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万方数据
·16· 生物加工过程 第4卷第2期
以后人们又相继从多种微生物(包括细菌、放线鬣和
真菌)，多种植物翱动物中分离到了几丁质酶，并对
几丁质酶的理化特性进行了深入地研究∞堪】。近年
来，鉴于兄丁质酶在海洋废料处理以及防治病虫害
方面的巨大利用潜力，它的研究越来越受到重视。
作为大规模生产静凡丁旗酶制荆，在复杂的宣
然环境中保持其稳定性是非常重要的，而在以往报
道的几丁质酶中，其热稳定性都不理想，一般都在
50℃以下，丽且也只在中性出条件下能够稳定保
持酶活力，本课题中L15．2黏质沙雷氏菌所产几丁
质酶在鳓℃之蘸，p珏4。O～lO。0范豳内都能够有效
保持较高的酶活力，可以作为一株优良的出发菌株，
有较好应溺前景。
l材料与方法
l。l菌种
L15．2黏质沙雷氏菌：微生物技术国家重点实验
室傈藏。
1．2产酶培养基[9】
胶体几丁质l％，磁硪氇O．3％，KH2飚O。3％，
M艘4O。05％，CaCl2O。05％，№S040．ool％，pH6。4。
接种量为1％，装液量为70mL培养基于300111L容
积摇瓶孛，予30℃，l∞彩m瓤摇床培养4d。
1．3分离用缓冲液
Bu&r王：甘氮酸一N国珏，p疆9。2，◇．游m盛琵离子
交换用。
Buffer迁：Na2HP04。柠檬酸，p酲7．6，0．02mol忍
分子筛赐。
1．4几丁质酶的分离纯化
1．4．1酶活力的测定
按Monreal[1刚等人的方法，稍加修改，发酵液
10∞O∥min离心后，取上清粮酶液0。5藏，加入l
mL用Na2}{P04．柠檬酸缓冲液调整的1％的膨胀几
丁质，50℃酶解lh，用DNSH妇(3，5。二硝基水杨酸)
法测还原糖(以Ⅳ．乙醮葡萄糖胺计)。在50℃下，
每小时释放出相当于1憋Ⅳ。乙酰葡萄糖胺(NAG)
的还原糖所需的酶量定义为1个黪活力单位(u)。
1．4．2酶的分离纯化
发酵液经10。oO∥赫n离心后去除蓠体蓦p得粗
酶液，粗酶液分别经过硫酸铵25％一75％饱和度沉
淀，75％沉淀后的粗酶液4℃放置过夜，次日lOO∞
∥蕊n离心lO黼n，取沉淀用尽量少的缓冲液I溶
解，4℃透析除盐后通过已被缓冲液I充分平衡的
DEAESephamseF缸tF10w柱，然后使用含有1．omoI，L
N《l的缓冲液梯度洗脱，流速18瑚Uh，280砌检测
紫外吸收测各峰酶活力，再将活力峰超滤，滤液经过
缓冲液基平衡过的se滤蠢exG—l∞层概柱，并爝缓
冲液Ⅱ洗脱，测各峰酶活力。
1．4．3s蹒．PA浅电泳检溅撼1
采用垂直板式不连续电泳，胶厚O．75m，分离胶
质量分数12％，浓缩胶质量分数5％，15mA恒流电泳
l。5h，然后用考马辑亮簸染色，并用乙酸．甲醇脱色。
1．5几丁质酶性质的研究
把经过分离以后的凡丁质酶分别傲最适滋度、
最适pH、热稳定性、pH稳定性、金属离子的影响、相
对分子质量等酶的性馥的研究。
l。6几了质酶的抑菌效果
选取了24株植物致病真菌，将每株真菌孢子液
分别做下述3耪处理：孢子液50驰与600皿缓冲
液混合(作为对照)，孢子液50止与粗酶液(离子交
换层析之蘸)斓皿混合，孢子液50曲与纯酶液
(分子筛后)600吐混合，50℃作用lh，而后倾注上
层半固体平板，72ll后观察各株菌生长状提。
2结果与讨论
2．1几丁质酶的分离纯化
毛15-2尼丁覆酶透过硫酸铵分级沉淀、透析及
DEAEsephamseFa tnow离子交换层析，得到图1。
Ffac娃onNu攒be’
——280nrn处吸光度值，一☆一酶活力
鎏l蔻丁震涟逶过pEA嚣瑶的酶活力及爨壹羹线
Fig．11)IDteinandenzylneactiV畸pattemofcllitinase
pH癌磷毋蹴瓠纛瓣
：
妄
3
≮
穴
痪
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万方数据
2∞6年5月 陈鹃等：黏质沙雷氏菌L15—2几了质酶的分离纯化与性质研究 ·17·
其中有3个组分，第一个穰第三个组分没有酶
活力，只有第二个组分有酶活力，收集活力峰处酶液
进行电泳检测，发现有鼹条蛋渤带，分子量分剃力
22．0kD和40．0kD左右，鉴于进一步用S印hadexG．
1∞分子筛分离鼹个分子量相差接近20．OkD的蛋
白，效果会较突出，故经过分离得到图2。
O 5 lO 15 20 25 30 35
FractiOnNumber
o
董
。
鼍
R
熙
避
——_280猢处吸光度值，一☆一酶活力
图2几丁质酶经过Se岫0100膊的酶活力及蛋白曲线
嚣g．2 p如稔溆af畦d投弘粥act知磅pa牲emofe赫tinasep商蠡ed姆
SephadexG100
可以祷出，蛋白峰和酶活力峰菲常吻合，初步判
断其中含有较少的杂蛋白，经过SDS—PAGE检测，得
瑙图3，在瞧泳图中l为经过Sep|l蠢exGl∞以后的
电泳图像，2为经过DEAEFastnow以后的电泳图
像，可以饕凄l中只有一条带，说明该酶已经纯仡，
获得电泳纯的酶蛋白。在几丁质酶的分离纯化过程
中各个步骤懿数据如表l所示。
l：经过se敝ol∞以后昀电泳豳像；
2：经过D黼E蠡瞄{10w以后的电泳图像
黧3几丁质酶的sD§PA蕊电泳圈像
Fig．3甜leSDs．魏撼Ep砒￡ernofekdnase
表l嚣丁蒺酶的分褰筑稼过程
眺le1 Pu淌c撕onfcllitinase抽m＆删谊疗h删e瑚L15．2
纯化步骤总篙繁量蕊嬲警鬈／mg ×1盯／U，(U，mg)，％ 佰；双
粗酶液 5996 562 93。73 loo l
盐析 l 653 376 227 67 2．422
透析 1287 341 265 60．7 2．827
离子交换层耩11．8 47．68 4懿l 8．5 43+113
超滤 10．2 42．23 4140 7．5 44．169
凝胶过滤层椐 6．5 34．92 5372 6．2 57．3lO
2。2几丁震酶的·睦质
2．2．1分子量测定
良于蛋囊质的迁移率(霆；)与分子量成毖铡关
系，可以通过SDS，PGE测定蛋白分子量。以已知蹑
自分予量的誊赐对数值为纵坐标，霆，值为横坐檬绘
制标准曲线，如图4示，测定该酶的尺，值为
O。4535，从掭准曲线上读出蛉分子量尧4l，314l(D。
通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳验证，该酶为单
亚基蛋自。
5．O
4。8
釜4．6
鼍4．4
4．2
4．O
O e．2 O．瘁 O，6 0。8
尺，
霆4蛋白j差移率与鬃骞分子曩标准鞠线
Fig．41№staIldard0f岫rel矾on幽pbetweenRfand删
2。2．2最适反应湿度的测定
不同反应温度下保温然后测几丁质酶酶活力，
结果如图5艇示，L15—2莹株所产凡丁质酶最适反应
温度为50屯，随着温度的升高，酶活力逐渐降低，在
离予霭℃的时候酶活力迅速下降。
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