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Preparation and antifungal activity of Ag-SiO2 core-shell nanoparticles

Ag-SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用



全 文 :第 12卷第 2期
2014年 3月
生  物  加  工  过  程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol􀆰 12 No􀆰 2
Mar􀆰 2014
doi:10􀆰 3969 / j􀆰 issn􀆰 1672-3678􀆰 2014􀆰 02􀆰 010
收稿日期:2012-10-19
基金项目:国家教育部留学基金(K513201011);大学生课外学术科研基金(KY2013558B)
作者简介:陆  露(1987—),女,黑龙江延寿人,硕士研究生,研究方向:微生物与生化药物;王剑文(联系人),研究员,E⁃mail: jwwang@
suda􀆰 edu􀆰 cn
Ag SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用
陆  露1,郑丽屏2,赵培飞3,王剑文1
(1􀆰 苏州大学 医学部 药学院,苏州 215123; 2􀆰 苏州大学 金螳螂建筑与城市环境学院,苏州 215123;
3􀆰 云南省农业科学院 园艺作物研究所,昆明 650205)
摘  要:利用抗坏血酸对 AgNO3进行还原,生成银纳米粒核心,并通过正硅酸四乙酯的水解与聚合反应获得 SiO2介孔
外壳,制备平均粒径约为 92􀆰 9 nm的 Ag SiO2核 壳型纳米粒。 Ag SiO2纳米粒可以显著地抑制香石竹镰刀菌的生
长,最小抑菌质量浓度为 4 μg / mL,并可抑制香石竹镰刀菌菌丝生长和孢子分生。 Ag SiO2纳米粒处理 2~4 h后,菌
丝体的过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶、过氧化物酶活力增强,提示 Ag SiO2纳米粒抗菌机制和活性氧诱导相关。
关键词:银 二氧化硅核壳型纳米粒;抑菌;香石竹镰刀菌;活性氧
中图分类号:Q939􀆰 95        文献标志码:A        文章编号:1672-3678(2014)02-0051-05
Preparation and antifungal activity of Ag⁃SiO2core⁃shell nanoparticles
LU Lu1,ZHENG Liping2,ZHAO Peifei3,WANG Jianwen1
(1􀆰 School of Pharmaceutical Sciences,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China;
2􀆰 Jintanglang School of Architecture and Urban Environment,Soochow University,Suzhou 215123,China;
3􀆰 Institute of Horticultural Crops,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650205,China)
Abstract:The Ag⁃SiO2 core⁃shell nanoparticles were prepared􀆰 The mean size of the nanoparticles was
92􀆰 9 nm,and the nanoparticles demonstrated the activity of growth inhibition on Fusarium oxysporum
f􀆰 sp􀆰 dianthi􀆰 The minimum inhibition concentration of the nanoparticles was 4 μg / mL􀆰 The nanoparticles
could restrain the mycelia growth and conidial regeneration of the fungus􀆰 Moreover, the antioxidant
enzyme activities of super oxygen dehydrogenases,catalase and peroxidase in mycelium were induced by
the nanoparticle treatment for 2~4 h􀆰 The results suggested that the induced reactive oxygen species were
also involved in the antimicrobial mechanism of the prepared nanoparticles􀆰
Key words:Ag⁃SiO2core⁃shell nanoparticles;antifungus;Fusarium oxysporum;reactive oxygen species
    金属 无机纳米核壳复合材料因同时具有纳米
粒径和复合组分,被广泛应用于传感器、催化、信息
存储、抗体检测、涂料、农业及植物研究等领域[1-3]。
通过制备 Ag SiO2核 壳型纳米粒,可以在提高核
心农药物质稳定性的同时,发挥缓释核心物质的效
果[4]。 Ag SiO2核壳型纳米粒以 SiO2壳层包裹
Ag+,可有效屏蔽内核 Ag+的相互作用,得到单分散
的核壳颗粒,其外层 SiO2具有良好的生物相容性和
多孔结构,保持了 Ag+的化学活性和催化活性。 同
时,细菌对 Ag+不易产生耐药性[5],是一种长效抗菌
剂[6]。 Kim 等[7]于 2007年发现 Ag SiO2核壳型纳
米粒具有较好的抑制细菌生长作用。 Zheng 等[8]的
研究表明:Ag SiO2核壳型纳米粒对 6 种植物病原
真菌具有强烈的抑制作用,但有关 Ag SiO2核壳型
纳米粒抗病原真菌的过程和机制研究则少见报道。
香石竹枯萎病是由镰刀菌(Fusarium oxysporum
f􀆰 sp􀆰 dianthi,race 2)侵染所致的土传病害,是对香
石竹最严重的病害之一,在世界各香石竹种植区均
有发生[9]。 此病在我国各香石竹种植区亦有普遍
发生,危害较重,昆明地区一般发病率为 10% ~
30%,重者达 70% ~ 80%[10],因此,亟须应用新的防
治方法。 笔者在前期研究的基础上,采用改进的
Stöber法制备 Ag SiO2复合纳米颗粒[11],并对复合
纳米颗粒结构进行了表征,研究 Ag SiO2纳米悬浮
液对镰刀菌菌丝、孢子生长的抑制及对真菌抗氧化
酶的影响,初步探讨了 Ag SiO2核壳型纳米粒的抑
菌机制,以期为 Ag SiO2核壳型纳米粒的抗菌应
用,以及为香石竹枯萎病的防治提供纳米抗菌技术
的理论参考。
1  材料与方法
1􀆰 1  试验菌株
香石 竹 镰 刀 菌 2 号 生 理 小 种 ( Fusarium
oxysporum f􀆰 sp􀆰 dianthi, race 2)由云南省农业科学
院园艺研究所提供。
1􀆰 2  试验材料及培养基
真菌培养均采用马铃薯固体培养基 (简称
PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基 (简称 PD)。
AgNO3、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、氨水、乙醇与
正硅酸四乙酯等均为国产分析纯。
1􀆰 3  Ag SiO2纳米粒的制备
Ag SiO2纳米粒的制备参考文献[11]的方法,
略作修改。 将 0􀆰 145 g CTAB 溶于 180 mL 去离子
水,加热并磁力搅拌使其充分溶解,加入 0􀆰 1 mol / L
的 AgNO3溶液 10 mL,于 5 min 内加入 5 mmol / L 抗
坏血酸溶液 10 mL,继续搅拌 30 min,加入 30%(体
积分数)氨水至 pH约为 6。 加入 50 mL无水乙醇与
1 mL 正硅酸四乙酯,室温继续搅拌 4 h。 将产物经
中速定性滤纸过滤,去离子水与无水乙醇洗涤,经
121 ℃、25 min 高压蒸气灭菌后,置于烘箱 100 ℃
烘干。
1􀆰 4  纳米粒的分析与表征
采用日本 Shimadzu公司 UV2401 PC 紫外 可
见分光光度计在波长 300 ~ 500 nm 范围内扫描,通
过观察银的特征吸收峰变化来判断反应过程中的
具体变化。 采用荷兰 Philips FEI 公司 XL30
ESEM TMP 环境扫描电镜观察 Ag SiO2纳米粒的
形貌、尺寸及分散情况;采用美国 PSS 公司的
380ZLS型粒径和电位分析仪测定粒径大小。
1􀆰 5  抑菌作用的测定
采用杯碟法测定 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌的
抑制作用[12]。 将 Ag SiO2纳米粒用 PD 液体培养
基分别稀释成 0、2、4、8、16、32、64 和 128 μg / mL,备
用。 取 15 mL灭菌后的 PDA 培养基置于直径 9 cm
培养皿中,作为下层培养基,再将 10 mL 含有 105
个 / mL镰刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却后的
下层 PDA培养基上,静置冷却 1 h。 而后在每块平
板上放置 4个牛津杯(直径 0􀆰 6 cm,高 1􀆰 0 cm),分
别向每个牛津杯内加入 100 μL 不同浓度 Ag SiO2
纳米粒悬浮液,水平放置直到液体完全渗透到培养
基中。 将处理后的平板置于(28±1)℃培养箱中,以
PD液体培养基为对照,培养 3 d后观察抑菌效果。
1􀆰 6  菌丝和孢子生长的显微观察
取 15 mL灭菌后的 PDA 培养基置于 9 cm 培养
皿中,作为下层培养基。 将 10 mL 含有 105个 / mL 镰
刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却后的下层 PDA
培养基上,静置冷却 1 h。 而后在每块平板上放置 4
个牛津杯,分别加入 100 μL用 PD液体培养基稀释的
Ag SiO2纳米粒(32 μg / mL)和 PD液体培养基,水平
放置直到液体完全渗透到培养基中。 将处理后的平
板置于(28±1)℃培养箱中,每个处理 3 次重复。 培
养 3 d后,在体视显微镜下观察菌丝形态,研究 Ag
SiO2纳米粒对镰刀菌菌丝生长的影响。
采用凹玻片水滴法观察 Ag SiO2纳米粒对镰
刀菌孢子生长的影响,吸取 100 μL孢子悬浮液以及
100 μL纳米银溶液混匀后,滴在载玻片上,加盖盖
玻片,置于带湿海绵的培养皿内,将培养皿放入
(28±1)℃培养箱内暗培养,分别于 48、96 h 后在倒
置显微镜下镜检孢子的生长发育情况。
1􀆰 7  菌体蛋白含量及抗氧化相关酶活性的测定
在 PDA平板中接种镰刀菌,培养 3 d 后,用打
孔器打取直径 4 mm的菌碟,转接到 PDA 液体培养
基中,静置培养 5 d 后,取出长好的镰刀菌菌丝体,
用蒸馏水冲洗 3次后用吸水纸吸干,准确称取质量
0􀆰 25 g 菌丝,分别放入 100 mL 纳米银(32 μg / mL)
溶液和蒸馏水对照溶液中浸泡 2、4、10和 20 h,菌丝
25 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
体过滤取出后用蒸馏水冲洗 3 次后用吸水纸吸干,
加入 0􀆰 86%生理盐水 3 mL 在冰浴下研磨,3 000
r / min离心 15 min,取上清液,置于 4 ℃冰箱保存,待
用。 待测液蛋白质含量通过 Bradford 法[13]测定。
蛋白质含量标准曲线利用不同浓度牛血清白蛋白
标准溶液绘制。 超氧化物歧化酶活力采用 NBT 法
测定[14]。 过氧化氢酶酶活力测定参照文献[15]的
方法,过氧化物酶活力测定参照文献[16]的方法。
2  结果与讨论
2􀆰 1  Ag SiO2纳米粒的制备及表征分析
对 Ag SiO2纳米粒形成过程进行了紫外光谱
分析,如图 1 (a)所示。 由图 1(a)可知,随着抗坏血
酸的加入,410 nm附近逐渐出现吸收峰,为单质 Ag+
的特征吸收峰[17]。 说明随着反应的进行有 Ag+被
还原出来。 而随后检测发现,在 410 nm附近 Ag+特
征吸收峰存在一定的红移,从 408 nm处到 414 nm,
提示 Ag+纳米粒逐渐被 SiO2外壳所包覆,这与参考
文献[11]报道一致。 而环境扫描电镜显示(图 1
(b))纳米粒为近似球形,粒径约为 100 nm。 为进一
步确定 Ag SiO2纳米粒的平均粒径,试样经乙醇分
散,去离子水稀释后通过激光粒度仪测定 (图 1
(c)),3次重复实验结果显示所制备纳米粒平均粒
径为 92􀆰 9 nm。
图 1  Ag SiO2纳米粒的表征
Fig􀆰 1  Characterization of Ag⁃SiO2nanoparticles
2􀆰 2  对镰刀菌的生长抑制作用
图 2为 Ag SiO2纳米溶液对镰刀菌的生长抑制
实验结果。 由图 2可知,在抑菌圈试验中,Ag SiO2
纳米溶液对镰刀菌表现出良好的抑制作用,最低抑
菌质量浓度(MIC)为 4 μg / mL,且抑制效果随浓度
增大而增强,在 32 μg / mL 条件下,其抑制效果最
好。 在后续实验中以此浓度进一步实验。
a~ g—经 2、4、8、16、32、64和 128 μg / mL
Ag SiO2纳米溶液处理过的试样;h—空白对照)
图 2  Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌的
生长抑制影响
Fig􀆰 2  Effects of the Ag⁃SiO2 nanoparticles on growth
inhibition of Fusarium oxysporum f􀆰 sp􀆰 dianthi
图 3为 Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌菌丝生
长形态的影响结果。 由图 3 可知: 在 32 μg / mL
Ag SiO2纳米粒作用下,镰刀菌菌丝体的生长呈现
异常状态,菌丝较细、分支减少、欲折、透明度差,而
对照菌丝生长正常、粗细均匀、分支较多、透明度较
大。 由此可知,Ag SiO2纳米粒可能会促使镰刀菌
畸变,使其无法正常生长,失去侵染植物能力。
a—对照菌丝;b—经 28 ℃培养 48 h、
32 μg / mL Ag SiO2纳米粒处理
图 3  Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌
菌丝生长形态的影响
Fig􀆰 3  Effects of Ag⁃SiO2nanoparticles on mycelia
growth of Fusarium oxysporum f􀆰 sp􀆰 Dianthi
35  第 2期 陆  露等:Ag SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用
以不同浓度 Ag SiO2纳米粒处理镰刀菌孢子,
在 24 、72 h对孢子形态结构进行了观察,结果如图
4所示。 由图 4可知:在对照条件下,一个产孢细胞
上可相继形成多个产孢位点,每个产孢位点以吹泡
式产生全壁芽殖式分生孢子。 且随着纳米银浓度
的加大,产孢位点逐渐减少,并不能正常分生出小
孢子。 后续实验观察到,在高浓度纳米银处理组
(128 μg / mL)作用下,菌丝已经无法分生出孢子。
注:培养温度为 28 ℃;a~ d—培养时间 24 h;e~ h—培养时间 72 h;
Ag SiO2纳米粒处理浓度:a,e为 0 μg / mL; b,f为 16 μg / mL; c,g为 32 μg / mL; d,h为 64 μg / mL。
图 4  Ag SiO2纳米粒浓度对香石竹镰刀菌孢子形态的影响
Fig􀆰 4  Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles concertration on spore morphology of Fusarium oxysporum f􀆰 sp􀆰 Dianthi
2􀆰 3  Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的影响
考察 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的
影响,结果见图 5。 由图 5 可知:经 32 μg / mL Ag
SiO2纳米粒处理后,发现镰刀菌菌体的可溶性蛋白
含量变化范围较小,处理 4 h后,菌体中可溶性蛋白
含量比对照升高了 8􀆰 50%,而处理 20 h则比对照降
低了 1􀆰 47%。 这与孙冬梅等[18]报道的纳米银对大
豆菌核病核盘菌的抑制中可溶性蛋白变化相一致,
而一些研究者也发现某些抑菌剂能抑制菌体蛋白
质的合成[19],推测 Ag SiO2纳米粒对菌体的抑制并
非通过抑制蛋白质的合成而起作用。
图 5  Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白的影响
Fig􀆰 5  Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles on
mycelium protein content of Fusarium
oxysporum f􀆰 sp􀆰 dianthi
2􀆰 4  Ag SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性的影响
图 6为 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性
的影响结果。 由图 6 可知:经 Ag SiO2纳米粒处理
后,镰刀菌菌体的总超氧化物歧化酶(SOD)活性增
加,处理 4 h后比对照组活性升高了 28􀆰 14%,说明
过氧化氢酶(CAT)在活性氧代谢中发挥重要的作
用,是清除 H2O2的主要酶类。 菌丝处理 2、4 h 后,
菌体过氧化氢酶活性分别比对照升高了 48􀆰 18%、
37􀆰 09%,而处理 10、20 h 比对照降低了 15􀆰 00%、
46􀆰 93%。 Ag SiO2纳米粒处理后镰刀菌菌体过氧
化物酶(POD)活性变化较大,处理 2、4、10 h分别比
对照升高 170􀆰 42%、98􀆰 68%、36􀆰 69%。 处理 20 h比
对照降低了 47􀆰 16%。
3  结  论
本文以 AgNO3作为 Ag
+来源,利用抗坏血酸对
其进行还原生成银纳米粒核心;利用正硅酸四乙酯
的水解与聚合反应获得 SiO2,使其包裹在银核心外
形成介孔外壳,最终制备 Ag SiO2核壳型纳米粒,
平均粒径约为 92􀆰 9 nm,发现可以有效地抑制香石
竹镰刀菌的生长,且最小抑菌质量浓度为 4 μg / mL。
进一步实验结果表明: Ag SiO2核壳型纳米粒
可能通过真菌中活性氧的诱导产生,导致菌丝生长
45 生  物  加  工  过  程    第 12卷 
图 6  Ag SiO2纳米粒对镰刀菌总 SOD、
CAT和 POD活性的影响
Fig􀆰 6  Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles on SOD(a),
CAT(b) and POD(c) activity of Fusarium
oxysporum f􀆰 sp􀆰 dianthi mycelium
畸形、孢子分生困难,从而抑制真菌的生长。 随着
纳米银材料在医药领域上的广泛应用,纳米银的制
备,抗菌和抗肿瘤机制被越来越深入地探讨,但在
农业上的应用还少见报道,本研究为其在植物病原
真菌防治上的应用提供了 Ag SiO2核壳型纳米粒
合成的方法,该方法简单有效且低成本。 由此可见
深入了解纳米银的抗菌机制,对于实现及农业应用
也非常重要。
参考文献:
[ 1 ]  Chen Y Y,Wang C,Liu H Y,et al􀆰 Ag / SiO2:a novel catalyst with
high activity and selectivity for hydrogenation of chloronitrobenzenes
[J].Chemical Communications,2005,42:5298⁃5300􀆰
[ 2 ]   Ung T,Liz⁃Marzán L M,Mulvaney P􀆰 Redox catalysis using Ag@
SiO2 colloids [ J] . Journal of Physical Chemistry B, 1999, 103
(32):6770⁃6773􀆰
[ 3 ]   Nair R,Varghese S H,Nair B G,et al􀆰 Nanoparticulate material
delivery to plants[J] .Plant Sciences,2010,179:154⁃163􀆰
[ 4 ]   Li Z,Chen J, Liu F, et al􀆰 Study of UV⁃shielding properties of
novel porous hollow silica nanoparticle carriers for avermectin[J] .
Pest Management Science,2007,63(3):241⁃246􀆰
[ 5 ]   魏秋华,张文福,王长德,等.皮肤纳米乳液杀菌规律的研究
[J] .中国消毒学杂志,2004,21(4):279􀆰
[ 6 ]   Ait V,Bechert T,Steinrucke P,et al􀆰 An in vitro assessment of
the antibacterial properties and cytotoxicity of nanoparticulate
silver bone cement[J] .Biomaterials,2004,25(18):4383⁃4391􀆰
[ 7 ]   Kim Y H,Lee D K,Cha H G,et al􀆰 Synthesis and characterization
of antibacterial Ag⁃SiO2 nanocomposite [ J] . Journal of Physical
Chemistry C,2007,111(9):3629⁃3635􀆰
[ 8 ]   Zheng L P,Zhang Z,Zhang B,et al􀆰 Antifungal properties of Ag⁃
SiO2 core⁃shell nanoparticles against phytopathogenic fungi [ J] .
Advanced Materials Research,2012,476⁃478:814⁃818􀆰
[ 9 ]   Garibaldi A, Gullino M􀆰 Fusariumwilt of carnation: present
situation,problems andperspectives[J] .Acta Horticulturae,1987,
216:45⁃54􀆰
[10]   王国良,任善于,应兴德.香石竹萎蔫病病原的初步研究[ J] .
植物病理学报,1998,28(1):61⁃65􀆰
[11]   Xu K, Wang J, Kang X, et al􀆰 Fabrication of antibacterial
monodispersed Ag⁃SiO2 core⁃shell nanoparticles with high
concentration[J] .Materials Letters,2009,63:31⁃33􀆰
[12]   温志强,林太礼,廖朝阳.三种杀菌剂对木霉菌及食用菌的毒
力测定[J] .福建农业大学学报:自然科学版, 2001,30(1):
48⁃52􀆰
[13]   Bradford M M􀆰 A rapid and sensitive method for the quantitation
of microgram quantities of protein utilizing the principle of
protein⁃dye binding [ J ] . Analytical Biochemistry, 1976, 72:
248⁃254􀆰
[14]   Constantine N G,Stanley K R􀆰 Superoxide dismutases[ J] . Plant
Physiology,1977,59:309⁃314􀆰
[15]   Zhou B,Guo Z,Xing J,et al􀆰 Nitric oxide is involved in abscisic
acid⁃induced antioxidant activities in Stylosanthes guianensis[ J] .
Journal of Experimental Botany,2005,56:3223⁃3228􀆰
[16]   Dias A, Costa M􀆰 Effect of low salt concentrations on nitrate
reductase and peroxidase of sugar beet leaves [ J] . Journal of
Experimental Botany,1983,34:537⁃543􀆰
[17]   徐冉,李薇.Ag2O胶体粒子的自组装单层膜和多层膜[ J] .光
散射学报,1999,11(2):151⁃154􀆰
[18]   孙冬梅,林志伟,迟莉,等.纳米银对大豆菌核病核盘菌的抑
制作用研究[J] .大豆科学,2010,29(4):673⁃676􀆰
[19]   王兴全,张新虎,杨顺义,等.苍耳提取物对番茄灰霉病菌抑
制机理的研究[J] .甘肃农业大学学报:自然科学版, 2008,6
(3):107⁃110􀆰
(责任编辑  周晓薇)
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