全 文 ：第5卷第2期
2007年5月
生物加工过程
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改性胶原蛋白膜用于大肠杆菌EP8—10组合固定化
胡永红，汤天羽，周 华，沈树宝
(雨京工业大学制药与生命科学学院，南京210009)
摘要：探计了不同方法对肢原蛋白膜进行改性处理，结果表明经过甲醛处理过的胶原蛋白膜具有良好的通透性
及耐水性能、将胶原蛋白膜与卡扛胶凝腔颗粒形成组争固定化体系，用于大肠杆菌El’8—10固定化，乏冬氨酸转氨
酶活回收率达到了913％，反应20批次后，酶活回收率仍在8【1％以上，
关键词：胶原蛋白膜；组合固定化；太肠杆菌
中图分类号：Q8142 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2007)02—0073—04
IntegratedimmobilizationofE．cD席EP8-10bymodifiedco¨agenmembrane
HLYong-hong，‘n～NGTian-yu，ZHOUH11a，SHENShu_bao
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Abstract：DiⅡcrentmethodsrelatedothemodj6衄tionofc 儿agenmembranewcJ℃I：ljscussedThc011a—
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可以用于微生物(或酶)同定化的膜多种多样，
如醋酸纤维素膜”、棉纤维膜”1、明胶膜”J、聚阿烯
微孔膜41等。胶原蛋白膜具有稳定性好，安全无毒
和良好的生物相容性等特点，制膜原料——胶原是
从牛筋中挫取出来的具有蛋白质结构的天然牛物
材料，原料易得”’，然而胶原蛋白膜存在耐水性差、
易溶胀溶解的缺点。在水相反应体系中，长时间与
水接触，易溶于水，造成胶原蛋白膜固定化体系无
法反复利用。为了克服f述不足，增加膜的耐水性
能，必须对膜进行政性与修饰。不同的改性方法使
膜的物理化学性质、结构及性能发生不同的变化，
选取合适的改性方法并成功应用于微牛物(或酶)
的固定化孥关重要。本文}要探讨了胶原蚩白膜
的改件力‘法，并将改性胶原蛋白膜用r大肠杆菌
EP8—10的幽定化研究巾。
1材料和方法
1 1试剂
胶原蛋[』膜，自制；硫酸铁、三氧化一铬、甲醉．
十水硫酸钠、浓硫酸、氯化钠、碳酸钠、硫酸氨(分析
纯)；亚苄基海因；氢氧化钠(分析纯)；二甲亚砜(分
收稿日期：2006一lO一3l
基金项目：江苏省自然科学基垒资助项目(BK2002017)；江苏省高棱自然科学基金资助项目((】】KJB530003)
作者简介：胡永红(1968一)，士，江苏如皋人，博士，教授，研究方向：工业生物技术；E哪all：hyll@qutcduc”
万方数据
生物加工过程
析纯)；无水氯化铁(化学纯)：冰醋酸(分析纯)；卡
拉胶、海藻酸钠。
1．2 菌种
大肠杆菌￡∞，#FP8．10⋯。
1．3仪器
HH一2数显恒温水浴锅(国华电器有限公一J)，
752紫外可见分光光度计(上海分析仪器厂)，P／
AcE5000高效毛细管电泳仪(BEcKMAN)，JJ一1精
密增力电动搅拌器(国华电器有限公刊)，HYG—IIa
迥转式恒温调速摇瓶祀(上海欣蕊自动化有限公
司)。
1．4膜改性方法
对胶原蛋白膜进行了铬络合物和甲醛改性，操
作方法详见文献：7]。
1．5固定化方法
卡拉胶同定化方法”：取1g卡拉胶，溶解在
25mT．牛理盐水中，配制成4％的卡拉胶溶液；取5g
大肠杆菌湿菌泥，力¨人5mL的生理盐水，制成菌悬
液，50口c下与卡拉胶溶液混合，冷却得凝胶。jf将
凝胶置于o．3m01／L氯化钾溶液中固化处理4h．切
成3mm×3mm×3mm的颗粒，即碍固定化颗粒。
海藻酸钙同定化方法93：版1g海藻酸钠，小断
搅拌力¨入到25mL生理盐水中，完全溶解后静置
30面n；取5g大肠杆菌湿菌泥，加入5n1L的生理盐
水，制成闰悬液，与海藻酸钠溶液均匀混合，用
10mL移液管挤混合物于O．2moL／Lcacl：溶液中，
将海藻酸钙凝胶球在cacI，溶液中同化20min，再于
4℃冰箱中静置，即得固定化颞粒。
膜固定化力‘法：分别将采用上述两种固定化方
法制得的固定化颗粒装入胶原蛋白膜中。
1．6酶转化反应条件
底物组成为：L一天门冬氨酸(￡一Asp)为氟基供
体，苯丙酮酸(PPA)浓度O．10～02nluL／I．，L—Asp
与PPA摩尔比为1l：l，5’一磷酸吡哆醛浓度为100
“moL／L，氨水调pH8．5，反应温度为37℃”⋯。
1 7分析方法
苯丙氨酸(￡一1)he)的定量测定：采用毛细管电
泳方法测定”“。
人冬氨酸转氨酶酶活力的测定”。：lg湿细胞
力¨人20mL底物溶液中，f37℃反应lh，然后取样
测定PPA量。一个酶活单位“u”定义为每h消耗1
¨moIPPA所示酶量。
膜通透性的测定：采用苯丙酮酸溶液在膜两侧
第5卷第2期
通过浓度差扩散检测胶原蛋白膜的通透件：胶原蛋
白膜内加3mL质量浓度约为15g／mL的苯丙酮酸
溶液，置于装有27mT蒸馏水的三角瓶小，150r／
mn—F振荡，每隔一定时间测定蒸馏水，j，苯丙酮酸
的含量。苯丙酮酸含量的检测采IL|jFe“法显色”。
2结果与讨论
2 1 改性胶原蛋白膜通透性的比较
通透性是影响膜固定化技术应，L}j的关键。如果
膜的通透性过小，底物分子不能顺利进入膜山与牛物
催化剂(酶或细胞)充分接触反应，从而影响生物催
化活性．丰H反，如果膜的通透性过火，易造成微生物或
酶从胶原蛋白膜中泄漏或脱落，影响固定化效果。
交验中采用质量浓度为5∥L的c正0。络合物
和8g／L的甲醛溶液对胶原蛋白膜进行改性处理。
测定膜对苯丙酮酸的通透率，结果如图l所示。经过
甲醛改性过的胶原蛋白膜与直接用水浸泡的胶原蛋
白膜内外的苯丙酮酸浓度较为接近，表明经甲醛改性
过的胶原蛋白膜与直接用水浸泡的胶原蛋白膜通透
性褶当，较经过铬络合物改性过的膜对苯丙酮酸的通
透性高，且改性后的胶原蛋[J膜，耐水性能明冠提高，
长时间浸于清水中未发生膜溶胀、溶解现象。由此可
见，经过甲醛改性后的胶原蛋白膜不仅具有良好的通
透件，而且耐水性能明艟提高。
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圈l不同改性胶原蛋白膜对苯丙酮酸通透性的影响
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2．2单一膜固定化工艺研究
将改性胶原蛋白膜用于同定化富含天冬氨酸
转氨酶的E．c。“EP8—10菌体。实验表明，来改-肚胶
万方数据
万方数据
76
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生物加工过程
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图4铬改性胶原蛋白膜与凝胶包埋形成的组合固定
化体系对天冬氨酸转氨酶活力的影响
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图5 甲醛改性胶原蛋白膜与凝胶包埋的组合固定
化技术对夭冬氨酸转氢酶活力的影响
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第5卷第2期
水性及通透性良好的甲醛改性胶原蛋白膜，能够荷
代胶原蛋白膜，实验过程tlt甲醛处理改性过的胶原
蛋白膜完好无损，未见溶胀现象。同时，甲醛改性
胶原蛋白膜与卡拉胶组成的凝胶颗粒形成了良好
的组合固定化体系，灭冬氨酸转氯酶的酶活【旦】收率
达到r91．3％．反应20批次后，酶活回收率仍在
80％以上，解决了单包埋体系存在的不足，具有很
好的实际应用前景。
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