全 文 :第 12卷第 2期
2014年 3月
生 物 加 工 过 程
Chinese Journal of Bioprocess Engineering
Vol 12 No 2
Mar 2014
doi:10 3969 / j issn 1672-3678 2014 02 010
收稿日期:2012-10-19
基金项目:国家教育部留学基金(K513201011);大学生课外学术科研基金(KY2013558B)
作者简介:陆 露(1987—),女,黑龙江延寿人,硕士研究生,研究方向:微生物与生化药物;王剑文(联系人),研究员,E⁃mail: jwwang@
suda edu cn
Ag SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用
陆 露1,郑丽屏2,赵培飞3,王剑文1
(1 苏州大学 医学部 药学院,苏州 215123; 2 苏州大学 金螳螂建筑与城市环境学院,苏州 215123;
3 云南省农业科学院 园艺作物研究所,昆明 650205)
摘 要:利用抗坏血酸对 AgNO3进行还原,生成银纳米粒核心,并通过正硅酸四乙酯的水解与聚合反应获得 SiO2介孔
外壳,制备平均粒径约为 92 9 nm的 Ag SiO2核 壳型纳米粒。 Ag SiO2纳米粒可以显著地抑制香石竹镰刀菌的生
长,最小抑菌质量浓度为 4 μg / mL,并可抑制香石竹镰刀菌菌丝生长和孢子分生。 Ag SiO2纳米粒处理 2~4 h后,菌
丝体的过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶、过氧化物酶活力增强,提示 Ag SiO2纳米粒抗菌机制和活性氧诱导相关。
关键词:银 二氧化硅核壳型纳米粒;抑菌;香石竹镰刀菌;活性氧
中图分类号:Q939 95 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2014)02-0051-05
Preparation and antifungal activity of Ag⁃SiO2core⁃shell nanoparticles
LU Lu1,ZHENG Liping2,ZHAO Peifei3,WANG Jianwen1
(1 School of Pharmaceutical Sciences,Medical College,Soochow University,Suzhou 215123,China;
2 Jintanglang School of Architecture and Urban Environment,Soochow University,Suzhou 215123,China;
3 Institute of Horticultural Crops,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kunming 650205,China)
Abstract:The Ag⁃SiO2 core⁃shell nanoparticles were prepared The mean size of the nanoparticles was
92 9 nm,and the nanoparticles demonstrated the activity of growth inhibition on Fusarium oxysporum
f sp dianthi The minimum inhibition concentration of the nanoparticles was 4 μg / mL The nanoparticles
could restrain the mycelia growth and conidial regeneration of the fungus Moreover, the antioxidant
enzyme activities of super oxygen dehydrogenases,catalase and peroxidase in mycelium were induced by
the nanoparticle treatment for 2~4 h The results suggested that the induced reactive oxygen species were
also involved in the antimicrobial mechanism of the prepared nanoparticles
Key words:Ag⁃SiO2core⁃shell nanoparticles;antifungus;Fusarium oxysporum;reactive oxygen species
金属 无机纳米核壳复合材料因同时具有纳米
粒径和复合组分,被广泛应用于传感器、催化、信息
存储、抗体检测、涂料、农业及植物研究等领域[1-3]。
通过制备 Ag SiO2核 壳型纳米粒,可以在提高核
心农药物质稳定性的同时,发挥缓释核心物质的效
果[4]。 Ag SiO2核壳型纳米粒以 SiO2壳层包裹
Ag+,可有效屏蔽内核 Ag+的相互作用,得到单分散
的核壳颗粒,其外层 SiO2具有良好的生物相容性和
多孔结构,保持了 Ag+的化学活性和催化活性。 同
时,细菌对 Ag+不易产生耐药性[5],是一种长效抗菌
剂[6]。 Kim 等[7]于 2007年发现 Ag SiO2核壳型纳
米粒具有较好的抑制细菌生长作用。 Zheng 等[8]的
研究表明:Ag SiO2核壳型纳米粒对 6 种植物病原
真菌具有强烈的抑制作用,但有关 Ag SiO2核壳型
纳米粒抗病原真菌的过程和机制研究则少见报道。
香石竹枯萎病是由镰刀菌(Fusarium oxysporum
f sp dianthi,race 2)侵染所致的土传病害,是对香
石竹最严重的病害之一,在世界各香石竹种植区均
有发生[9]。 此病在我国各香石竹种植区亦有普遍
发生,危害较重,昆明地区一般发病率为 10% ~
30%,重者达 70% ~ 80%[10],因此,亟须应用新的防
治方法。 笔者在前期研究的基础上,采用改进的
Stöber法制备 Ag SiO2复合纳米颗粒[11],并对复合
纳米颗粒结构进行了表征,研究 Ag SiO2纳米悬浮
液对镰刀菌菌丝、孢子生长的抑制及对真菌抗氧化
酶的影响,初步探讨了 Ag SiO2核壳型纳米粒的抑
菌机制,以期为 Ag SiO2核壳型纳米粒的抗菌应
用,以及为香石竹枯萎病的防治提供纳米抗菌技术
的理论参考。
1 材料与方法
1 1 试验菌株
香石 竹 镰 刀 菌 2 号 生 理 小 种 ( Fusarium
oxysporum f sp dianthi, race 2)由云南省农业科学
院园艺研究所提供。
1 2 试验材料及培养基
真菌培养均采用马铃薯固体培养基 (简称
PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基 (简称 PD)。
AgNO3、溴化十六烷基三甲铵(CTAB)、氨水、乙醇与
正硅酸四乙酯等均为国产分析纯。
1 3 Ag SiO2纳米粒的制备
Ag SiO2纳米粒的制备参考文献[11]的方法,
略作修改。 将 0 145 g CTAB 溶于 180 mL 去离子
水,加热并磁力搅拌使其充分溶解,加入 0 1 mol / L
的 AgNO3溶液 10 mL,于 5 min 内加入 5 mmol / L 抗
坏血酸溶液 10 mL,继续搅拌 30 min,加入 30%(体
积分数)氨水至 pH约为 6。 加入 50 mL无水乙醇与
1 mL 正硅酸四乙酯,室温继续搅拌 4 h。 将产物经
中速定性滤纸过滤,去离子水与无水乙醇洗涤,经
121 ℃、25 min 高压蒸气灭菌后,置于烘箱 100 ℃
烘干。
1 4 纳米粒的分析与表征
采用日本 Shimadzu公司 UV2401 PC 紫外 可
见分光光度计在波长 300 ~ 500 nm 范围内扫描,通
过观察银的特征吸收峰变化来判断反应过程中的
具体变化。 采用荷兰 Philips FEI 公司 XL30
ESEM TMP 环境扫描电镜观察 Ag SiO2纳米粒的
形貌、尺寸及分散情况;采用美国 PSS 公司的
380ZLS型粒径和电位分析仪测定粒径大小。
1 5 抑菌作用的测定
采用杯碟法测定 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌的
抑制作用[12]。 将 Ag SiO2纳米粒用 PD 液体培养
基分别稀释成 0、2、4、8、16、32、64 和 128 μg / mL,备
用。 取 15 mL灭菌后的 PDA 培养基置于直径 9 cm
培养皿中,作为下层培养基,再将 10 mL 含有 105
个 / mL镰刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却后的
下层 PDA培养基上,静置冷却 1 h。 而后在每块平
板上放置 4个牛津杯(直径 0 6 cm,高 1 0 cm),分
别向每个牛津杯内加入 100 μL 不同浓度 Ag SiO2
纳米粒悬浮液,水平放置直到液体完全渗透到培养
基中。 将处理后的平板置于(28±1)℃培养箱中,以
PD液体培养基为对照,培养 3 d后观察抑菌效果。
1 6 菌丝和孢子生长的显微观察
取 15 mL灭菌后的 PDA 培养基置于 9 cm 培养
皿中,作为下层培养基。 将 10 mL 含有 105个 / mL 镰
刀菌的 PDA 培养基均匀覆盖在冷却后的下层 PDA
培养基上,静置冷却 1 h。 而后在每块平板上放置 4
个牛津杯,分别加入 100 μL用 PD液体培养基稀释的
Ag SiO2纳米粒(32 μg / mL)和 PD液体培养基,水平
放置直到液体完全渗透到培养基中。 将处理后的平
板置于(28±1)℃培养箱中,每个处理 3 次重复。 培
养 3 d后,在体视显微镜下观察菌丝形态,研究 Ag
SiO2纳米粒对镰刀菌菌丝生长的影响。
采用凹玻片水滴法观察 Ag SiO2纳米粒对镰
刀菌孢子生长的影响,吸取 100 μL孢子悬浮液以及
100 μL纳米银溶液混匀后,滴在载玻片上,加盖盖
玻片,置于带湿海绵的培养皿内,将培养皿放入
(28±1)℃培养箱内暗培养,分别于 48、96 h 后在倒
置显微镜下镜检孢子的生长发育情况。
1 7 菌体蛋白含量及抗氧化相关酶活性的测定
在 PDA平板中接种镰刀菌,培养 3 d 后,用打
孔器打取直径 4 mm的菌碟,转接到 PDA 液体培养
基中,静置培养 5 d 后,取出长好的镰刀菌菌丝体,
用蒸馏水冲洗 3次后用吸水纸吸干,准确称取质量
0 25 g 菌丝,分别放入 100 mL 纳米银(32 μg / mL)
溶液和蒸馏水对照溶液中浸泡 2、4、10和 20 h,菌丝
25 生 物 加 工 过 程 第 12卷
体过滤取出后用蒸馏水冲洗 3 次后用吸水纸吸干,
加入 0 86%生理盐水 3 mL 在冰浴下研磨,3 000
r / min离心 15 min,取上清液,置于 4 ℃冰箱保存,待
用。 待测液蛋白质含量通过 Bradford 法[13]测定。
蛋白质含量标准曲线利用不同浓度牛血清白蛋白
标准溶液绘制。 超氧化物歧化酶活力采用 NBT 法
测定[14]。 过氧化氢酶酶活力测定参照文献[15]的
方法,过氧化物酶活力测定参照文献[16]的方法。
2 结果与讨论
2 1 Ag SiO2纳米粒的制备及表征分析
对 Ag SiO2纳米粒形成过程进行了紫外光谱
分析,如图 1 (a)所示。 由图 1(a)可知,随着抗坏血
酸的加入,410 nm附近逐渐出现吸收峰,为单质 Ag+
的特征吸收峰[17]。 说明随着反应的进行有 Ag+被
还原出来。 而随后检测发现,在 410 nm附近 Ag+特
征吸收峰存在一定的红移,从 408 nm处到 414 nm,
提示 Ag+纳米粒逐渐被 SiO2外壳所包覆,这与参考
文献[11]报道一致。 而环境扫描电镜显示(图 1
(b))纳米粒为近似球形,粒径约为 100 nm。 为进一
步确定 Ag SiO2纳米粒的平均粒径,试样经乙醇分
散,去离子水稀释后通过激光粒度仪测定 (图 1
(c)),3次重复实验结果显示所制备纳米粒平均粒
径为 92 9 nm。
图 1 Ag SiO2纳米粒的表征
Fig 1 Characterization of Ag⁃SiO2nanoparticles
2 2 对镰刀菌的生长抑制作用
图 2为 Ag SiO2纳米溶液对镰刀菌的生长抑制
实验结果。 由图 2可知,在抑菌圈试验中,Ag SiO2
纳米溶液对镰刀菌表现出良好的抑制作用,最低抑
菌质量浓度(MIC)为 4 μg / mL,且抑制效果随浓度
增大而增强,在 32 μg / mL 条件下,其抑制效果最
好。 在后续实验中以此浓度进一步实验。
a~ g—经 2、4、8、16、32、64和 128 μg / mL
Ag SiO2纳米溶液处理过的试样;h—空白对照)
图 2 Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌的
生长抑制影响
Fig 2 Effects of the Ag⁃SiO2 nanoparticles on growth
inhibition of Fusarium oxysporum f sp dianthi
图 3为 Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌菌丝生
长形态的影响结果。 由图 3 可知: 在 32 μg / mL
Ag SiO2纳米粒作用下,镰刀菌菌丝体的生长呈现
异常状态,菌丝较细、分支减少、欲折、透明度差,而
对照菌丝生长正常、粗细均匀、分支较多、透明度较
大。 由此可知,Ag SiO2纳米粒可能会促使镰刀菌
畸变,使其无法正常生长,失去侵染植物能力。
a—对照菌丝;b—经 28 ℃培养 48 h、
32 μg / mL Ag SiO2纳米粒处理
图 3 Ag SiO2纳米粒对香石竹镰刀菌
菌丝生长形态的影响
Fig 3 Effects of Ag⁃SiO2nanoparticles on mycelia
growth of Fusarium oxysporum f sp Dianthi
35 第 2期 陆 露等:Ag SiO2核壳型纳米粒的制备及其抗菌作用
以不同浓度 Ag SiO2纳米粒处理镰刀菌孢子,
在 24 、72 h对孢子形态结构进行了观察,结果如图
4所示。 由图 4可知:在对照条件下,一个产孢细胞
上可相继形成多个产孢位点,每个产孢位点以吹泡
式产生全壁芽殖式分生孢子。 且随着纳米银浓度
的加大,产孢位点逐渐减少,并不能正常分生出小
孢子。 后续实验观察到,在高浓度纳米银处理组
(128 μg / mL)作用下,菌丝已经无法分生出孢子。
注:培养温度为 28 ℃;a~ d—培养时间 24 h;e~ h—培养时间 72 h;
Ag SiO2纳米粒处理浓度:a,e为 0 μg / mL; b,f为 16 μg / mL; c,g为 32 μg / mL; d,h为 64 μg / mL。
图 4 Ag SiO2纳米粒浓度对香石竹镰刀菌孢子形态的影响
Fig 4 Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles concertration on spore morphology of Fusarium oxysporum f sp Dianthi
2 3 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的影响
考察 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白含量的
影响,结果见图 5。 由图 5 可知:经 32 μg / mL Ag
SiO2纳米粒处理后,发现镰刀菌菌体的可溶性蛋白
含量变化范围较小,处理 4 h后,菌体中可溶性蛋白
含量比对照升高了 8 50%,而处理 20 h则比对照降
低了 1 47%。 这与孙冬梅等[18]报道的纳米银对大
豆菌核病核盘菌的抑制中可溶性蛋白变化相一致,
而一些研究者也发现某些抑菌剂能抑制菌体蛋白
质的合成[19],推测 Ag SiO2纳米粒对菌体的抑制并
非通过抑制蛋白质的合成而起作用。
图 5 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌体蛋白的影响
Fig 5 Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles on
mycelium protein content of Fusarium
oxysporum f sp dianthi
2 4 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性的影响
图 6为 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌抗氧化酶活性
的影响结果。 由图 6 可知:经 Ag SiO2纳米粒处理
后,镰刀菌菌体的总超氧化物歧化酶(SOD)活性增
加,处理 4 h后比对照组活性升高了 28 14%,说明
过氧化氢酶(CAT)在活性氧代谢中发挥重要的作
用,是清除 H2O2的主要酶类。 菌丝处理 2、4 h 后,
菌体过氧化氢酶活性分别比对照升高了 48 18%、
37 09%,而处理 10、20 h 比对照降低了 15 00%、
46 93%。 Ag SiO2纳米粒处理后镰刀菌菌体过氧
化物酶(POD)活性变化较大,处理 2、4、10 h分别比
对照升高 170 42%、98 68%、36 69%。 处理 20 h比
对照降低了 47 16%。
3 结 论
本文以 AgNO3作为 Ag
+来源,利用抗坏血酸对
其进行还原生成银纳米粒核心;利用正硅酸四乙酯
的水解与聚合反应获得 SiO2,使其包裹在银核心外
形成介孔外壳,最终制备 Ag SiO2核壳型纳米粒,
平均粒径约为 92 9 nm,发现可以有效地抑制香石
竹镰刀菌的生长,且最小抑菌质量浓度为 4 μg / mL。
进一步实验结果表明: Ag SiO2核壳型纳米粒
可能通过真菌中活性氧的诱导产生,导致菌丝生长
45 生 物 加 工 过 程 第 12卷
图 6 Ag SiO2纳米粒对镰刀菌总 SOD、
CAT和 POD活性的影响
Fig 6 Effects of Ag⁃SiO2 nanoparticles on SOD(a),
CAT(b) and POD(c) activity of Fusarium
oxysporum f sp dianthi mycelium
畸形、孢子分生困难,从而抑制真菌的生长。 随着
纳米银材料在医药领域上的广泛应用,纳米银的制
备,抗菌和抗肿瘤机制被越来越深入地探讨,但在
农业上的应用还少见报道,本研究为其在植物病原
真菌防治上的应用提供了 Ag SiO2核壳型纳米粒
合成的方法,该方法简单有效且低成本。 由此可见
深入了解纳米银的抗菌机制,对于实现及农业应用
也非常重要。
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(责任编辑 周晓薇)
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