全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．０１０
收稿日期：２００８－０９－０２
作者简介：张小飞（１９７９—），男，河南沁阳人，助教，硕士，研究方向：微生物技术和酶工程，Ｅｍａｉｌ：ｐｒｏｃｓｏｎ＠１６３．ｃｏｍ
Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺
张小飞１，朱银惠１，王璐璐２
（１．河北工业职业技术学院，石家庄 ０５００９１；２．山东师范大学 外国语学院，济南 ２５００１４）
摘 要：以ＴＪＳ环氧基树脂作为载体对Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶进行固定化，最佳工艺条件为：１ｇ树脂
载体大约对应１３３Ｕ酶液，蛋白质量浓度０３５ｍｇ／ｍＬ，固定时间１５ｈ，温度２８℃，ｐＨ７５，固定化酶活达到５８５Ｕ。
蛋白固定率可达９７４％，酶活回收率达到４９３％，得到的固定化酶使用半衰期达到２６批。
关键词：Ｄ 对羟基苯甘氨酸；Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶；固定化
中图分类号：Ｑ８１４．２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００４６－０４
ＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｃａｒｂａｍｙｌＤａｍｉｎｏａｃｉｄａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ
ＺＨＡＮＧＸｉａｏｆｅｉ１，ＺＨＵＹｉｎｈｕｉ１，ＷＡＮＧＬｕｌｕ２
（１．ＨｅｂｅｉＣｏｌｅｇｅｏｆＩｎｄｕｓｔｒｙａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ０５００９１，Ｃｈｉｎａ；
２．ＣｏｌｅｇｅｏｆＦｏｒｅｉｇｎＬａｎｇｕａｇｅｓ，ＳｈａｎｄｏｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎａｎ２５００１４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＥｐｏｘｙｒｅｓｉｎＴＪＳｗａｓｕｓｅｄａｓｃａｒｉｅｒｓｆｏｒｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｃａｒｂａｍｙｌＤａｍｉｎｏａｃｉｄ
ａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＤＣａｓｅ）．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｏｗｓ：１３３Ｕ／ｇＴＪＳｒｅｓｉｎ，ｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎ
ｔｒａｔｉｏｎ０３５ｍｇ／ｍＬ，ｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ１５ｈ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ２８℃，ａｎｄｐＨ７５．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｃｏｎｄｉ
ｔｉｏｎｓ，ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｅｎｚｙｍｅｗａｓ５８５Ｕ／ｇ，ｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｙｉｅｌｄｗａｓ９７４％，ａｎｄ
ｔｈｅｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ４９３％．ＴｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＤＣａｓｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒ２６ｔｉｍｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｄｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｇｌｙｃｉｎｅ；ＮｃａｒｂａｍｙｌＤａｍｉｎｏａｃｉｄａｍｉｄｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
光学活性 Ｄ 对羟基苯甘氨酸（ＤｐＨＰＧ）是生
产青霉素和头孢菌素等 β 内酰胺类半合成抗生素
的重要中间体，随着市场需求的不断增加，ＤｐＨＰＧ
的生产越来越受到人们的重视［１］。在酶法制备 Ｄ
ｐＨＰＧ中，Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶
（ＤＣａｓｅ）和海因酶（ＤＨａｓｅ）是２种关键生物催化剂。
海因酶将 ＤＬ 对羟基苯海因（ＤＬｐＨＰＨ）转化为中
间产物 Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 对羟基苯甘氨酸（ＮＣＤ
ｐＨＰＧ），Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶则将中
间产物转化为Ｄ 对羟基苯甘氨酸（ＤｐＨＰＧ）［２］。
ＤＨａｓｅ的固定化研究已经有报道［３－４］，但由于
ＤＣａｓｅ容易氧化而失去活力［５］，从而导致在 ＤＣａｓｅ
的固定化方面报道较少，笔者对 ＤＣａｓｅ固定化工艺
进行研究，以提高ＤＣａｓｅ的利用率。
１ 材料与方法
１１ 实验仪器
高压液相色谱仪，戴安 ＤＩＯＮＥＸ；高档精密 ｐＨ
计，上海梅特勒 托利仪器有限公司；７２１型分光光
度计，上海光学仪器厂。
１２ 酶液来源
ＤＣａｓｅ，由中南林业科技大学遗传教研室提供。
１３ 主要实验试剂
ＣａＣｌ２、三氯乙酸、ＫＨ２ＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＯＨ、小牛
蛋白、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酒石酸钾钠、ＫＩ；ＣｕＳ０４·５Ｈ２Ｏ、Ｄ
ｐＨＰＧ（纯度９９％），河北九派制药有限公司提供；树
脂（ＴＪＳ）载体（环氧值 ＝０４），陕西蓝晓树脂有限
公司。
１４ 实验方法
１４１ 酶活测定
取３个１００ｍＬ的三角瓶，１个空白，２个装试
样。先向各瓶中分别加入９ｍＬ底物，３３℃预热５～
６ｍｉｎ；然后空白瓶中加入１ｍＬｐＨ８０的磷酸缓冲
液，其余２个各加入发酵液１ｍＬ；以上３瓶摇匀进
行酶促反应；水浴上振荡 ３０ｍｉｎ后，立即加入 ６
ｍｏｌ／Ｌ的 ＨＣｌ３滴，终止反应。反应液再摇匀，于
４０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液在高效液相分析
下测酶活。
一个酶活力单位定义为在测定条件下每分钟
产生１μｍｏｌＤ 对羟基苯甘氨酸（ＤｐＨＰＧ）所需的
酶量。酶的比活力为１ｍＬ细菌发酵液所含多少个
酶活力单位（Ｕ）。
ＤＣａｓｅ活力（３３℃）＝
ＳＤｐＨＰＧ／Ｓ标 ×ρ
１６７１６×３０
式中：ＳＤｐＨＰＧ为ＤｐＨＰＧ的峰面积（ｍＡＵ·ｍｉｎ）；Ｓ标为
标准品ＤｐＨＰＧ的峰面积（ｍＡＵ·ｍｉｎ）；ρ为标准品
ＤｐＨＰＧ质量浓度（ｇ／ｍＬ）；１６７１６为 ＤｐＨＰＧ相对
分子质量；３０为时间（ｍｉｎ）。
１４２ 回收率的测定
按１４１方法分别测定固定化酶活及游离酶的
酶活，按下式计算酶活回收率和蛋白固定率［６］。
酶活回收率 ＝固定化酶的总活力／（酶液初始
总酶活－残余酶液的总酶活）×１００％
蛋白固定率＝（固定化前反应液中蛋白总量 －
固定化后的蛋白总量）／固定化前反应液中蛋白总
量×１００％
１４３ ＴＪＳ载体上ＤＣａｓｅ的固定化
用Ｋ２ＨＰＯ４来调酶液 ｐＨ，按照每克载体结合酶
的活力单位来投料。称一定量的 ＴＪＳ湿树脂载体，
在水浴锅控制温度，进行振荡，固定结束测定酶活。
１４４ 蛋白的测定方法
双缩脲法（Ｂｉｕｒｅｔ法）。
２ 结果与讨论
２１ 酶固定化条件的确定
酶与载体结合的原理：ＴＪＳ载体是一种环氧基
化的树脂，它能与酶分子表面的氨基（ ＮＨ２）形成
共价键，从而达到酶的固定化。当然酶表面的羟基
也可以同氨基化载体进行固定。据文献［３］报道，
氨基化载体与酶结合的回收率远远低于环氧基
载体。
由于ＤＣａｓｅ本身在有氧化环境下易失活，因此
在固定化整个过程中，通入氮气作为保护剂，来完
成固定化反应，提高固定化酶的稳定性。另外
ＤＣａｓｅ本身就是一种蛋白质，它对温度、ｐＨ有很高
的要求，环氧型的树脂载体也受这些条件的影响，
下面针对几个重要影响因素进行摸索。
２１１ 载体投放量的确定
由文献［３］可知，酶与载体的固定化时间一般
不超过２４ｈ。为确定载体的投放量，将不同量的载
体加入５个４００ｍＬ的酶液中，其中每４００ｍＬ的酶
液总活力为２０００Ｕ，分别放入５、１０、１５、２０ｇ载体，
在２５℃、原酶液ｐＨ７０的条件下固定，于２０和２４
ｈ后分别测固定化酶活（图１）。
图１ 投放载体量对固定化的影响
Ｆｉｇ．１ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｃａｒｒｉｅｒｑｕａｎｔｉｔｉｅｓｏｎｔｈｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＣａｓｅ
由图１可知：投 ２０ｇ载体的固定化酶活只有
３２１Ｕ，远远低于其他３个固定化酶活，而其他３种
投放量固定化酶活没很大变化，活力都在４０Ｕ，只
有投１５ｇ载体的稍有回落，主要是因为树脂载体表
面上的环氧基团数目有限，５ｇ和１０ｇ投量的载体
表面环氧基团已经基本饱和，剩余的酶液不能再固
定上载体；１５ｇ投量可能刚好是载体结合酶量饱和
的转折点，所以活力有所回落，而２０ｇ投量使得载
体过多，导致树脂表面结合蛋白质的基团仍未饱
和，相应的固定化酶的活力就低。再固定４ｈ后，几
种固定化酶活仍与２０ｈ时接近，说明在２０ｈ里酶液
与载体已经充分结合，再延长时间，多余游离酶也
固定不上载体。为了不浪费树脂载体，酶液中游离
酶不过多损失，结果发现，１５ｇ载体量对应２０００Ｕ
的游离酶是较合理的，即 １３３Ｕ的游离酶对应１ｇ
载体的投放量。下面的实验都以此标准投放载体。
７４ 第４期 张小飞等：Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺
２１２ 酶液蛋白浓度的影响
酶液用蒸馏水稀释为０２～０４５ｍｇ／ｍＬ蛋白
质量浓度的溶液，磷酸盐将酶液 ｐＨ控制在７０，然
后进行固定，分析酶液蛋白质量浓度对酶活回收率
和蛋白固定率的影响，如图２所示。
图２ 蛋白质量浓度对固定化的影响
Ｆｉｇ．２ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｐｒｏｔｅｉｎｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｎｔｈｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＣａｓｅ
由图２可知：随着蛋白质量浓度的增加，酶蛋白
固定率呈不同程度的下降趋势，而酶活回收率在
０３５ｍｇ／ｍＬ时达到最大值。原因在于蛋白质量浓
度的增加意味着酶分子表面可反应基团的数量增
多，而载体表面的环氧基团数目不变，结果蛋白固
定率逐渐下降；当载体表面的基团与一定蛋白质量
浓度结合饱和时，酶活回收率则达到极值。故蛋白
质量浓度应控制在０３５ｍｇ／ｍＬ。
２１３ 固定化时间的影响
考虑到 ＤＣａｓｅ溶液状态下受 ｐＨ的影响，先将
ｐＨ控制在７０，温度设定在３０℃。每隔３ｈ进行酶
活测定，结果见图３。
图３ 固定化时间对ＤＣａｓｅ固定化的影响
Ｆｉｇ．３ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｉｍｅｏｎｔｈｅ
ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＣａｓｅ
由图３可知：当固定化时间为３ｈ时，由于固定
化时间短，游离酶基本不能固定，蛋白固定率较低，
残液酶活仍然很高，结合酶量小。固定时间在９～
１２ｈ之内时，随着固定化时间的延长，酶活回收率
和蛋白固定率都呈现上升趋势并趋于稳定。１５ｈ
酶活回收率和蛋白固定率均达到最高，测得固定化
酶活力为５３Ｕ。固定时间继续延长，蛋白固定率没
变化，酶活回收率却下降，原因在于载体表面结合
酶的基团已经饱和，多余蛋白固定不上，而游离酶
在长时间的固定条件下自然失活。从整个过程来
看，选择１５ｈ作为固定化时间比较理想。
２１４ 固定化温度的影响
由于酶对温度特别敏感，再加上载体的影响，温度
更显得重要，在控制固定时间１５ｈ、ｐＨ７０的情况下，研
究不同温度对酶的固定化影响，结果见图４。
图４ 温度对ＤＣａｓｅ固定化的影响
Ｆｉｇ．４ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎ
ｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＣａｓｅ
由图４可知：温度对固定化的影响特别明显，温
度低，载体与酶反应活性低，蛋白固定率小。随着
温度的升高，蛋白固定率和酶活回收率先升高后下
降；在温度达到２８℃时，固定化酶活、酶活回收率和
蛋白固定率都达到最高，分别为 ５５２Ｕ、４８８％，
９７％；而４４℃时，几乎没有酶固定上载体，而且游离
酶也没活力，主要原因是温度过高使酶本身失活，
再加上载体表面的环氧基在高温下也会发生改变，
难以在空间形成共价键结合。因此，固定化的温度
选择２８℃比较合适。
２１５ 固定化的最佳ｐＨ
固定化的 ｐＨ影响载体和酶的游离状态，从而
影响着酶的结合量，会造成固定化的结果不乐观，
因此选择合适ｐＨ也至关重要。用磷酸盐调游离酶
液的ｐＨ进行固定，固定时间为１５ｈ，温度２８℃，结
果见图５。
由图５可知：该酶在固定时偏向中性，随着 ｐＨ
的升高，酶活回收率先升高后下降，在ｐＨ７５时达到
极值，固定化酶活为５８５Ｕ，酶活回收率为４９３％，
８４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
图５ ｐＨ对ＤＣａｓｅ固定化的影响
Ｆｉｇ．５ ＩｎｆｌｕｅｎｃｅｓｏｆｐＨｏｎｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＤＣａｓｅ
蛋白固定率为９７４％。而蛋白固定率一直处于下降
趋势，可能是由于随着ｐＨ的增加，越来越接近酶的
等电点，使酶分子表面的离子化程度降低，从而削弱
了酶分子与载体之间的共价结合。当ｐＨ＞１０５时，
酶在溶液状态时就失去活性，同时在游离的酶液中也
会看见乳白色絮状的失活蛋白析出。综合考虑，ｐＨ
设定在７５比较适合。
２２ 固定化酶的稳定性
将优化后得到的固定化酶与质量浓度为３０ｇ／Ｌ
的底物ＮＣ Ｄ ｐＨＰＧ混合投入到反应罐，混合的
比例为２０００Ｕ的固定化酶对应２４ｇ底物反应，转化
结果见图６。
图６ 固定化酶的稳定性
Ｆｉｇ．６ ＳｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄＤＣａｓｅ
由图６可知：起初的反应时间在５０ｍｉｎ左右，在
前２５批反应都比较稳定，这就使得酶达到了多批次
的使用。但２５批后，反应时间逐渐增长，到了３５批
反应时间达到２４３ｍｉｎ，这说明固定化酶也是有一定
使用限度，随着反应批次的增多，固定化酶会有一部
分失活，同时还有少量酶可能从载体上脱落等，这都
会导致固定化酶的转化时间有所加长。从整个跟踪
实验来看，固定化酶反应的半衰期在２６批，这已经使
得ＤＣａｓｅ的利用率提高了很多，但在固定化酶的稳定
性方面仍有很大的发展空间。
３ 结 论
游离的ＤＣａｓｅ酶液在转化制备Ｄ ｐＨＰＧ时，都
是一次性使用，通过对 ＤＣａｓｅ的固定化工艺研究可
以增加ＤＣａｓｅ的使用次数，提高ＤＣａｓｅ的利用率，同
时可以减小因游离状态下 ＤＣａｓｅ易氧化失活的程
度，减少生产成本。但是固定化 ＤＣａｓｅ的反应半衰
期只有２６批，因此，提高固定化 ＤＣａｓｅ的稳定性仍
有较大研究空间。
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９４ 第４期 张小飞等：Ｎ 氨甲酰基 Ｄ 氨基酸酰胺水解酶的固定化工艺