全 文 ：!"苯丙氨酸生产的代谢工程研究
贾红华，韦 萍，何冰芳!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 #$%%%&）
摘 要：!"苯丙氨酸是一种重要的食品和医药中间体。工业上一般采用酶法和发酵法来生产 !"苯丙氨酸。代谢工
程的兴起，使得更加理性的改造菌株成为可能，这更加促进了发酵法的广泛应用。主要介绍了代谢工程在 !"苯丙
氨酸生产菌的改造中的应用情况，其中涉及苯丙氨酸生物合成途径中相关基因及其酶的调控、中央代谢途径的改
造和芳香族氨基酸生物合成支路的修饰。并探讨了将来的发展前景。
关键词：芳香族氨基酸；!"苯丙氨酸；代谢工程
中图分类号： ’(&## 文献标识码： ) 文章编号：$*+#",*+-（#%%.）%#"%%%-"%/
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一，在食品、医药领域具有广泛的应用，其中最有潜
力的应用领域是合成新型甜味剂阿斯巴甜（)LN8E"
M8FA，简称 );R）及其衍生物尼尔甜（HA3M8FA）。
!"苯丙氨酸的制备方法主要有提取法、化学合
成法、酶法和发酵法四种［$］。其中提取法因为含量
低，很少采用。而化学合成因产品光学纯度低和催
化剂成本较高还没有大规模工业化的报道。目前一
般采用酶法和发酵法来生产 !"苯丙氨酸，其中酶法
又有肉桂酸"苯丙氨酸裂合酶法和苯丙酮酸"天冬氨
酸转氨酶法。由于野生菌不会直接大量产生 !"苯
丙氨酸，高效的 !"苯丙氨酸生产菌株多采用诱变和
基因工程手段相结合来改变野生菌的芳香族氨基酸
生物合成的相关代谢流量而获得。本文将介绍有关
加大 !"苯丙氨酸生物合成的代谢流量的策略及研
究进展情况。
! 收稿日期：#%%."%,"$#
基金项目：国家 &+,项目（#%%,?=+$*%%%.）和国家自然科学重点基金项目（#%,,*%$%）资助。
作者简介：贾红华（$&+&"），男，博士生，研究方向：酶工程
联系人：何冰芳，’A@：%#/"-,/-+,,*
R8G #%%.
· - ·
生 物 加 工 过 程
?6<4ALA 037E48@ 3> =<3NE3CALL :45<4AAE<45
第 #卷第 #期
#%%.年 /月
万方数据
! 代谢工程
代谢工程（!"#$%&’() *+,(+""-(+,），也称途径工程
（.$#/0$1 *+,(+""-(+,），是利用重组 234技术及诱变
等手段对细胞中酶的表达、转运和调节功能进行操
控的科学［5］。代谢工程的实质是应用工程的原理来
设计和分析代谢途径，最终改变部分代谢途径或流
量。它是化学工程、计算机科学、生物化学和分子生
物学多学科交叉融合的结晶。目前，代谢工程已被
广泛应用于工业生产菌的改良等方面。
" 苯丙氨酸的生物合成
567 生物合成途径（图 7）
.*.，磷酸烯醇式丙酮酸；*8.，89磷酸赤藓糖；24:.，;9脱氧959
酮9<9磷酸庚酮糖酸；2:=，;9脱氢奎宁酸；2:>，?9脱氢莽草酸；>:@A，
莽草酸；>;.，;9磷酸莽草酸；*.>.，;9磷酸9?9烯醇式丙酮酸莽草酸；
B:4，分支酸；..4，预苯酸；..C，苯丙酮酸；./"，D9苯丙氨酸；*7，
24:.合成酶；*5，2:=合成酶；*;，2:=脱水酶；*8，>:@A脱氢酶；
*?，>:@A激酶 @ E @@；*F，*.>.合成酶；*<，B:4合成酶；*G，B:4变位
酶 E ..4脱水酶；*H，氨基转移酶。
图 7 D9苯丙氨酸生物合成途径及其相关调控
I(,67 D9J/"+1’$’$+(+" %(&K1+#/"K(K J$#/0$1 $+L -"’$#"L -",M’$#(&+
尽管 D9苯丙氨酸为人类必需氨基酸，但大多数
植物和微生物具备合成 D9苯丙氨酸的能力。目前
至少已发现 7;种微生物的苯丙氨酸合成途径，且均
非常相似。在 ! 6 "#$% 中，D9苯丙氨酸的一般生物合
成途径为（图 7）：由 89磷酸赤藓糖（*8.）和磷酸烯醇
式丙酮酸（.*.）缩合形成 59酮9;9脱氧929阿拉伯庚
酮糖酸9<9磷酸（24:.）开始，并把这七碳中间代谢
物转化为莽草酸（>:@A），然后再转化为分支酸
（B:4），由分支酸合成苯丙酮酸（..C），最后苯丙酮
酸经转氨作用生成 D9苯丙氨酸。
565 相关基因和酶的调控
.*.和 *8.合成 24:.的反应由 ;个 24:.合
成酶同工酶所催化。分别受 D9色氨酸（由 &’#( 表
达）、D9苯丙氨酸（由 &’#) 表达）和 D9酪氨酸（ &’#*
表达）反馈抑制。作为关键反应之一的分支酸转化
为预苯酸的反应依赖于两个不同的分支酸变位酶
（分别由 +,-.，/0’. 表达），并分别受 D9苯丙氨酸和
D9酪氨酸反馈抑制。而莽草酸脱氢酶则受其产物莽
草酸抑制。
除酶水平的调节外，苯丙氨酸的生物合成途径
还存在许多转录水平的调节。但目前生产菌株的改
造涉及转录水平调控方面还鲜有报道［;］。
# D9苯丙氨酸生物合成的代谢工程研究
D9苯丙氨酸生物合成的代谢工程研究主要涉及
两个代谢途径的调控。其一是中央代谢途径，它为
D9苯丙氨酸的生物合成提供原料；其二是芳香族氨
基酸生物合成代谢途径。
;67 中央代谢途径的调控
中央代谢途径是控制中间产物的代谢流量、产
物的形成速率及产率的关键步骤。为高效生产目的
产品，必须对中央代谢途径的相关步骤进行调节控
制。
芳香族氨基酸生物合成途径的共同前体 .*.
和 *8.均来自于中央代谢途径（图 5）［8］。糖酵解途
径会产生 .*.，而 *8.则由磷酸戊糖途径供应。通
过对 ! 6 "#$% 的中央代谢途径的计量分析显示，当该
菌生长在以葡萄糖作为唯一碳源的限制性培养基上
时，大约有 ;NO的 PF.会进入磷酸戊糖途径，但仅
有 ;O的 .*.用于芳香族氨基酸的生物合成［?］。研
究表明仅有当量 .*.供应时，D9苯丙氨酸的理论产
率为 ;NO，当 .*.的供应量加倍，其理论产率将增
5NN8年 ?月 贾红华等：D9苯丙氨酸生产的代谢工程研究 · H ·
万方数据
加到 !"#［"］。为了改善芳香族氨基酸的生产，许多
人采用分子生物学手段对这两个生物合成途径进行
了基因构建及改造，且取得了显著的成绩。
$%&，$’$磷酰基转移系统；("$ )*，"+磷酸葡萄糖脱氢酶；%,-，
转酮醇酶；%./，转醛醇酶；$01，磷酸葡萄糖异构酶；$23，$’$羧化
酶；$4,，丙酮酸激酶；$3,，$’$羧化激酶；$25，$’$合成酶；"($，"+
磷酸葡萄糖；6"$；"+磷酸果糖；(78$，8+磷酸甘油醛；$’$，磷酸烯
醇式丙酮酸；977，草酰乙酸；"$+(:-，"+磷酸葡萄糖酸；;酸核酮糖；;1=!$，!+磷酸核糖；>图 A ! B "#$% 的中央代谢系统
610BA C?:-D./ E?-.=F/15E FG ! B "#$%
8BHBH 增加 $’$的供应量
$’$是涉及几个代谢过程的关键中间体。在野
生型 ! B "#$% 中 $’$的主要消耗者是磷酰基转移酶
系统（$%&）［@］，$’$极易经 $%&生成丙酮酸，其消耗
将会直接影响芳香族途径的代谢流量。如果葡萄糖
吸收过程中产生的丙酮酸能再转化为 $’$，I7J$的
最大理论摩尔产率将可加倍［K］。通过构建一 $’$
羧化酶阴性 ! B "#$% 突变株，切断 $’$到草酰乙酸
的代谢通路，使 L+苯丙氨酸的产量提高了 "倍，但乙
酸和丙酮酸等副产物的产量却增加到 L+苯丙氨酸
产量的 HM倍［N］。
丙酮酸激酶也消耗 $’$，它们分别由 &’() 和
&’(*两个基因编码。通过降低丙酮酸激酶的表达
量，可以增加 +,-.%/0"1-,%23 4& B 和 +0"%$$24 42/1%$%4 的
$’$ 供应量［HM，HH］。最近研究发现，去除任何一个
&’( 基因都未能产生大的影响，但若将两个基因都
去除，可使 I7J$的生产量增加 8倍［HA］。当同时在
该菌株超量表达转酮醇酶（增加 ’O$供应）时，I7J$
的产量则增加 OB!倍［H8］。
在 ! B "#$% 中串联表达 &&4) 和 &"() 基因（见图
A），使 $’$合成酶和 $’$激酶的活性分别提高到宿
主菌的 8BH 和 AB8 倍，I7J$ 的产量可提高 ABH
倍［HO］。如果还同时高水平表达 $’$合成酶还可增
加芳香族氨基酸合成途径中的碳流量，提高 $’$的
供应量，从而超量产生 I7J$，增加 L+苯丙氨酸及其
他多种 L+型氨基酸的产量［H!］。
全局代谢工程（0/F=./ E?-.=F/13 ?:01:??D1:0）就是
通过全局调节网络来控制中央代谢途径的碳流量，
使代谢途径的调控更加理性化［H"］。! B "#$% 的碳储
备调节系统（C5D）通过一个小的 ;P7结合蛋白 35D7
来控制基因表达。35D7可以抑制葡萄糖异生、糖原
生物合成和分解，而激活糖酵解和乙酸代谢等［H@］。
通过阻断碳储备调节因子的 "4,) 基因来增加葡萄
糖异生，减少糖酵解，从而增加胞内 $’$的流量，使
一 ! B "#$% 菌株的 L+苯丙氨酸的产量提高了 A倍［HK］。
8BHBA 增加 ’O$的供应量
转酮醇酶和转醛醇酶是磷酸戊糖途径非氧化阶
段的两个关键酶。’O$是由磷酸戊糖之间经转酮醇
酶和转醛醇酶催化基团转移产生的。迄今，大多数
旨在增加 ’O$供应量的工作都围绕超量生产转酮
醇酶进行。
超量表达转酮醇酶基因（ 1(1)），可以明显提高
! B "#$% 中的转酮醇酶活性和 ’O$的供应量，同时增
加 I7J$的产量［HN］。通过大量产生一抗反馈抑制
I7J$合成酶和转酮醇酶导致进入芳香族氨基酸生
物合成途径的碳流量增加了两倍［AM］。采取扩增
! B "#$% 中 0,#5 和 1(1) 基因，并使两个丙酮酸激酶同
工酶失活，可明显增加 I7J$的产量［AH］。如果同时
表达 1(1) 和 0,#* 基因，则会使 ! B "#$% 的 I7J$的分
泌量增加 OM 倍［AA］。在 6#,’7-/0"1-,%23 8$2103%"23
（L+苯丙氨酸高产菌株）中超量表达转酮醇酶，同样
可增加胞内 ’O$的水平，使芳香族氨基酸的产量提
高!#+AM#［A8］。
中央代谢途径的改变往往会对细胞产生较大压
力。其形成因素包括蛋白质的超量表达和代谢物水
平的波动，而严重影响细胞生长和代谢流。以上研
究需要有很强的代谢调节等方面的知识作支撑。最
近，! B "#$% 中央代谢途径动力学已经建立，这为更合
·HM· 生物加工过程 第 A卷第 A期
万方数据
理指导流量分配奠定了一定的理论基础［!"］。
#$! 芳香族氨基酸生物合成途径的代谢工程
%&苯丙氨酸和 %&酪氨酸生物合成代谢调节机制
的解明，已直接用于指导构建苯丙氨酸高产菌，并取
得了许多显著成果。以下以几种 %&苯丙氨酸生产
菌改造常用的几类为例进行简单介绍。
#$!$’ ! $ "#$% 的代谢调控
通过 ! $ "#$% (&’!选育具有 %&酪氨酸和 %&色氨
酸双重营养缺陷型变异株 )*+,-#，可积累 %&苯丙
氨酸达 .$" / 0 %。继续选育具有 %&缬氨酸结构类似
物抗性变异株 )*+,’1’&2，在 ’23葡萄糖培养基中
发酵 2" 4，可积累 ’.$5 / 0 % %&苯丙氨酸［!2］。67/89:;:
等［!<］将 %&苯丙氨酸生物合成酶系的基因放到温控
启动子的质粒上，导入 ! $ "#$%，通过温度变化，%&苯
丙氨酸最高产量达到 !-$2 / 0 %。将野生型 =>?@合
成酶和抗反馈抑制的分支酸变位酶和预苯酸脱水酶
基因构建入一质粒导入 ! $ "#$% 中进行发酵生产，%&
苯丙氨酸最高产量达到 21 / 0 %［!.］。
#$!$! &’()%&*"+(’%,-. 的代谢调控
AB7C48DE 等［!-］通过对 /’()%&*"+(’%,- 0 $*"+#1(’2
-(3+,-进行 %&酪氨酸营养缺陷型、对氟苯丙氨酸耐
性、2&甲基色氨酸耐性及敏感性的组合育种，从 ’#3
葡萄糖可生产 !’$. / 0 %的 %&苯丙氨酸，其产量提高
了 2$’.倍。增加 / 0 $*"+#1(’-(3+,- 中 =>?@合成酶
基因的拷贝数，%&苯丙氨酸的产量将由 ’5 / 0 %上升
到 !# / 0 %。
通过将乳酸短杆菌染色体 =F>上的预苯酸脱
水酶基因克隆到适当载体上，构建出重组质粒，它能
使受体菌预苯酸脱水酶活性提高 ’2倍，同时使 %&苯
丙氨酸的产量从 "$! / 0 %提高到 ’’$- / 0 %。如果同
时将含有 =>?@基因的重组质粒导入受体菌，则携
带两个相容性重组质粒的重组乳酸短杆菌可将 %&
苯丙氨酸的产量进一步提升到 ’-$! / 0 %［!5，#1］。
将对氟苯丙氨酸耐性的 ! $ "#$% 突变株中的
*’#4、56(7、+8’/ 三个基因导入 /’()%&*"+(’%,- 1$*),-
进行表达，结果所构建的工程菌产 %&苯丙氨酸能力
提高了 !$#2倍［#’］。
#$!$# 9 $ :$,+*-%",- 的代谢调控
将谷氨酸棒杆菌的分支酸变位酶和预苯酸脱水
酶基因克隆在合适的质粒上，并转化相应的谷氨酸
棒杆菌，使重组菌的分支酸变位酶活性增加 ’!倍，
%&苯丙氨酸的产量由 ’# / 0 %提高到 ’5 / 0 %。通过同
时超量表达苯丙氨酸抗性的 =>?@合成酶、分支酸
变位酶和预苯酸脱水酶基因，可使 %&苯丙氨酸产量
达 !< / 0 %［#!］。
GHEI8等［##］报道从 9 $ :$,+*-%",- 克隆了分支酸
变位酶，再将该酶的基因插入 9 $ :$,+*-%",-，%&苯丙
氨酸的产量达 ’5 / 0 %，是基因导入前的 ’$2倍。JIK&
DE等［#"］同时向该菌中导入分支酸变位酶及预苯酸
脱水酶的双酶基因（;6(7 基因），%&苯丙氨酸的产量
再上升到 !# / 0 %。
#$!$" 7"+%3#-8"(+(. 的代谢调控
细菌中可能有两条 %&苯丙氨酸生物合成路线。
在 7"+%3#-8"(+*$(. 中发现了受 %&苯丙氨酸反馈抑制
但却由 %&酪氨酸激活的预苯酸脱水酶，而 %&苯丙氨
酸或 %&酪氨酸对少数 7"+%3#-8"(+(. 种属不显示任何
抑制或激活效应。在一阻断预苯酸脱水酶的 %&苯
丙氨酸缺陷型的 7 $ -(+6*3#$%"* 突变株中，发现存在
另一途径转化预苯酸生产 %&苯丙氨酸，且涉及中间
体苯丙酮酸的合成［#2］。尽管对 7"+%3#-8"(+(. 中芳香
族氨基酸生物合成和调节并不十分了解，但因其独
特的代谢途径引起了代谢工程研究者极大的兴趣。
! 展望
通过对错综复杂的代谢途径的调控已在工业微
生物，特别是氨基酸生产菌的育种上取得了很大的
成就，%&苯丙氨酸的发酵生产也不例外。随着 )6
和 F)L等分析手段与同位素示踪技术的高度发展
与相互结合，为解明细胞中的代谢网络和调控机制
提供了强有力的技术支持［#<］。
大量微生物的基因组全序列的测定，许多微生
物代谢网络的特性和功能，特别是调控机理的逐步
解析［#.］，可望不久可更大程度地应用代谢工程的成
果，如两种代谢途径的协同调控等手段，为低成本的
%&苯丙氨酸等芳香族氨基酸的大规模生产开辟新的
路线。
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·?=· 生物加工过程 第 =卷第 =期
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