全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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0@A>$%&%
IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%&.
收稿日期"$%% ?&$ ?$&
作者简介"胡"蓉#&!5%$&女&江西宜春人&硕士研究生&研究方向"生物催化)汪"钊#联系人$&教授& 1^M3CJ";:N3E4:;3Df&5(>LDM
芳香酰胺类化合物的选择性水解菌初筛模型的研究
胡"蓉&章银军&应向贤&汪"钊
#浙江工业大学 生物与环境工程学院&杭州 (&%%&.$
摘"要"建立了一种快速筛选选择性水解手性芳香酰胺类化合物微生物的方法 在中性或弱碱性条件下&cbE-
.
能氧化芳香胺&但对芳香乙酰胺没有氧化效果 cbE-
.
被芳香胺还原而褪色&通过褪色程度来快速测定菌的酶活
力及手性选择性 以 & 苯基乙酰胺为例&得出最佳筛选体系"最大吸收波长为#$# EM)& 苯基乙胺在 %h%. j
# MMDJ7Z的浓度范围内与其
)
,
#$#
符合朗伯比尔定律)反应温度为5% i&反应时间为$% MCE 通过该模型筛到 # 株
选择性的菌株&5 选择性的菌株 . 株&7 选择性的菌株 & 株
关键词"芳香酰胺类化合物)筛选)对映选择性
中图分类号"8!&.""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%5. ?%#
*1:400/./; 1G1F0J7240/5/F.21060:F.N0-GI426G1.12754G65J.I01
+XWDE4&O+P,Q]CE1`KE&]_,Q\C3E41VC3E&TP,QO;3D
#6DJ@4@DF/CDJD4CL3J3EI E^[C2DEM@EB3J^ E4CE@@2CE4&O;@`C3E4XEC[@2GCBHDFY@L;EDJD4H&+3E4:;DK (&%%&.&6;CE3$
*H1F45:F"PED[@J@E3EBCDG@J@LBC[@3MCI3G@GL2@@ECE4GHGB@MN3GI@[@JDA@I>XEI@2E@KB23JD23Ja3JCE@LDEIC1
BCDE&cbE-
.
LDKJI DVCIC:@32HJ3MCE@G9KBLDKJI EDBDVCIC:@32HJ3L@B3MCI@>Y;@@E:HM@3LBC[CBH3EI B;@
@E3EBCDG@J@LBC[@DFB;@MCL2DD243ECGMN@2@I@B@LB@I 9HB;@F3ICE4DFcbE-
.
>Y;@@E3EBCDG@J@LBC[CBC@GDF
3MCI3G@N@2@@[3JK3B@I 9H&1A;@EHJ13L@B3MCI@>Y;@LDEICBCDEGDFDABCM3JGL2@@ECE4GHGB@MN3G3GFDJDNG"B;@
M3VCMKM39GD2ABC[@3B#$# EM&B;@LDEL@EB23BCDE 23E4@F2DM%h%. MMDJ7ZBD# MMDJ7Z&B@MA@23BK2@3B
5% i&3EI 2@3LBCDE BCM@$% MCE>/HKGCE4B;@M@B;DI&# GB23CEGNCB; @E3EBCDG@J@LBC[@3MCI3G@N@2@D9B3CE@I&
CE N;CL; . G;DN@I #5$1GA@LCFCL3[BC[CBH3EI & G;DN@I #7$13GA@LCFCLCBH>
L0G K24I1"32HJ3MCI@)GL2@@ECE4)@E3EBCDG@J@LBC[CBH
""手性芳香族酰胺类化合物及其产物手性芳香胺
均可用作溶剂(手性辅助剂及手性合成基础物质*&+
如手性的 & 苯基乙酰胺及其产物 & 苯基乙胺能够
拆分其他外消旋的物质&也是重要的药物中间体*$+
现在用生物催化法拆分水解芳香族酰胺类化合物的
酶主要是酰胺水解酶*(1.+ &如青霉素酰化酶*#15+和脂肪
酶**1!+ 脂肪酶因底物特异性不强*!+ &很少用来拆分
芳香族酰胺 因此&产酰胺水解酶菌种的筛选对于芳
香族酰胺的手性拆分尤为重要
""酰胺水解酶的高通量筛选大多为氨基酸酰胺酶
的检测*+ &也有 O;@E4等*&%+建立的基于酰基转移的
光学选择性酰胺酶的筛选模型&但未见基于芳香胺生
成的酰胺水解酶的立体选择性高通量筛选模型的报
道 许多芳香酰胺水解产物大都基于气相色谱#Q6$
或高效液相色谱#+
""在中性(弱碱性条件下&cbE-
.
#在没有还原性
高于%,+
$
基团的情况下$对芳香族酰胺没有氧化
作用&却能将芳香胺氧化成相应的芳香酮而褪色&
且吸光度变化值与芳香胺的浓度在一定范围内呈
线性关系 鉴于以上情况&以筛选能够选择性水解
& 苯基乙酰胺的菌种为例&建立一种新的筛选模
型 该筛选模型与传统的 Q6或 +
似物质为底物的选择性菌种的筛选 图 & 为 & 苯
基乙酰胺类化合物手性拆分的化学反应式
图 C?C 苯基乙酰胺类化合物手性拆分的化学反应式
T.;=C?S05:F.2/270/5/F.21060:F.N0-GI426G1.127CW9-0/G6W5:0F5J.I0:2J923/I
C?材料与方法
CMC?试剂及仪器
""标准品" 外消旋 & 苯基乙酰胺&51& 苯基乙酰
胺&7 & 苯基乙酰胺纯度均大于 !g)%h%$ MDJ7Z
A+*h%磷酸缓冲液)%h# MDJ7ZcbE-
.
标准溶液
""富集培养基"b40-
.
!*+
$
-%h# 4&c
$
+<-
.
& 4&
)@0-
.
!*+
$
-%h%& 4&c6J%h# 4&蔗糖 (% 4&& 苯基
乙酰胺#消旋体$( 4&水 & Z&A+*h%
""平板培养基"富集培养基中再加入 &# j$% 4琼
脂&灭菌&倒平板前加%h%# 47Z溴甲酚紫混匀
""发酵培养基"蛋白胨 &# 4&蔗糖*h# 4&尿素( 4&
,36J# 4&c
$
+<-
.
$ 4&b40-
.
!*+
$
-& 4&水& Z
""Xd $.#%<6紫外 可见分光光度计#日本岛津
公司$)紫外 可见连续波长酶标仪 0A@LB23M3Vb$
#美国分子仪公司$
CMA?实验方法
&h$h&"cbE-
.
芳香酰胺水解酶筛选体系的建立
""在建立筛选体系时&最佳反应温度及时间是以
& MZ$h# MMDJ7Z& 苯基乙胺与 $ MZ& MMDJ7Z
cbE-
.
在不同温度下反应$% MCE后测
)
,
#$#
来确定
的 最佳 cbE-
.
用量的确定是以& MZ$h# MMDJ7Z
& 苯基乙胺与不同浓度 cbE-
.
反应&在5% i下反
应$% MCE后测
)
,
#$#
来确定的
&h$h$"菌种初筛
""称取适量采集的土样加入无菌水中&用玻璃珠打
碎&吸取& MZ装入含质量分数 %h(g的底物(% MZ富
集培养基的三角烧瓶中&培养 . j# I后&再移取 $ MZ
转接入新鲜的含底物的富集培养基富集&如此重复 $
j(次&然后将富集液以一定的稀释度涂布到平板
上&得到使平板变色的单菌落&转接至斜面
&h$h("菌种复筛
""单菌落转接至发酵培养基&培养后离心得到菌
体&经过缓冲液洗涤&离心制备得到含酶的静息细
胞 分别以 7 酰胺(外消旋酰胺及以 5 酰胺为底
物转化! ; 离心后的上清液用十二烷基磺酸钠
#0R0$沉淀法除蛋白&加入& MZ水&在5% i下与
$ MZ& MMDJ7Z的 cbE-
.
反应$% MCE&用 5 孔板检
测
)
,
#$#
确定菌体的选择性及酶活性
A?结果与讨论
AMC?LU/+
R
芳香酰胺水解酶筛选体系的建立
$h&h&"吸收光谱和最佳吸收波长的选择
""在 ( 支装有$ MZ%h# MMDJ7Z的 cbE-
.
试管中
分别加& MZ水#空白$($ MMDJ7Z的 & 苯基乙酰胺
和$ MMDJ7Z的 & 苯基乙胺&5% i水浴反应$% MCE
在 .#% j5%% EM波长范围内扫描&最大吸收峰是
#$# EM&结果见图 $
图 A?LU/+
R
反应液波长扫描图谱
T.;=A?&5N060/;F-1:5//./; 95F04/127
92F511.3J904J5/;5/5F0
""由图 $ 可知"空白和 & 苯基乙酰胺的吸收峰几
#5"第 # 期 胡"蓉等"芳香酰胺类化合物的选择性水解菌初筛模型的研究
乎重叠在一起&说明 cbE-
.
与 & 苯基乙酰胺不会
发生反应&而加了 & 苯基乙胺后的 cbE-
.
吸光度
明显降低 因此&该方法很适合检测 & 苯基乙胺
$h&h$"最佳反应温度及时间的选择
""不同温度条件#室温(#%(5%(*%(*# 和!% i$对
吸光度趋于稳定的时间及其在稳定时间内的
)
,
#$#
&
结果见表 &
""由表 & 可知&在 5% i 下反应 $% MCE后迅速用
流水冷却至室温的
)
,
#$#
在( ; 内保持稳定 因为随
着温度增高&cbE-
.
会越来越不稳定&所以选择
5% i为较佳反应温度
""在5% i条件下&不同反应时间点的吸光度变化
情况见图 ( 由图 ( 可看出&5% i反应$% MCE后&
)
,
#$#
趋于稳定&反应(% MCE后&因bE-
$
的生成&加速
了反应&使反应变得不稳定 故选择 5% i( $% MCE
为反应条件&在该条件下&体系稳定
表 C?不同温度反应对稳定的反应时间影响
D5H60C?#70:F127I.7040/FF0J9045F34012/1F5H.6.FG 45:F.2/F.J0
温度7i 室温 #% 5% *% *# !%
吸光度稳定时间7MCE &#% ($ $% &! &$ %
稳定时间内的
)
,
#$#
%h$.$ %h$( %h$.! %h$.& %h$.( %
图 Q?反应时间对反应吸光度的影响
T.;=Q?#70:F127405:F.2/F.J02/
#
,
@A@
$h&h("cbE-
.
用量对反应的影响
""控制cbE-
.
浓度在 &h% j(h% MMDJ7Z范围内&
5% i反应$% MCE&测定
)
,
#$#
&结果见图 .
图 R?LU/+
R
用量对反应的影响
T.;=R?#70:F12792F511.3J904J5/;5/5F0
:2/:0/F45F.2/2/
#
,
@A@
""由图 . 可知"%h# MMDJ7ZcbE-
.
用量在 $h% j
(h% MZ范围内&吸光度差值
)
,
#$#
最大且稳定&在
cbE-
.
用量大于$ MMDJ7Z时&吸光度变化不大 因
为 cbE-
.
用 量 越 大& 灵 敏 越 低& 所 以 选 择
用$ MMDJ7Z
$h&h."干扰因素对酶反应的影响
""由于cbE-
.
具有强氧化性&会受到很多因素的
干扰&本实验中的干扰因素主要是菌体代谢产物及
菌体蛋白 菌体代谢产物的干扰可以通过在收集
菌体时用缓冲液洗涤几次来除去 去除菌体蛋白
对反应的干扰相对麻烦&反应时菌体会有部分蛋白
溶解在体系造成较严重的背景干扰&需要经过后处
理除蛋白 产物 & 苯基乙胺是碱性物质&不能用强
酸强碱改变 A+来除蛋白 本文对重金属离子去除
法#/36J
$
$(乙酸乙酯萃取法和 0R0 沉淀法 ( 种不
会对 cbE-
.
造成干扰的方法进行了比较#表 $$
由表 $ 可以看出"/36J
$
法去除不完全&乙酸乙酯萃
取不够完全&而 0R0沉淀法处理后的
)
,
#$#
与空白值
最为接近
表 A?除蛋白方法比较
D5H60A?,2J954.12/2740J2N./; 942F0./J0F-2I1
除蛋白
溶剂 空白
/36J
$
法 0R0
沉淀法
乙酸乙酯
萃取法
处理前
)
,
#$#
%h&% %h*5# %h*5# %h*5#
处理后
)
,
#$#
%h&% %h$* %h&( %h&*
55 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
$h&h#"标准曲线的建立
""在上述条件下&分别取# MMDJ7Z的 & 苯基乙胺
标准溶液 %(%h&(%h$(%h((%h.(%h#(%h5(%h*(%h!(%h
和&h% MZ于试管中&再用# MMDJ7Z& 苯基乙酰胺的
标准溶液互补至& MZ配成校正溶液&在#$# EM波长下
测吸光度变化值 & 苯基乙胺在 %h%. j# MMDJ7Z浓
度范围内&与吸光度差值
)
,
#$#
呈良好的线性关系#见
图 #$ 线性回归方程为
)
,l%h%*5 *&$?%h%%& (&
5
$
l%h ( 随机选取一个转化试样&测得其
)
,为
%h$.(& 根据标准曲线得试样 & 苯基乙胺浓度为
(h&% MMDJ7Z&与 Q6测得该试样 & 苯基乙胺浓度
(h&!& MMDJ7Z结果一致& 说明随机试样的
)
,与 &
苯基乙胺线性关系良好
图 @?C 苯基乙胺的标准曲线
T.;=@?!F5/I54I:34N027CW9-0/G6W5:0F5J.I0
AMA?试样的测定
""将实验室筛选得到的 6%. 菌株发酵(5 ;&离
心&菌体用缓冲液洗涤 ( 次后& ?!% i冻干 取适
量干菌体转化 $% MMDJ7Z的 & 苯基乙酰胺&$ ;后&
稀释适当倍数&离心取上清液用 0R0 沉淀法处理
后&加入& MZ去离子水和$ MZ& MMDJ7Z的 cbE-
.
溶液&5% i下反应$% MCE&测
)
,
#$#
&代入方程式计算
浓度 同时&试样用+
.
法和
+
表 Q?LU/+
R
法和"EX,方法检测 C 苯基乙胺#1b>$
D5H60Q?*/56GF.:5640136F127CW9-0/G6W5:0F5J.I0#1b>$
反应
时间7;
$#& 苯基乙胺$7#MMDJ!Z?&$ W0R7g
cbE-
.
法
+
法
+
! &h5( z%h%$ &h5# z%h%( &h(& &h&.
&$ $h& z%h%. $h&* z%h%. $h.* $h$!
"注"W0R#W@J3BC[@GB3EI32I I@[C3BCDE$ 相对标准偏差&即标准差除以
平均数
AMQ?回收率的测定
""对试样中添加一定标准 & 苯基乙胺溶液&表 .
为测得回收率和精密度数据&回收率和精密度结果
满意
AMR?产酰胺水解酶菌的筛选实例
""在浙江和江西两地采集土样&经过初筛得到了
5.* 株能水解 & 苯基乙酰胺的菌株后再进行复筛
复筛时转化试样用 5 孔板快速检测在%h# ;内完
成& 而 Q6检测需要约$%% ;& 可见菌株筛选效率大
大提高
表 R?试样中 C 苯基乙胺回收率及精密度试验#1b>$
D5H60R?S0:2N04G 5/I940:.1.2/27CW9-0/G6W5:0F5J.I0#1b>$
反应时间7; 原始值7#MMDJ!Z?&$ 添加量7#MMDJ!Z?&$ 测量值7#MMDJ!Z?&$ 回收率7g W0R7g
! &h# & $h#& z%h%. &%%h5* $h.*
&$ &h# $ (h. z%h%( h(( &h!.
&$ $h# $ .h#& z%h%$ &%%h. &h##
""表 # 为筛选出的 5 株具有代表性的菌株&其中
6%. 活性较高但没选择性&6% 为 7 选择性的菌
株&T%%&(\&%(\&(. 和S%$5 为5 选择性菌株
Q?结?论
""大规模筛选取决于快速(简便(廉价(高通量的
酶活检测方法 在传统筛选酰胺酶的方法中&常用
的薄板层析具有快速简便的优点&但通量和灵敏度
较低)用 A+检测反应体系的变化来测酶活方法&由
于反应产弱酸弱碱&而且一般在缓冲溶液下进行&
对 A+影响较小&实际应用不灵敏 而基于 cbE-
.
褪色快速测定的筛选方法不受 A+影响&检测快速
*5"第 # 期 胡"蓉等"芳香酰胺类化合物的选择性水解菌初筛模型的研究
准确&与传统筛选方法相比&具有快速( 灵敏( 成本
低廉等优点&适合快速筛选具有较高芳香酰胺选择
性水解菌
表 @?菌株转化 C 苯基乙酰胺手性选择性的测定
D5H60@?_0F0:F.2/271F45./0/5/F.21060:F.N0
-GI426GY0CW9-0/G6W5:0F5J.I0
菌株
)
,
#$#
577 5 7 5?7
6%. %h&5( %h&5( %h&5. ?%h%%&
6% %h%! %h%#& %h&%# ?%h%#.
T%%& %h%.. %h%*% %h%&( %h%#*
\&% %h%.! %h%5. %h%.% %h%$.
\&(. %h%5$ %h%*% %h%#* %h%&(
S%$5 %h%.* %h%5& %h%$( %h%(!
""以 & 苯基乙酰胺为例&通过 cbE-
.
芳香酰胺
水解酶筛选体系&得出最佳筛选体系"最大吸收波
长为#$# EM)& 苯基乙胺在 %h%. j# MMDJ7Z的浓度
范围内与其
)
,
#$#
符合朗伯比尔定律)反应温度为
5% i&反应时间为$% MCE 本文通过该模型筛到 #
株选择性的菌株&5 选择性的菌株 . 株&7 选择性
的菌株 & 株
参考文献"
*&+"/2@K@2b&RCB2CL; c&+39CL;@2Y&@B3J>_EIKGB2C3JM@B;DIGFD2B;@
A2DIKLBCDE DFDABCL3JH3LBC[@CEB@2M@IC3B@G*S+>PE4@N6;@M_EB
I^ E^4J&$%%.&.("*!!1!$.>
*$+"牟奇勇>手性芳基乙酰胺类 a3AA3阿片受体激动剂的合成和镇
痛活性研究*R+>上海"中国科学院上海药物研究所&$%%("
.$1#*>
*(+"Q23Fb&/2KE@J3P&cCB@JM3EE b&@B3J>_GDJ3BCDE 3EI L;323LB@2C:31
BCDE DF ;C4;JH # 5$1GA@LCFL M13L@BHJ1&1A;@EHJ@B;HJ3MCE@
3MCID;HI2DJ3G@"3E@N@E:HM@F2DM,"6%"&E*$6("*0"(+$(1+PLW#9
*S+>PAAJbCL2D9CDJ/CDB@L;EDJ&&*&.*"5#%15#*>
*.+"Q;CG3J93-&cCB@JM3EE b&Z3KM@E c&@B3J>/CDL3B3JHGBGNCB; 31
MCE@3LHJ3G@3LBC[CBH"X0&5$(##&5*<+>$%%&1%(1$$>
*#+")3IE3[CG,T&W3I;Ca3cW&R@[CPd><2@A323BCDE DF@E3EBCDM@21
CL3JHAK2@#5$13EI #7$1(13MCED1(1A;@EHJ1&1A2DA3EDJ[C32@GDJK1
BCDE NCB; CMMD9CJC:@I A@ECLCJCE Q3LHJ3G@*S+>Y@B23;@I2DE"PGHM1
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*5+")3IE3[CG,T&R@[CPd&S3GBCZ0>W@GDJKBCDE DF23L@MCL$1L;JD2D1
A;@EHJ4JHLCE@NCB; CMMD9CJC:@I A@ECLCJCE Q3LHJ3G@*S+>Y@B231
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**+"T34@44Y& E^:@J9@24@2bb&XN@Y&@B3J>Y;@KG@DFM@B;DVH3L@1
BDVH@GB@2GGC4ECFCL3EBJH@E;3EL@G2@3LBCDE 23B@GCE B;@JCA3G@1L3B31
JH:@I A2@A323BCDE DF@E3EBCDAK2@&1#.1L;JD2DA;@EHJ$ @B;HJ3MCE@G
*S+>/D2EGL;@K@2S/CDB@L;EDJ&&!&5&"*#1*!>
*!+"YD2@G1Q3[CJs3E P&63GBCJD &^Z{A@:1bKE4Kt3P>Y;@3MCI3G@3L1
BC[CBHDF<*1#* *16*"$6#$* JCA3G@/CGI@A@EI@EBDE GA@LCFCLGB2KL1
BK23JF@3BK2@GDFB;@GK9GB23B@G*S+>SbDJ@LKJ3263B3J/" E^:HM3BCL
$%%5&.&"&(51&.%>
*+"S@3E1ZDKCG@W@HMDEI>酶活检测"高通量筛选遗传选择以及指
纹分析*b+>林章凛&蔡真&译>北京"化学工业出版社&$%%!"
.1&%&>
*&%+ O;@E4W@EL;3D&O;@E4]K4KD&0;@E ]CEL;K>PGL2@@ECE4GHGB@M
FD23LBC[@3EI @E3EBCDG@J@LBC[@3MCI3G@93G@I DE CBG3LHJB23EGF@23L1
BC[CBH*S+>PAAJbCL2D9CDJ/CDB@L;EDJ&$%%*&*."
""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
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国外动态
美国研制出人造血 将在 # 年内用于战场
美国科学家成功研制出人造血液&将于 # 年内用于救治战场上的伤兵
这种人造血是利用转基因技术&通过机器模拟人体骨髓的造血过程&从脐带细胞中制造出大量血红细
胞 一条脐带最终可以转换为大约 $% 个单位的可用血液&而在战场上&平均每个伤兵在治疗中需要 5 个单
位的血液 人造血与健康人体循环中的血红细胞完全相同
美国五角大楼下属科研机构美国国防高级研究计划局于 $%%! 年开始这项名为,血液嫁接-的研发项
目 负责这个项目的美国P2B@2CDLHB@公司目前已经把第一批-型 W; 阴性人造血样本送到美国食品药品管
理局进行鉴定 科学家将于 $%&( 年以后对人造血进行人体试验&并在 # 年内将其用于战场 所有人造血血
型均为-型W;阴性&可以用于治疗任何血型的病人
#文伟河$
!5 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"