藻渣的获得
油脂提取之后,将剩下的含小球藻细胞碎片的
藻液离心(在 4 ℃下 5 000 r / min 离心 10 min)弃上
清,细胞碎片再用蒸馏水洗 3 次,收集沉淀,60 ℃烘
干,即得藻渣(图 1)。
1. 4  分析方法
油脂得率的计算及脂肪酸分析参照文献[6]。
蛋白质的测定参照文献[12],以 6􀆰 25 作为总 N
转化为蛋白质的系数。
氨基酸测定:称取 0􀆰 02 g 藻渣于 10 mL水解管
中,加 10 mL 6 mol / L HCl,120 ℃条件下水解 24 h。
氨基酸的分析方法参照文献[13]。
藻渣碳水化合物的测定采用 H2SO4 蒽
酮法[14]。
藻渣色素的提取与分析参照文献[15]。
藻渣灰分的测定参照文献[16]。
藻渣矿质元素的分析:藻渣灰化后以 1 ∶ 49(体
积比)的 HNO3 溶解后,进行 ICP分析[17]。
2  结果与讨论
2. 1  萃取体系对油脂得率的影响
考察萃取体系对油脂得率的影响,结果见图
2。 由图 2 可知:小球藻的油脂约占细胞干质量
的 10% ,不同的萃取体系下的油脂得率差异明
01 生  物  加  工  过  程    第 11 卷 
显;单一非极性有机溶剂 ( A)下的油脂得率最
少,只有 3􀆰 91% ,混合萃取体系下油脂的得率较
高,其中 D 条件下可达到 12􀆰 27% 。 Halim 等 [11]
发现正己烷 /异丙醇条件下获得的油脂要比单一
的正己烷条件下多 3 倍左右,并提出了微藻油脂
的萃取机制 [8] ,认为极性和非极性有机溶剂可针
对不同类型油脂的萃取,而混合萃取体系更利于
微藻油脂的萃取,原因与细胞中同膜蛋白相连的
油脂相关。 这是因为藻细胞含有极性脂,并通过
氢键或其他较强的静电键与膜上的蛋白质相连,
萃取体系中的极性溶剂可以破坏这种连接 [11] ,
将这类脂从膜蛋白上“拉”出来并溶于有机溶剂
中。 本实验进一步证实了该机制,并发现不同非
极性 /极性有机溶剂组合变化对油脂的提取效果
不同。
图 2  萃取体系对小球藻的油脂得率的影响
Fig. 2  Effects of extraction systems on
lipid yield of C. phyrenoidosa
2. 2  萃取体系对脂肪酸分布的影响
表 1 为萃取体系对脂肪酸分布的影响结果。
由表 1 可知:该蛋白核小球藻的脂肪酸类型分布
为 C14 ∶ 0 ~ C18 ∶ 3,不饱和脂肪酸( UFA)含量较
高,约占总脂肪酸的 77% ;所有脂肪酸中,以 C18∶
2(亚油酸)、C16∶ 0(软脂酸)和 C18∶ 3(亚麻酸)的
含量较高。 由表 1 还可以看出,不同萃取体系下
得到的脂肪酸具有明显的差别:单一正己烷条件
(A)不利于饱和脂肪酸的提取,饱和脂肪酸( SFA)
占总脂肪酸的 21􀆰 04% ,这可能是由于不饱和脂肪
酸多以极性结构脂的形式存在有关;其他 4 种混
合萃取体系,以 B 得到的饱和脂肪酸比例较高,达
到总脂肪酸的 24􀆰 43% ,以 C 条件下的最少,为
22􀆰 74% 。 这说明油脂在细胞内有不同存在形式,
且进一步说明不同的萃取体系对细胞内油脂的作
用力不同。
表 1  萃取体系对小球藻的脂肪酸分布及含量的影响
Table 1  Effects of extraction systems on the fatty acid
composition and contents in C. phyrenoidosa
脂肪酸
占总脂肪酸的含量 / %
A B C D E
C14∶ 0 0􀆰 75 2􀆰 43 3􀆰 33 2􀆰 01 1􀆰 8
C16∶ 0 17􀆰 54 19􀆰 01 15􀆰 7 18􀆰 64 18􀆰 465
C16∶ 1 1􀆰 78 1􀆰 66 1􀆰 67 1􀆰 69 1􀆰 71
C16∶ 2 11􀆰 03 9􀆰 25 10􀆰 27 9􀆰 69 9􀆰 92
C16∶ 3 11􀆰 83 9􀆰 28 10􀆰 46 9􀆰 92 10􀆰 23
C18∶ 0 2􀆰 75 2􀆰 99 3􀆰 15 2􀆰 93 2􀆰 97
C18∶ 1 5􀆰 43 6􀆰 38 6􀆰 26 6􀆰 14 6􀆰 03
C18∶ 2 33􀆰 64 34􀆰 81 34􀆰 51 34􀆰 52 34􀆰 37
C18∶ 3 15􀆰 25 14􀆰 19 14􀆰 63 14􀆰 45 14􀆰 59
∑SFA 21􀆰 04 24􀆰 43 22􀆰 74 23􀆰 58 23􀆰 16
∑UFA 78􀆰 96 75􀆰 57 77􀆰 26 76􀆰 42 76􀆰 84
2. 3  萃取体系对藻渣蛋白含量的影响
图 3 为不同萃取条件下藻渣的蛋白含量结果。
由图 3 可知:该小球藻藻渣中的蛋白质占到藻渣
干质量的 45%左右,可作为一种良好的蛋白食品
或蛋白饲料源;A 条件下的藻渣蛋白含量较高,占
藻渣干质量的 52􀆰 60% ,D 条件下得到的最少,为
32􀆰 52% 。 本实验采用液氮研磨对细胞进行破壁
处理[6] ,因此细胞膜上的极性脂与蛋白的复合体
有可能在萃取时一并进入到有机溶剂中,造成藻
渣蛋白含量的减少。 另外,混合萃取体系中的极
性溶剂(水醇相)含有色素、蛋白质、氨基酸和其他
的非油脂成分[18] ,造成部分蛋白质的流失。 实验
中所用到的几种极性溶剂极性各不相同,可能会
造成不同萃取体系中的水醇相蛋白含量不同。 因
此,藻渣蛋白含量受多种因素影响,具体原因和机
制有待进一步深入研究。
2. 4  萃取体系对藻渣的氨基酸组成及含量的影响
表 2为藻渣中的氨基酸及其含量。 由表 2 可知:
4种混合萃取体系(B ~ E)下的氨基酸含量相似,但
单一萃取体系(A)与混合萃取体系(B ~ E)相比在某
些氨基酸含量上具有较大差异,这可能与萃取过程中
因萃取体系不同而造成的蛋白质流失有关。
11  第 6 期 尹丰伟等:不同萃取体系对小球藻藻渣成分的影响
图 3  萃取体系对藻渣的蛋白含量的影响
Fig. 3  Effects of extraction systems on protein
contents in algae⁃residues
表 2  萃取体系对藻渣中氨基酸的组成
及含量的影响
Table 2  Effects of extraction systems on amino acid
compositions and content of algae⁃residues
氨基酸
占总氨基酸的含量 / %
A B C D E
天冬氨酸 2􀆰 36 3􀆰 45 2􀆰 33 0􀆰 13 5􀆰 13
谷氨酸 2􀆰 87 4􀆰 06 4􀆰 66 5􀆰 16 4􀆰 52
丝氨酸 0􀆰 41 0􀆰 60 0􀆰 70 0􀆰 89 0􀆰 44
甘氨酸 1􀆰 48 4􀆰 89 4􀆰 77 5􀆰 13 4􀆰 37
组氨酸 7􀆰 51 10􀆰 95 10􀆰 32 11􀆰 03 10􀆰 87
精氨酸 3􀆰 75 5􀆰 17 5􀆰 17 5􀆰 39 4􀆰 77
苏氨酸 2􀆰 84 4􀆰 45 4􀆰 22 4􀆰 47 3􀆰 94
丙氨酸 19􀆰 09 16􀆰 47 15􀆰 58 16􀆰 75 16􀆰 62
脯氨酸 29􀆰 80 9􀆰 98 12􀆰 07 8􀆰 78 6􀆰 23
酪氨酸 5􀆰 72 1􀆰 63 2􀆰 19 2􀆰 11 1􀆰 62
缬氨酸 4􀆰 62 3􀆰 00 3􀆰 14 2􀆰 96 2􀆰 93
蛋氨酸 3􀆰 41 6􀆰 76 6􀆰 45 6􀆰 95 7􀆰 07
胱氨酸 1􀆰 10 0􀆰 82 0􀆰 90 0􀆰 99 2􀆰 59
异亮氨酸 1􀆰 94 3􀆰 60 3􀆰 48 3􀆰 71 0􀆰 77
亮氨酸 5􀆰 19 9􀆰 33 8􀆰 95 9􀆰 58 12􀆰 65
苯丙氨酸 3􀆰 24 3􀆰 86 4􀆰 23 4􀆰 45 4􀆰 51
赖氨酸 4􀆰 67 10􀆰 99 10􀆰 83 11􀆰 51 10􀆰 94
2. 5  萃取体系对藻渣的碳水化合物含量的影响
图 4 为不同萃取体系下的藻渣中碳水化合物含
量结果。 由图 4 可知:小球藻细胞中含有较多的糖
脂(glycolipid),约占细胞干质量的 5􀆰 7% [19]。 糖脂
作为一种极性脂是膜脂的重要组成成分[20],在油脂
的萃取过程中一部分糖脂溶于有机溶剂而被提取
出来,使藻渣中的碳水化合物含量降低。 另外,小
球藻的部分碳水化合物因溶于水醇相中而流失[18],
也会降低藻渣碳水化合物的含量。 从图 4 还可以看
出,混合萃取体系对藻渣碳水化合物的含量影响较
大,且不同的混合萃取体系之间也有较大差别。
图 4  萃取体系对藻渣的碳水化合物含量的影响
Fig. 4  Effects of extraction systems on content of
total carbohydrate in algae⁃residues
图 5  萃取体系对藻渣的色素含量的影响
Fig. 5  Effects of extraction systems on pigment
contents in algae⁃residues
2. 6  不同萃取体系下的藻渣色素含量
不同萃取体系下藻渣中叶绿素 a、叶绿素 b 和
类胡萝卜素的含量变化如图 5 所示。 由图 5 可知:
A条件下的藻渣色素含量最多,达到 17􀆰 51 mg / g;其
次为 B、C 和 E,三者相差不大;D 条件下最少,为
5􀆰 59 mg / g。 将该结果与 2􀆰 1 节结果对照可知,油脂
萃取效果好的体系同样对色素有着良好的萃取作
用,这主要是因为这 3 种色素都是脂溶性的,在油脂
的萃取过程中溶于有机溶剂而使藻渣中的色素含
量降低。 有研究表明氯仿 /甲醇体系利于叶绿素 a
的提取[21 - 22],本实验的结果也表明了这一点,并且
还证明该体系同时还适用于另外 2 种色素的萃取
(图 5)。 藻渣中色素含量的差异也说明不同萃取体
系对微藻不同色素的作用力不同。
21 生  物  加  工  过  程    第 11 卷 
2. 7  萃取体系对藻渣的灰分含量的影响
不同萃取体系下的藻渣中灰分含量如图 6 所
示。 由图 6 可知:藻渣中的灰分含量较少;不同萃取
体系下的藻渣灰分含量不同,以 D 条件下得到的灰
分最多,占到藻渣干质量的 3􀆰 36% 。 灰分主要是无
机成分的残留物,本实验获取的藻渣是破壁后的小
球藻经水和有机溶剂处理后的残余物,为藻细胞的
结构成分(细胞器、细胞膜和细胞壁等),胞内游离
无机盐易在处理过程中流失。 而灰分含量的测定
是以占干质量的百分比计算的,而由前面的分析可
知,A条件下的油脂得率最低,藻渣中残留的油脂、
蛋白质、碳水化合物的含量最高,使得灰分在总干
质量中所占的比例降低;D条件则恰好相反。
图 6  萃取体系对藻渣的灰分含量的影响
Fig. 6  Effects of extraction systems on
ash content in algae residues
2. 8  萃取体系对藻渣中矿质元素含量的影响
分析了不同萃取体系下藻渣中的 9 种矿质元素
(P、Ca、Na、K、Fe、Al、Zn、Cu 和 Mn),结果如表 3 所
示。 由表 3 可知:藻渣中含有丰富的 P、Ca和 Na,分
别占到矿质元素总质量的 50% 、20%和 15%左右,
Al、Zn、Cu和 Mn的含量则相对较少。 9 种元素中,P
含量具有显著的优势,这是因为藻渣主要是残破的
细胞结构,而 P又是细胞核和细胞膜等细胞结构的
重要组成元素。 不同萃取体系下,藻渣矿质元素占
藻渣干质量的含量 ( mg / g) 由多到少依次为 D
(869􀆰 19)、E(656􀆰 98)、B(548􀆰 98)、C(483􀆰 78)、A
(424􀆰 70),此趋势同藻渣灰分的含量趋势一致(图
6),这是因为矿质元素是灰分的主要成分。
2. 9  萃取体系的评价
综合以上实验结果,针对微藻生物柴油的生产
和藻渣的可利用性,并参照美国能源部关于微藻生
物炼制的概述[23],对油脂和藻渣成分各项指标分配
权重。 其中油脂的获得是主要目标,因此给以最高
权重值为 0􀆰 3,藻渣中的成分根据其经济价值分别
赋予不同的权重(表 4),并为各种萃取体系打分(相
差不明显的计相同分)。 在该评价方法下,E萃取体
系得到的分数最高为 4􀆰 0,其次为 A (3􀆰 8)和 D
(3􀆰 2),得分最少的为 B(2􀆰 8)和 C(2􀆰 4)。 因此在
该评价方法下,E 萃取体系(氯仿 /乙醇)获得的油
脂得率较高,且藻渣成分损失较少。
表 3  萃取体系对藻渣中的矿质元素含量的影响
Table 3  Effects of extraction systems on mineral
contents in algae⁃residues
矿质
元素
矿质元素含量 / (mg·g - 1)
A B C D E
P 153􀆰 36 278􀆰 78 249􀆰 89 403􀆰 14 305􀆰 52
Ca 96􀆰 32 96􀆰 81 83􀆰 90 138􀆰 42 137􀆰 27
Na 95􀆰 34 82􀆰 96 73􀆰 80 169􀆰 58 102􀆰 65
K 41􀆰 88 48􀆰 26 45􀆰 47 88􀆰 47 51􀆰 59
Fe 12􀆰 63 12􀆰 50 9􀆰 74 18􀆰 50 16􀆰 91
Al 7􀆰 53 12􀆰 34 6􀆰 26 23􀆰 47 10􀆰 61
Zn 7􀆰 38 9􀆰 46 6􀆰 49 12􀆰 11 14􀆰 69
Cu 6􀆰 05 5􀆰 14 5􀆰 86 10􀆰 99 13􀆰 74
Mn 4􀆰 21 2􀆰 73 2􀆰 37 4􀆰 51 4􀆰 00
总计 424􀆰 70 548􀆰 98 483􀆰 78 869􀆰 19 656􀆰 98
表 4  萃取体系的评价
Table 4  Evaluation of extraction systems
萃取
体系
藻渣
粗油脂 粗蛋白 碳水化合物 色素 灰分
0􀆰 3 0􀆰 2 0􀆰 2 0􀆰 2 0􀆰 1
得分
A 2 5 5 5 2 3􀆰 8
B 3 3 2 3 3 2􀆰 8
C 3 3 1 2 3 2􀆰 4
D 5 2 3 1 5 3􀆰 2
E 4 4 4 4 4 4􀆰 0
3  结  论
油脂萃取后的小球藻(Chlorella phyrenoidosa)
藻渣中仍含有丰富的营养成分,具有进一步开发利
用的潜力。 单一非极性有机溶剂不利于油脂的萃
31  第 6 期 尹丰伟等:不同萃取体系对小球藻藻渣成分的影响
取,但得到的藻渣营养成分损失最少;混合萃取体
系由于其极性溶剂能破坏极性脂与膜的连接,因此
更能充分提取细胞中的油脂成分,但同时也造成藻
渣成分损失较多———一部分溶于水醇相中而流失,
另一部分溶于非极性溶剂中,具体的组成及含量有
待于进一步研究。 不同的混合萃取体系由于极性
的不同对油脂的提取效果和藻渣成分的影响也不
同,氯仿 /乙醇(体积比 1∶ 1)体系相对是一种提油效
果较好、藻渣营养成分损失较小的萃取体系,但由
于氯仿的使用可能会限制藻渣的进一步利用,因此
针对微藻及藻渣的利用方向可选择不同的萃取体
系,另外开发一种有效的有机溶剂去除方法也可以
拓宽藻渣的应用范围。
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41 生  物  加  工  过  程    第 11 卷