全 文 ：第 １２卷第 １期
２０１４年 １月
生 物 加 工 过 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ １２ Ｎｏ １
Ｊａｎ ２０１４
ｄｏｉ：１０ ３９６９ ／ ｊ ｉｓｓｎ １６７２－３６７８ ２０１４ ０１ ００５
收稿日期：２０１３－１０－１５
基金项目：国家重点基础研究发展计划 （９７３计划 ）（２０１１ＣＢ７０７４０５）；材料化学工程国家重点实验室基金；江苏省“青蓝工程”；林业公益性专
项（２０１００４００１）；国家自然科学基金青年基金（２１１０６０６７）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１３＿０４）
作者简介：贺爱永（１９８８—），男，江苏淮安人，博士研究生，研究方向：生物化工；姜 岷（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｍｉｎ＠ ｎｊｕｔ ｅｄｕ ｃｎ
高抗逆高丁比拜氏梭菌的选育及其性能考察
贺爱永，尹春燕，孔祥平，陈佳楠，姜 岷，吴 昊
（南京工业大学 生物与制药工程学院 材料化学工程国家重点实验室，南京 ２１０００９）
摘 要：以抗逆突变株 Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＢ４为出发菌株，通过常压室温等离子体诱变（ＡＲＴＰ），刃天青平板初
筛，摇瓶发酵复筛，筛选出 １株高抗逆高丁比的突变菌株 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１。 发酵结果表明：该突变菌株利用多种
Ｃ源时均展现其高丁醇比的特性，以玉米芯酸解糖液为 Ｃ源时，溶剂产量达到 １０ ５ ｇ ／ Ｌ，丁醇 ８ ０ ｇ ／ Ｌ，丁醇比高达
７６％。 抑制物抗逆性测试结果显示：糠醛和酸类对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 发酵影响较小，酚类物质对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 抑制作用
较强，其中以香草醛为最。 综上所述，Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１是 １株极具潜力的利用木质纤维原料制备丁醇的菌株。
关键词：拜氏梭菌；丁醇；等离子体诱变；木质纤维素
中图分类号：ＴＱ９２１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０１－００２３－０５
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ｍｕｔａｎｔ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｎｄ
ｈｉｇｈ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｕｔａｎｏｌ ｆｏｒ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＨＥ Ａｉｙｏｎｇ，ＹＩＮ Ｃｈｕｎｙａｎ，ＫＯＮＧ Ｘｉａｎｇｐｉｎｇ，ＣＨＥＮ Ｊｉａｎａｎ，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎ，ＷＵ Ｈａｏ
（Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ⁃Ｏｒｉｅｎｔｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１，ａ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ ｏｆ ｂｕｔａｎｏｌ，ｗａｓ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎｄ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｐｌａｓｍａ （ ＡＲＴＰ ） ａｎｄ ｈｉｇｈ⁃ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔ ｈａｄ ａ ｈｉｇｈ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ
ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ Ｗｈｅｎ ｎｏｎ⁃ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｃｏｒｎ ｆｉｂｅｒ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｌｕｔｅ ｓｕｌｆｕｒｉｃ
ａｃｉｄ （ＳＡＨＨＣ） ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ａ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，ｔｏｔａｌ ｓｏｌｖｅｎｔ（ＡＢＥ） ａｎｄ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ １０ ５ ｇ ／ Ｌ ａｎｄ ８ ０
ｇ ／ Ｌ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ７６％ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ｏｆ ｍｏｄｅｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｃｅｔａｔｅｓ，ｆｕｒｆｕｒａｌ ａｎｄ ５⁃ＨＭＦ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｔｏ ＡＢＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｗｈｉｌｅ
ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｗｅｒｅ ｐｏｔｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ＡＢＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ， ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ
ｖａｎｉｌｌｉｎ Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１ ｗａｓ ａ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｓｔｒａｉｎ ｆｏｒ ＡＢＥ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ；ｂｕｔａｎｏｌ；ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ ａｎｄ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｐｌａｓｍａ；ｌｉｇｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｓ
丁醇是重要的 Ｃ４平台化合物之一，被广泛应用
于各种精细化学品的制造中，同时是一种极具潜力
的新型燃料［１－２］。 在能源和粮食危机日益严峻的今
天，面对国际能源安全和环境恶化的多重压力，利
用生物质等可再生资源制备生物丁醇受到了广泛
的关注［３－５］。
生物丁醇发酵通常是利用产丁醇梭菌在严格
厌氧条件下进行的，其主要产物是丙酮、丁醇和乙
醇，因此又被称为丙酮丁醇发酵，简称 ＡＢ 或 ＡＢＥ。
传统发酵中，丁醇、丙酮和乙醇的体积比约为 ６ ∶３ ∶
１，同时还伴随着副产物乙酸和丁酸，释放 Ｈ２和
ＣＯ２，导致底物的转化利用率仅在 ３０％左右［１，６］。 因
此，提高 ＡＢＥ中丁醇的含量，并有效改善底物的转
化率成为近年来丁醇发酵的又一大热点。
目前，在农业、工业和林业等产业中存在大量
的木质纤维原料的废弃物，如秸秆、甘蔗渣和木屑
等［７－８］，而这些木质纤维原料可通过预处理、糖化处
理分解成葡萄糖、木糖等多种糖分，用以发酵［９］。
然而制糖过程中都会产生一些有机酸类、糠醛类和
酚类等抑制物，严重影响微生物的生长与发酵［７］。
目前为止，还没有直接利用未脱毒的木质纤维原料
酸解糖液高效制备丁醇的菌株报道。 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ
ＢＡ１０１是已报道的利用葡萄糖为原料产溶剂最高
的菌株，但是该菌株不能直接利用未脱毒的玉米纤
维水解糖液发酵产丁醇［４］。 笔者所在课题组利用
Ｎ＋离子束诱变筛选得到的 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＢ４，能够直
接利用未脱毒的玉米芯水解液，其总溶剂产量仅达
９ ５ ｇ ／ Ｌ，其中丁醇 ６ ８ ｇ ／ Ｌ［１］。 基于此，笔者通过清
华大学研发的常压室温等离子体诱变（ＡＲＴＰ）育种
机对拜氏梭菌进行诱变，再经高通量筛选平板复
筛，以期选育出高抗逆、高丁比的丁醇生产菌株，并
对其性能进行考察，为进一步选育极具工业化潜力
的产丁醇梭菌奠定基础。
１ 材料与方法
１ １ 菌株
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＢ４［１］，南京工业大学材
料化学工程国家重点实验室选育保藏。
１ ２ 培养基和酸解糖液的制备
１）种子培养基（ｇ ／ Ｌ） 酵母粉 ３，蛋白胨 ５，可
溶性淀粉 １０，乙酸铵 ２，ＮａＣｌ ２，ＭｇＳＯ４ ３，ＫＨ２ＰＯ４ １，
Ｋ２ＨＰＯ４ １，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ １；ｐＨ ６ ０。
２）固体培养基 在种子培养基础上再加琼脂
２０ ｇ ／ Ｌ。
３） 平板筛选培养基 在固体种子培养基中添
加刃天青 ０ ０２ ｇ ／ Ｌ。
４） 发酵培养基 Ｐ２ Ｃ源（葡萄糖、木糖、蔗糖、混
合糖（酸解糖液的模拟体系）和玉米芯酸解糖液，分
消），Ｋ２ＨＰＯ４ ０ ５ ｇ ／ Ｌ，ＫＨ２ＰＯ４ ０ ５ ｇ ／ Ｌ，ＣＨ３ＣＯＯＮＨ４
２ ２ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ ２ ｇ ／ Ｌ，ＭｎＳＯ４·Ｈ２ Ｏ ０ ０１
ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ ０ ０１ ｇ ／ Ｌ，ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０ ０１ ｇ ／ Ｌ，玉米浆 １
ｇ ／ Ｌ。
以上培养基在 １２１ ℃灭菌 １５ ｍｉｎ后备用。
４）玉米芯酸解糖液的制备［１０］ 将粉碎后过
０ ４２ ｍｍ筛的玉米芯纤维在稀 Ｈ２ＳＯ４ 水解的预处
理条件下（质量分数为 ２％的稀 Ｈ２ＳＯ４，反应温度
１２５ ℃，预处理时间 １２０ ｍｉｎ，２００ ｇ ／ Ｌ 的玉米纤维）
得到的糖液，经过 Ｃａ（ＯＨ） ２中和 ｐＨ 至 ６ ０，总还原
糖约为 ５５ ｇ ／ Ｌ。 其经过 １２１ ℃、１５ ｍｉｎ 灭菌后的主
要成分：总还原糖 （ ５５ ２ ± １ ６） ｇ ／ Ｌ、木糖 （ ４４ ６ ±
０ ９） ｇ ／ Ｌ、葡萄糖（４ ７±０ ４） ｇ ／ Ｌ、阿拉伯糖（３ ３２±
０ ３） ｇ ／ Ｌ、可溶性总酚（ＴＰＣ）（２ ７７±０ ４８） ｇ ／ Ｌ、５
羟甲基糠醛（５ ＨＭＦ） （０ ３８ ± ０ ０４） ｇ ／ Ｌ 和糠醛
（ｆｕｒｆｕｒａｌ）（０ ６６±０ １１） ｇ ／ Ｌ。
１ ３ 培养条件
１）活化培养条件 将 １ ５ ｍＬ 种子甘油管，接
种于 ５０ ｍＬ 血清瓶的种子培养基中，装液 ３０ ｍＬ，
３５ ℃厌氧培养 １２ ｈ。
２）种子培养条件 将活化种子液按 ５％的比例
转接到 １００和 ５００ ｍＬ血清瓶的种子培养基中，装液
分别为 ５０ ｍＬ和 ３００ ｍＬ，３５ ℃厌氧培养 １２ ｈ。
３）厌氧瓶发酵条件 将培养 １２ ｈ 后的种子液
按 １０％的比例接种到 １００ ｍＬ 血清瓶的发酵培养基
中，装液量 ５０ ｍＬ，３５ ℃厌氧培养 ７２ ｈ。
４）发酵罐发酵条件 将培养 １２ ｈ 后的种子液
按 １０％的比例接种 ５ Ｌ 的 ＫＦ ５Ｌ 发酵罐（ＫｏＢｉｏ
Ｔｅｃｈ Ｃｏ Ｌｔｄ）中，发酵培养基 ３ Ｌ，搅拌桨转速 １００
ｒ ／ ｍｉｎ，接种后通 Ｎ２１０ ｍｉｎ，３５ ℃厌氧培养至葡萄糖
消耗完，定时取样测定菌体密度（ＯＤ６００）以及冷冻保
存，发酵结束后，测定试样中的乙酸、丁酸和总溶剂
浓度。
１ ４ 选育方法
１）ＡＲＴＰ 诱变 以 Ｈｅ作为放电气体，气体流量
ＱＨｅ为 １０ Ｌ ／ ｍｉｎ，射频功率为 １００ Ｗ，等离子体发射
源与菌膜之间的距离为 ２ ｍｍ，选用的时间范围为
１０～２４０ ｓ，然后将诱变后的菌液稀释涂布至平板，计
算其存活率。
２）高通量初筛 将洗脱后的菌液稀释成不同
浓度涂布于含刃天青的培养基平板上，３５ ℃厌氧
培养 １２ ｈ。 从选择性平板中挑取变色圈较大，生
长较快的菌株，在固体种子培养基平板上划线
纯化。
４２ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
３） 摇瓶复筛 将上述挑选的菌株接种于种子
培养基中，３５ ℃厌氧培养 １２ ｈ 后，以 １０％的接种量
接入含有总还原糖 ３０ ｇ ／ Ｌ玉米芯酸解糖液的 Ｐ２ 发
酵培养基中，通过摇瓶发酵实验进行复筛，根据实
验结果筛选丁醇产量较高的突变株。 对于发酵性
能好的菌株进行 ７次传代实验验证突变菌株的遗传
稳定性。
１ ５ 分析方法
１）菌体密度 利用 ７５２Ｓ 紫外分光光度计（上
海棱光技术有限公司），于 ６００ ｎｍ 处测定吸光值
（ＯＤ６００）。 细胞干质量（ＤＣＷ）＝ ０ ２６×菌体密度［１］。
２）糖浓度的测定 葡萄糖利用 ＳＢＡ ２４０Ｃ 型生
物传感分析仪（山东省科学院生物研究所） 测定。
总还原糖浓度采用 ３，５ 二硝基水杨酸（ＤＮＳ）比色
法［１１］ 测 定。 其 他 糖 采 用 高 效 液 相 色 谱 法
（ＨＰＬＣ） ［１２］测定。 具体条件为 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ公司 Ａｍｉｎｅｘ
ＨＰＸ ８７Ｈ型离子排斥色谱柱（７ ８ ｍｍ×３００ ｍｍ）、
检测器为 Ｓｈｏｓｅｘ ＲＩ １０１ 型示差折光检测器、流动
相 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４溶液、进样体积 ２０ μＬ、流动相流
速 ０ ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ、柱温 ５５ ℃。
３）总酚 （ ＴＰＣ）的测定 具体方法参照文献
［１３］。
４）产物（乙酸、丁酸及溶剂）检测 采用 ＦＵＬＩ
９７１０气相色谱仪（浙江福立分析仪器有限公司），氢
火焰离子化（ＦＩＤ）检测器，色谱柱为石英毛细管柱
（３０ ｍ×０ ３２ ｍｍ×１ μｍ，ＳＥ ３０，交联，最高使用温
度 ２９０ ℃）。 柱箱温度 ９０ ℃，检测器温度 １８０ ℃，进
样器 １８０ ℃，载气为 Ｎ２，流速 ３０ ｍＬ ／ ｍｉｎ，以异丁醇
为内标物进行定量。
５） 计算方法
丁醇抑制率＝ρ（对照组丁醇）
－ρ（实验组丁醇）
ρ（对照组丁醇）
×１００％
（１）
转化率＝ ρ（总溶剂） ／ ρ（总糖）×１００％ （２）
２ 结果与讨论
２ １ ＡＲＴＰ诱变条件的确定
ＡＲＴＰ 诱变是通过破坏细胞结构导致基因断
裂，而通过细菌自身 ＤＮＡ 修复发生基因突变，因此
找到最合适的诱变条件才能够实现快速高效的诱
变。 而诱变时间的选择通常是根据诱变存活率曲
线（或死亡率曲线）来确定的。 根据前期的研究报
道，当存活率为 １０％左右时，具有较强的诱变效应，
通常以该时间作为最佳诱变时间［１４－１５］。
图 １为拜氏梭菌存活率曲线，诱变 ３０ ｓ 时细胞
存活率为 ４２％；处理 １８０ ｓ，细胞存活率降至 １０％；处
理 ２４０ ｓ，基本无细胞存活。 因此选用 １８０ ｓ 作为最
佳诱变时间。
图 １ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＡＲＴＰ诱变存活率曲线
Ｆｉｇ １ Ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐｌａｓｍａ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ｃｅｌｌｓ
２ ２ 高通量筛选高抗逆高丁比突变株
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ经 ＡＲＴＰ 诱变后，经过刃天青平板
涂布可快速、高效、便捷的筛选出透明圈大即还原
力较强的突变菌株。 最终，挑选出 ５０株透明圈明显
大于出发菌株的突变菌。 进一步接种于含有总还
原糖 ３０ ｇ ／ Ｌ 玉米芯酸解糖液的 Ｐ２ 发酵培养基中，
通过摇瓶发酵实验复筛。 根据发酵结果选出 ５株对
玉米芯酸解糖液中抑制物耐受能力强，丁醇比高的
突变菌株，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：ＩＴ１１１ 发酵发
酵性能最好，总溶剂产量达到 １０ ５ ｇ ／ Ｌ，丁醇 ８ ０
ｇ ／ Ｌ，丁醇比高达 ７６％，同时经过 ６ 代传代实验证明
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１ 发酵性能较为稳定，甘油管
－７０ ℃保藏用以进一步研究。
图 ２ 突变株与出发菌株总溶剂和丁醇产量的比较
Ｆｉｇ ２ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｔａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ
ｓｔｒａｉｎ ｏｎ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ａｎｄ ｂｕｔａｎｏｌ
５２ 第 １期 贺爱永等：高抗逆高丁比拜氏梭菌的选育及其性能考察
２ ３ Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 突变菌株利用不同 Ｃ 源的发酵
结果
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 天然具有利用多种不同的单糖及
多糖类物质的能力［３，５］。 在以总糖为 ３０ ｇ ／ Ｌ的葡萄
糖、木糖、蔗糖、混合糖及玉米芯酸解糖液为 Ｃ 源，
发酵培养基中 ３５℃摇瓶培养 ７２ ｈ，考察出发菌株及
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１对不同 Ｃ源的代谢情况，结果如
表 １ 所示。 由表 １ 可知：３０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖为 Ｃ 源时，
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１ 可以产生最高的总溶剂 （ １３ ６
ｇ ／ Ｌ），其中丁醇 １０ ４ ｇ ／ Ｌ，比例达到 ７６％，分别较出
发菌株提高了 １１ ４％、１６ ９％和 ５ ５％。 其他 Ｃ 源
与葡萄糖相比，利用率及转化率都有所降低。 而以
蔗糖为 Ｃ源时，Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１ 代谢产物丁醇比
更是高达 ８５％。 值得一提的是，ＩＴ１１１ 利用混合糖
和玉米芯酸解糖液的代谢能力相当，说明该突变菌
株具有较强的抑制物抗逆性能。
表 １ 出发菌株和突变株利用不同 Ｃ源的发酵结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｕｓｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｂｙ ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ａｎｄ ｍｕｔａｎｔ
菌株 Ｃ源
ρ（产物） ／ （ｇ·Ｌ－１）
乙醇 丙酮 丁醇 总溶剂
ｗ（丁醇） ／
％
转化率 ／
％
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ
ＩＴ１１１
葡萄糖 ０ ４ ２ ８±０ １ １０ ４±０ ２ １３ ６±０ ３ ７６±０ ０１ ４５
木糖 ０ ２ １ ５±０ １ ７ ８±０ ３ ９ ５±０ ４ ８２±０ ０１ ３２
蔗糖 ０ ２ １ ５±０ １ ９ ６±０ ２ １１ ３±０ ３ ８５±０ ０１ ３８
混合糖 ０ ３ ２ ３±０ ２ ８ ４±０ １ １１ ０±０ ３ ７６±０ ０１ ３７
玉米芯酸解糖液 ０ ４ ２ １±０ １ ８ ０±０ １ １０ ５±０ ２ ７６±０ ０１ ３５
Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ
ＩＢ４
葡萄糖 ０ ３ ３ ０±０ １ ８ ９±０ ２ １２ ２±０ ３ ７２±０ １１ ４１
木糖 ０ ２ １ ９±０ １ ６ ４±０ １ ８ ５±０ ２ ７５±０ ０５ ２８
蔗糖 ０ １ １ ９±０ １ ７ ６±０ ２ ９ ６±０ ３ ７９±０ １１ ３２
混合糖 ０ ３ ３ １±０ ２ ７ ５±０ ２ １０ ９±０ ４ ７０±０ １６ ３６
玉米芯酸解糖液 ０ ５ ２ ２±０ ２ ６ ８±０ １ ９ ５±０ ３ ７１±０ １０ ３１
２ ４ Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ突变株对抑制物抗逆性能的考察
玉米芯等木质纤维原料稀酸处理过程中产生
多种抑制物，主要包含有机酸类、糠醛类和酚
类［７－９］。 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＢ４是目前报道可直接利用未
脱毒玉米芯酸解糖液发酵制备丁醇的菌株［１］，该菌
株对于木质纤维素酸解糖液中抑制物成分具有较
高的抗逆能力。
考察以 １ ｇ ／ Ｌ 糠醛、５ ＨＭＦ、甲酸钠、乙酸钠、
ＮａＣｌ和 Ｎａ２ＳＯ４及 ０ ５ ｇ ／ Ｌ６ 种不同的模式酚类物质
对出发菌株 ＩＢ４和 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１生长及代谢的
影响，结果见图 ３。 由图 ３ 可知：酸类及糠醛类对
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 生长抑制影响较小，而酚类物质尤其是
香草醛的抑制作用较明显。 当香草醛的质量浓度为
０ ５ ｇ ／ Ｌ时，出发菌株 ＩＢ４ 和突变株 ＩＴ１１１ 的细胞干
质量浓度分别为 ０ ７ ｇ ／ Ｌ 和 １ １ ｇ ／ Ｌ，分别比对照组
降低了 ６８％和 ５２％。 由图 ３也可知：突变株的丁醇产
量均高于出发菌株，当糠醛和５ ＨＭＦ的质量浓度为
１ ｇ ／ Ｌ时，Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１丁醇产量分别为 ９ ０和
９ １ ｇ ／ Ｌ，比对照组的 １０ ４ ｇ ／ Ｌ略有降低，其丁醇抑制
率分别为 １３％和 １２ ５％。 此外，当加入 ４种盐类（乙
酸钠、甲酸钠、ＮａＣｌ和 Ｎａ２ＳＯ４）时，Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１
的丁醇产量均大于 ９ ９ ｇ ／ Ｌ，丁醇抑制率均小于 ５％。
６种模式酚类对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１发酵的影响差异
较大，其中香草醛和丁香醛会使发酵延滞期延长，从
而使得发酵时间延长。 尽管阿魏酸和香豆酸结构相
似，但香豆酸对发酵的抑制远高于阿魏酸。 ６种酚类
化合物中对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１的丁醇产量影响最高
是丁香醛（９ ６ ｇ ／ Ｌ丁醇），丁醇产量最低的香草醛为
４ ５ ｇ ／ Ｌ。
总体来说，糠醛和酸类对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 发酵影
响较小，酚类物质对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 抑制作用较强，其
中以香草醛为最。
６２ 生 物 加 工 过 程 第 １２卷
图 ３ 不同抑制物对出发菌株和突变株
Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１的生长和
代谢的影响
Ｆｉｇ ３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｎ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ
ｓｔｒａｉｎ ａｎｄ Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ ＩＴ１１１
３ 结 论
１）通过 ＡＲＴＰ 诱变及高通量筛选选育到一株生
产性能优良的产丁醇拜氏梭菌 ＩＴ１１１。
２）Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉＩＴ１１１ 利用多种 Ｃ 源时均展现
其高丁醇比的特性，以玉米芯酸解糖液为 Ｃ 源时，
溶剂产量达到 １０ ５ ｇ ／ Ｌ，丁醇 ８ ０ ｇ ／ Ｌ，丁醇比高
达 ７６％。
３）糠醛和酸类对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 发酵影响较小，
酚类物质对 Ｃ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ 抑制作用较强，其中以香
草醛为最。
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（责任编辑 荀志金）
７２ 第 １期 贺爱永等：高抗逆高丁比拜氏梭菌的选育及其性能考察