全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%%*
收稿日期"$%% ?%* ?&*
基金项目"江西省科技支撑计划项目#赣科发计字*$%%*&5 号+$
作者简介"涂"璇#&!5%$&女&江西奉新人&硕士研究生&研究方向"微生物次级代谢产物)涂国全#联系人$&教授& 1^M3CJ"BK4KDUK3Ef$5(>E@B
"$+
A
诱变选育链霉菌 [BA 菌株
涂"璇&李江怀&涂晓嵘&涂国全
#江西农业大学 生物科学与工程学院&南昌 ((%%.#$
摘"要"以链霉菌 *%$1$% 为出发菌株&经+,-
$
诱变处理&获得高产突变株 实验结果表明"+,-
$
处理$% MCE对菌
株的致死率可达 !(h&%g&突变率高达 &.h&(g&经过摇瓶筛选获得高产突变株 $%1$1&.!&产链霉素能力达到
&h.%. M47MZ&比出发菌株提高了 (*h5#g 经传代培养考察&该突变菌株具有良好的遗传稳定性
关键词"亚硝酸诱变)链霉菌 *%$)抗药性致死突变标记
中图分类号"8((""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%(% ?%#
!:400/./; 2787"(-7&)9$(+[BA HG /.F42315:.IJ3F5F.2/
YX\K3E&Z_SC3E41;K3C&YX\C3D12DE4&YXQKD1UK3E
#6DJ@4@DF/CDJD4CL3J0LC@EL@3EI E^4CE@@2CE4&SC3E4VCP42CLKJBK23JXEC[@2GCBH&,3EL;3E4((%%.#&6;CE3$
*H1F45:F"+C4;1HC@JI MKB3EBGN@2@I@2C[@I F2DM0B2(-6&)8$(+*%$1$% 9HMKB34@E@GCGNCB; ECB2DKG3LCIh
Y;@2@GKJBGG;DN@I B;3BB;@4@EB3MHLCE12@GCGB3EL@MKB3BCDE3JF2@UK@ELHDFB;@76"(-6&)8$(+*%$ B2@3B@I 9H
ECB2DKG3LCI NCB; $% MCEKB@GN3GKA BD&.h&(g 3EI B;@J@B;3J23B@N3G!(h&%gh+C4; 3EBCFKE43JGK91
GB3EL@A2DIKLCE4MKB3EB$%1$1&.! N3GCGDJ3B@I CE B;@GL2@@ECE4&3EI B;@HC@JI DF3EBCFKE43JGK9GB3EL@
2@3L;@I &h.%. M47MZ&N;CL; N3G(*h5#g ;C4;@2B;3E B;3BA2DIKL@I 9HCBGA32@EBGB23CEhY;@MKB3EB
GB23CE@I GB39J@9HLKJBK2@I FD2M3EH4@E@23BCDEG>
L0G K24I1"ECB2DKG3LCI MKB3BCDE)76"(-6&)8$(+*%$)2@GCGB3EL@1L;@MCL3JMKB3BCDE3JJ39@J
""植物病原真菌引起的植物病害是植物的第一
大病害&每年给粮食生产造成巨大的损失 多年的
应用实践证明&生物农药对人畜安全&不污染环境&
病菌产生抗药性的速度极其缓慢&经济效益和社会
效益十分可观
""李昆太等*&+在以棉花枯萎病菌为靶目标开展
农抗生产菌的分离筛选研究中&从土壤中分离筛选
到一株链霉菌&简称为链霉菌 *%$&其产生的生物活
性物质对棉花枯萎病菌有较强的抑菌活性 发酵
液中生物活性物质在 A+( j&$ 条件下稳定&耐热性
强&在 &%% i处理 &% ;&&$& i处理 & ;&其抑菌活性
不会减弱 从该菌的发酵产物中分别分离提取(纯
化其抗细菌和抗真菌活性物质单体组分&经紫外(
红外(质谱和核磁共振谱测定结果表明&抗细菌活
性物质为 种氨基酸组成的环肽&相对分子质量
& $5h5#&分子式6
5$
+
!.
,
&$
-
&*
&为国内首次发现和
鉴定&命名为,红谷霉素- *$+ )所产抗真菌活性物质
为一种新型大环内酯类抗生素*(+ 链霉菌 *%$ 所产
抗真菌活性物对霉菌(酵母菌和 &. 种植物病原真菌
的半数效应浓度# 6^
#%
$为 %h$5 j.h&( M47Z(%g
效应浓度 6^
%
为 &h# j$%h*! M47Z 其中对纹枯
病菌和水稻稻瘟病菌的 6^
#%
和 6^
%
分别为 &h!! j
&$h#& M47Z和 *h%( j$h(5 M47Z 这些初步研究
结果已显示了其作为杀菌剂的广阔前景&但是链霉
菌 *%$ 产抗真菌活性物质的产量较低&还不能达到
工业生产的要求 本研究以庆大霉素为敏感抗生
素&采用抗药性致死突变亚硝酸诱变筛选模型&对
链霉菌 *%$ 孢子进行诱变筛选&以期获得其产抗真
菌活性物质的高产突变株
C?材料与方法
CMC?材料
&h&h&"菌种
""供试菌种链霉菌 *%$#76"(-6&)8$(+*%$$ 由江西
农业大学生物科学与工程学院应用微生物实验室
分离筛选获得&甘油冻存管保存)抑菌测定指示菌
种桔青霉#2(1#$#/#0)$#6"#10)$由笔者所在实验室
保存
&h&h$"培养基
""供试菌培养基(指示菌培养基#$%% 4&蔗糖 $% 4&琼脂 &! 4&水 & %%% MZ A+自然
""种子培养基和发酵培养基均为本实验室自行
设计筛选的培养基*.+
&h&h("原料和试剂
""庆大霉素购自上海华美生物工程公司)纳他霉
素#,3BM3HLCE$#含量 #%g$购自北京东方瑞德生物
技术有限公司)玉米粉(玉米淀粉(黄豆饼粉#均为
市售$)c,-
(
(,36J(c
$
+<-
.
(无水乙醇(,3,-
$
均为
国产分析纯)+
(
<-
.
缓冲液#A+!h5$(醋酸 醋酸钠
缓冲液#A+.h#$均为自制
CMA?方法
&h$h&"诱变出发菌株的自然分离
""采用琼脂菌落法筛选 将链霉菌 *%$1$% 菌株
斜面制备成单孢子悬液&稀释涂布于 待平板上长出单菌落&用打孔器将单菌落打孔形成
琼脂块&置于空白平皿内&保持一定湿度培养 将
小室中培养好的单菌落琼脂块置于双层检测平板&
测定抑菌圈大小&挑选抑菌圈较大的菌落接于 斜面 摇瓶筛选并检测发酵液中抑真菌活性物质
的生物效价
&h$h$"庆大霉素对出发菌株孢子致死浓度的测定
""将制备好的出发菌株孢子悬液涂布于含不同
浓度庆大霉素的察不同平板上的菌落数&并记录不同抗生素作用浓
度 凡是在前一个含低浓度庆大霉素平板上长出
菌落而在后一个含较高浓度庆大霉素平板上未长
出菌落的&后一浓度即为庆大霉素对出发菌株的孢
子的致死浓度
&h$h("+,-
$
诱变剂量的测定*#+
""取制备好的菌株 $%1$ 单孢子悬液& MZ&加入
A+.h# 的醋酸缓冲液$ MZ及%h& MDJ7Z,3,-
$
溶液
& MZ&使最终单孢子悬液处理浓度为%h%$# MDJ7Z&
置于(* i水浴锅上分别振荡处理 %(#(&%($%((% 和
.% MCE后&加入%h%* MDJ7ZA+ !h5 ,3
$
+<-
.
溶液
$% MZ&使 A+下降至 5h! 左右以终止反应*5 ?*+
""分别取经 ,3,-
$
诱变处理不同时间的孢子原
液各%h& MZ涂布在含致死浓度的庆大霉素 板上和不含庆大霉素 培养 ( j. I&至长出成熟菌落&计算致死率和突
变率
突变率#g$ l
+,-
$
处理的孢子液在含庆大霉素平板上生长的菌落数
未经+,-
$
处理的孢子液在不含庆大霉素平板上生长的菌落数m&%%g)
致死率#g$ l&?
+,-
$
处理的孢子液在不含庆大霉素平板上生长的菌落数
未经+,-
$
处理的孢子液在不含庆大霉素平板上生长的菌落数m&%%g
&h$h."抗药性突变株的制备
""取制备好的菌株 $% 单孢子悬液& MZ&加入 A+
.h# 的醋酸缓冲液$ MZ及%h& MDJ7Z,3,-
$
溶液
& MZ&使最终单孢子悬液处理浓度为%h%$# MDJ7Z&
置于 (* i 水浴锅上振荡处理 $% MCE 后& 加入
%h%* MDJ7ZA+!h5 ,3
$
+<-
.
溶液$% MZ&使 A+下降
至 5h! 左右以终止反应 取诱变后的孢子悬液
%h& MZ涂布于含致死浓度的庆大霉素的 上&(% i培养 ( j. I&生长出的单菌落即为庆大霉
素抗性突变株&计算菌落数并将单菌落挑接于 斜面上(% i培养 # j* I&待斜面孢子丰满&置于
. i冰箱保存
&h$h#"抗药性突变株高产菌株的筛选
""&$ 初筛"将突变株接入存&同时将这些菌株挑菌块分别接种于.% MZ发酵
培养基中&(% i($%% 27MCE回转式摇床振荡培养
&.. ;后&取样用无水乙醇浸提$. ;&并进行生物活
性检测
""$$ 复筛"通过活性比较&选出活性比较高的菌
株作为初筛入选菌株进行二级摇瓶发酵复筛&并进
行生物活性检测
&h$h5"遗传稳定性实验
""将复筛得到的高产突变株连续传代 # 次&摇瓶
&(
"第 # 期 涂"璇等"+,-
$
诱变选育链霉菌 *%$ 菌株
发酵并进行生物活性检测
&h$h*"链霉菌 *%$ 所产抗真菌活性物质生物效价
测定%%%一剂量法*!+
""发酵液效价的标定以 ,3B3MHLCE 作为对照抗生
素&采用一剂量法在桔青霉指示菌平板上进行抑菌
测定&以对照抗生素浓度为纵坐标&以校正后的抑
菌圈直径为横坐标&得到对照抗生素的标准曲线和
线性回归方程 链霉菌 *%$ 发酵液用无水乙醇稀释
浸提(离心 上清液稀释到一定倍数后&作为抑菌
测定液&按照对照抗生素标准曲线的制备方法求得
发酵液的抑菌圈直径平均值的校正值&再根据相应
标准曲线和发酵液试样的稀释倍数&求得每毫升试
样所含抗真菌活性物质的效价
A?结果与讨论
AMC?标准曲线的测定
""分别配制 &%(&#($%($# 和(%
#
47MZ的 ,3B3MH1
LCE标准品&采用一剂量法在指示菌平板上测定其抑
菌圈大小 以对照抗生素浓度为纵坐标&以校正后
的抑菌圈直径为横坐标&得到对照抗生素的标准曲
线和线性回归方程&如图 & 所示
图 C?$5F5JG:./标准曲线的测定
T.;=C?!F5/I54I1:34N0127724J56I0-GI0
:2/:0/F45F.2/27$5F5JG:./
AMA?出发菌株的自然分离
""对链霉菌 *%$1$% 单孢子悬液进行稀释并涂布
于 挑接了不同类型的菌落 $( 个&以桔青霉为指示
菌&测定其抑菌圈&按抑菌圈直径进行分布频率统
计&绘制频率分布图&如图 $ 所示 从中挑取抑菌
圈较大的 &# 个菌株进行摇瓶筛选&结果选出编号
$% 菌株 #效价为 &h%$% M47MZ$ 作为诱变出发
菌株
图 A?菌株 [BAWAB 自然选育抑菌圈的频率分布
T.;=A?T40P30/:G 27./-5H.F5F.2/Y2/027
1F45./[BAWAB /5F34561060:F.2/
AMQ?庆大霉素对菌株 ABWA^ 孢子的致死浓度测定
""表 & 为庆大霉素对 $%1$ 菌株孢子的致死率的
影响 由表 & 可知&.
#
47MZ的庆大霉素为菌株 $%1
$ 抗药性致死突变标记浓度
表 C?庆大霉素对菌株 ABWA^ 孢子的致死浓度测定
D5H60C?%0/F5JG:./60F-56:2/:0/F45F.2/F01F27
1F45./ABWA^ 192401
"
#庆大霉素$7
#
#
4!MZ
?&
$
菌落数7
#个!MZ?&$
致死率7
g
%
&h5% m&%

%
&
&h$. m&%

$$h#%
$
*h# m&%
!
#%h(&
(
&h$! m&%
!
$h%5
. % &%%h%%
AMR?"$+
A
诱变剂量的测定
""通过 # 种不同时间 +,-
$
处理对 $%1$ 菌株孢
子的诱变作用&菌落计数并分别计算 +,-
$
对孢子
的致死率和抗药性致死突变率&结果见表 $ 由表 $
可知"+,-
$
处理$% MCE对菌株 $%1$ 孢子的致死率
可达 !(h&%g&突变率高达 &.h&(g&以此为最佳诱
变条件
""+,-
$
对菌株 $%1$ 孢子的致死作用和诱变
作用见图 ( 由图 ( 可知"随着 +,-
$
处理时间
的增加&菌株 $%1$ 的诱变致死率逐渐上升&当
剂量达到.% MCE时&致死率达到 &%%g&处理时间
和致死率基本上呈线性关系
$( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 A?"$+
A
处理不同时间对 ABWA^孢子的致死率与突变率
D5H60A?X0F-565/IJ3F5F.2/45F01271F45./ABWA^
192401F405F0IHG /.F42315:.I5FI.7040/FF.J0
处理时间7
MCE
存活率7
g
存活率
的对数
致死率7
g
突变率7
g
% &%% $h%% % %
# **h5! &h! $$h($ $h&!
&% ..h*5 &h5# ##h$. *h&&
$% &5h% &h$( !(h&% &.h&(
(% 5h$$ %h* (h*! .h&$
.% % % &%%h%% %
图 Q?"$+
A
对菌株 ABWA^ 孢子的杀菌作用和诱变作用
T.;=Q?#70:F1271F04.6.Y5F.2/5/IJ3F5F.2/27
/.F42315:.I2/F-01F45./ABWA^
AM@?抗药性突变株的摇瓶初筛结果
""在含致死浓度的庆大霉素平板上分离得到 $!#
株抗性突变菌株&通过摇瓶筛选分别测定各菌株产
抑真菌生物活性物质的生物效价&以未诱变的出发
菌株的摇瓶发酵的平均效价为 &%%g&分别求出抗
药性突变株相对产素单位 抗性突变株产量分布
见图 . 由图 . 可知"分别以相对产素单位 %1&&%
为未突变型&相对产素单位在 % 以下为负突变型&
相对产素单位在 &&% 上为正突变型&其中正突变株
约占 &#h*#g
AMV?抗药性突变株的摇瓶复筛结果
""根据摇瓶初筛结果选取比出发菌株产素单位
提高 &#g以上的 $$ 株抗药性突变株进行摇瓶复
筛&结果见表 ( 由表 ( 可知"菌株 $%1$1&.! 产抑
真菌生物活性物质的生物效价达到&h.%. M47MZ&
比出发菌株提高了 (*h5#g
AM[?遗传稳定性实验结果
""将复筛获得的菌株 $%1$1&.!连续传代 #次&分别
摇瓶发酵后测定其效价&结果见表 . 表 . 结果表明"
代间效价差异不明显&证明该突变株遗传稳定性较好
图 R?抗药性突变株相对产量分布频率
T.;=R?_.1F4.H3F./; 740P30/:G 27F-04065F.N0
G.06I27;0/F5JG:./W401.1F5/FJ3F5/F1
表 Q?抗庆大霉素突变株摇瓶发酵产抗真菌活性物质
检测结果
D5H60Q?*/F.73/;.13H1F5/:0G.06I27;0/F5JG:./W
401.1F5/FJ3F5/F1HG 704J0/F5F.2/
序号 突变株编号
发酵单位7#M4!MZ?&$
重复 & 重复 $
平均发
酵单位7
#M4!MZ
?&
$
相对发
酵单位7
g
6c $%1$ &h%$! &h%&$ &h%$% &%%
& $%1$1&.! &h(# &h.&( &h.%. &(!
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&# $%1$1$. &h&!5 &h&*. &h&!% &&#
&5 $%1$1&. &h&5$ &h&. &h&*! &&#
&* $%1$1&!( &h&5! &h&5% &h&5. &&.
&! $%1$1#! &h&#. &h&5$ &h&#! &&(
& $%1$1$* &h&$& &h&%( &h&&$ &%
$% $%1$1 &h%5$ &h%!! &h%*# &%#
$& $%1$1$%& &h%*5 &h%*% &h%*( &%#
$$ $%1$1.# %h!$ %h!.# %h!(* !$
((
"第 # 期 涂"璇等"+,-
$
诱变选育链霉菌 *%$ 菌株
表 R?遗传稳定性实验结果
?D5H60R?S0136F127./-04.F0I1F5H.6.FG??M4!MZ
C`
编号 第 & 代 第 $ 代 第 ( 代 第 . 代 第 # 代
& &h(. &h(( &h.%* &h.&$ &h.%
$ &h.%% &h(! &h.%% &h(. &h(5
( &h.&& &h.$% &h.&( &h(# &h(%
平均值 &h.%$ &h.%. &h.%* &h.%% &h(!
Q?结?论
""&$ +,-
$
的处理时间与链霉菌 *%$诱变出发菌株
的致死率之间存在明显的剂量效应关系&随着+,-
$
处理时间的延长&致死率逐渐提高 当 +,-
$
处理
$% MCE时&致死率可达!(h&%g&突变率高达&.h&(g&因
此选择作用$% MCE作为最佳+,-
$
诱变剂量
""$$ 链霉菌产抗生素能力与抗生素抗性基因之
间的对应关系是目前抗生素科研领域的一个研究
热点 采用.
#
47MZ庆大霉素致死标记&获得了链
霉菌 *%$ 抗药性突变株&进一步从庆大霉素抗性突
变株中筛选出高产菌株 $%1$1&.!&其产抗真菌活性
物质摇瓶发酵单位达到了&h.%. M47MZ&较诱变出
发菌株的摇瓶发酵单位 &h%$% M47MZ提高了
(*h5#g 经传代培养考察&该突变株具有良好的遗
传稳定性
""($ 采用抗药性致死突变标记的 +,-
$
诱变筛
选模型可以获得产抗真菌活性物质的链霉菌 *%$ 高
产菌株
参考文献"
*&+"李昆太&黎循航&刘姝&等>*%$ 生物防腐剂对细菌霉菌和酵母
菌类抑菌效果的初步测定*S+>江西农业大学学报&$%%$&$.
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H@3GBG*S+>PLB3P42CLKJBK23@XEC[@2GCB3BCGSC3E4VC@EGCG",3B0LC
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化学结构鉴定*S+>福建农林大学学报&$%%*&(5#($"(%*1(&&>
O;DE4bCE&YDE4\C3DBC3E&0KE ]K;KC&@B3J>_I@EBCFCL3BCDE DFL;@M1
CL3JGB2KLBK2@DF3EBC93LB@2C3JF23LBCDE 0$ A2DIKL@I 9H76"(-6&)8$(+
*%$*S+>SDK2E3JDF)K C`3E P42CLKJBK2@3EI )D2@GB2HXEC[@2GCBH",3B
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的初步研究*S+>江西农业大学学报&$%%#&$*#.$"#&*1#$%>
]K3E bCE&\K@\CKHK3E&YK QKDUK3E>PGBKIHDE B;@M@3GK2@M@EB
DFB;@FKELBCDE3J42DKAGDFB;@9CD3LBC[@LDMADKEI A2DIKL@I 9H
76"(-6&)8$(+*%$*S+>PLB3P42CLKJBK23@XEC[@2GCB3BCGSC3E4VC@EGCG"
,3B0LC^ I&$%%#&$*#.$"#&*1#$%>
*.+"刘金国&刘学铭&程新&等>响应面法优化链霉菌 *%$ 产抑真菌
物质生料发酵培养基*S+>江西农业大学学报&$%%!&(%#&$"
&(&1&(#>
ZCK SCE4KD&ZCK \K@MCE4&6;@E4\CE&@B3J>-ABCMC:3BCDE DFLKJBK2@
M@ICKMFD23EBC1FKE4KGLDMADKEI A2DIKL@I 9H76"(-6&)8$(+*%$ 9H
M@3EGDF2@GADEG@GK2F3L@M@B;DI KEI@2KEGB@2CJC:@I LDEICBCDE*S+>
PLB3P42CLKJBK23@XEC[@2GCB3BCGSC3E4VC@EGCG",3B0LC^ I&$%%!&(%
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*#+"施巧琴&吴松刚>工业微生物育种学*b+>北京"科学出版社&
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*5+"杨东靖&陈冠群&陈巍&等>链霉素抗性突变"纳他霉素高产菌
株的选育研究*S+>微生物学通报&$%%(&(%#.$"$1($>
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GCGB3EL@MKB3BCDE"3GBKIHDE B;@92@@ICE4DF;C4; E3B3MHLCE1A2D1
IKLCE4GB23CE*S+>bCL2D9CDJD4H&$%%(&(%#.$"$1($>
**+"牛莉娜&葛翠凤&葛绍荣>链霉素抗性筛选井冈霉素高产菌株
的研究*S+>安徽农业科学&$%%*&(##$!$"!(%1!($>
,CK ZCE3&Q@6KCF@E4&Q@0;3D2DE4>0BKIHDE B;@0B2@ABDMHLCE 2@1
GCGB3EL@GL2@@ECE4DF;C4;1HC@JI GB23CE DFSCE443E4MHLCE*S+>SDK21
E3JDFPE;KCP42CLKJBK23J0LC@EL@G&$%%*&(##$!$"!(%1!($>
*!+"国家药典委员会>中华人民共和国药典"二部*b+>北京"化学
工业出版社&$%%#"附录 \_>
.( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"