全 文 ：水!有机溶剂介质中固定化不动杆菌细胞催化拆分
（!"）!环戊烯酮乙酸酯的研究
陈 亚，许建和!，潘 江，徐 毅
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 "##"$%）
摘 要：不动杆菌 &’(&& #%)*的海藻酸凝胶包埋固定化细胞可高对映选择性地水解拆分环戊烯酮（简称 +(,&）乙
酸酯。异丙醇对固定化细胞的活力和对映选择性有显著提高。反应体系中异丙醇浓度为 -#.（体积分数，全文同）
时，固定化细胞的活力最高，为 /0"" 1123 4（5·167·8）细胞干重，是未添加异丙醇的对照组的 -9#.。此时 # 值为 *:
; /，是对照组的 -0%倍。以光学纯环戊烯酮乙酸酯为底物，对部分纯化的不动杆菌酯酶进行了动力学考察。通过
动力学参数推算，-#.异丙醇存在时，酯酶的对映选择性（#值）为 $/09，是空白的 "0$倍。-#.异丙醇存在下，固定
化细胞仍具有良好的操作稳定性。连续反应 -#批，固定化细胞的活力保持良好。
关键词：不动杆菌酯酶；酶法拆分；环戊烯酮；固定化细胞；异丙醇
中图分类号： $/%)（"##:）#: > ##"" > #:
!"#"$%#&’ ()*+$,#&+- +.（!"）/012! "’)#"#) 3% &44+3&$&5)6 ’)$$* +.
#$%&’()*+$(’, *7 0 !81!! #%)* &- " 9"#)(/+(:"-&’ *+$;)-# 4)6&,4
&+?@ AB，CD E6B7!FG，,=@ E6B78，CD A6
（5BH2IBJ2IK 2L M62NBJB3KO6O B7P M62QI2NGOO678，RJBJG SGK 5BH2IBJ2IK 2L M62IGBNJ2I ?7867GGI678，
?BOJ &F67B D76TGIO6JK 2L RN6G7NG B7P UGNF72328K，RFB78FB6 "##"$%，&F67B）
<3*#("’#：+68F3K G7B7J62OG3GNJ6TG FKPI23KO6O 2L +(,& BNGJBJG VBO OWNNGOOLW33K NBII6GP 2WJ WO678 NB3N6W1 B386!
7BJG 8G3!G7JIBQQGP $%&’()*+,%)(- OQ0 &’(&& #%)* NG33O0 ?LLGNJ 2L P6LLGIG7J N2O23TG7JO VBO 67TGOJ68BJGP B7P
6O2QI2QB723 1BIXGP3K G7FB7NGP JFG BNJ6T6JK B7P G7B7J62OG3GNJ6T6JK 2L 6112H636YGP NG33O0 UFG F68FGOJ BNJ6T6JK 2L
6112H636YGP NG33O IGBNFGP /0"" 1123 4（5·167·8）WQ27 BPP6J627 2L -#.（ . / .）6O2QI2QB723，-9#. F68FGI
JFB7 JFBJ 2L JFG N27JI23 V6JF2WJ 6O2QI2QB723 B7P JFG #!TB3WG VBO *: ; /，-0%!L23P F68FGI JFB7 JFG N27JI23 0 UFG
NBJB3KJ6N OQGN6L6N6JK N27OJB7JO（01BZ 4 11）L2I H2JF G7B7J621GI 2L JFG OWHOJIBJG VGIG PGJGI167GP V6JF QBIJ6B33K
QWI6L6GP G7YK1G0 &B3NW3BJGP LI21 JFGOG N27OJB7JO，JFG ?!TB3WG VBO $/09 67 JFG QIGOG7NG 2L -#. 6O2QI2QB723，
"0$!L23P F68FGI JFB7 JFBJ V6JF2WJ 6O2QI2QB7230 [112H636YGP NG33O OF2VGP 822P 2QGIBJ627B3 OJBH636JK 67 -#. 6O2!
QI2QB7230 @2 O6876L6NB7J BNJ6T6JK PGNIGBOG VBO 2HOGITGP BLJGI -# NKN3GO 2L IGBNJ6270
=)% 9+(6*：$%&’()*+,%)(- OQ0；G7YK1BJ6N IGO23WJ627；:!FKPI2ZK!$!1GJFK3!"!（"!QI2QG7K3）!"!NKN32QG7JG727G
（+(,&）；6112H636YGP NG33O；6O2QI2QB723
收稿日期："##:!--!-9
基金项目：上海市重点科技项目（#$\]-*"#%），国家 *%$计划（"##$&M%-/##)）资助。
作者简介：陈 亚（-*/* >），女，硕士，讲师。研究方向：酶促手性拆分。
联系人：许建和，男，教授，博士生导师。?1B63：^6B7FGZW_GNWOJ0 GPW0 N70
@2T‘ "##:
·""·
生 物 加 工 过 程
&F67GOG E2WI7B3 2L M62QI2NGOO ?7867GGI678
第 "卷第 :期
"##:年 --月
万方数据
拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂，具有高效、安
全、杀虫谱广的特性。!"羟基"#"甲基"$"（$%"烯丙
基）"$"环戊烯酮（简称 &’()），是拟除虫菊酯类农药
丙烯菊酯合成的重要中间体。&’()的两个对映体
中，（!）"构型是活性组分，含有（!）"&’()的丙烯菊
酯的杀虫活力是消旋丙烯菊酯的 !*+ 倍。目前，
（!）"&’()的合成受到了广泛的关注。
’,-./01等人［2］发现商品 "#$%#&’()$*# 脂肪酶可
高对映选择性地水解拆分消旋 &’()乙酸酯，底物
质量分数高达 345，转化率达到 645时可得到几乎
光学纯的（+）"&’()，残留高对映选择性的（ !）"&’"
()乙酸酯。将（+）"&’() 通过化学方法翻转即可
得到（!）"&’()。此外，有一些应用固定化脂肪酶通
过转酯化制备（!）"&’()的专利报道。用商品酶进
行拆分成本较高，人们希望能直接用微生物细胞对
消旋 &’()进行生物拆分。但长期以来直接用微生
物整体细胞拆分消旋 &’()的效果不令人满意，选
择性较差。在先前的研究中，我们实验室以 &’()
乙酸酯为模型底物，成功地筛选到一株高活力的细
菌［$］，经鉴定为不动杆菌，命名为 )7’)) 483+［#］。
该菌具有胞内酯酶活力［!］，优先水解（+）"&’()乙
酸酯，残留（ !）"&’() 乙酸酯，有很高的对映选择
性［6］，对其进行了发酵产酶优化。尽管如此，直接用
游离细胞作为催化剂，产物的分离提取繁琐，催化剂
的重复使用难以实现。用海藻酸钙包埋法对该菌细
胞进行了固定化，此方法简便，易于操作，成本低廉。
细胞固定化显著提高了整细胞催化剂的稳定性，并
降低了产物提取的难度。
图 2 （+，!）"&’()乙酸酯的动力学水解拆分
9,:;2 <,=>-,? @A0BCDA.,. B>.CD/-,C= CE（+，!）"&’() 1?>-1->
在反应介质中添加少量极性水溶性溶剂通常可
以提高酶的催化活力乃至增强其对映选择性。当溶
剂浓度较低时，催化剂的活力会随着溶剂的加入而
提高，当浓度达到 245 F $45时，活力最高。发现
添加异丙醇，固定化细胞水解拆分 &’()乙酸酯的
活力以及对映选择性有显著提高。进一步使用部分
纯化的不动杆菌酯酶以及对映纯的 &’()乙酸酯，
对异丙醇提高反应对映选择性的现象进行了动力学
的考察，结果表明，异丙醇的添加同时影响了底物的
结合以及酶的催化性能。本文在这些工作的基础
上，就异丙醇对不动杆菌固定化细胞催化 &’()乙
酸酯水解拆分的影响进行了探讨。
! 材料与方法
2*2 材料
消旋 &’()乙酸酯由扬农化工公司提供。其它
试剂为国产，最高纯度。
2*$ 微生物菌株
不动杆菌 )7’)) 483+，由本实验室赵玉巧等［$］
从土壤中筛选得到，保存于中国微生物保藏中心。
实验室菌种斜面 ! G保藏，每 #个月转接一次。
2*# 培养基及培养条件
发酵培养基：蔗糖 26*4 :，吐温"34 2*6 :，蛋白胨
8*6 :，酵母膏 8*6 :，<&$(H! $*4 :，I1)D $*4 :，
（I&!）$JH! $*4 :，’:JH!8&$H 4*$ :，自来水定容至 2
K，L& 8*4。
细胞培养采用 6 K搅拌发酵罐，装液量为 # K。
按 M5的接种量，接种预培养 2$ @ 的种子液。#4
G，!44 B N O,=，通气量为 # K N O,=（2 PPO）。培养 $! @
后 M 444 Q :离心，收集细胞，4*365生理盐水洗涤，
冻干，保存于 ! G。冻干细胞非常稳定，保存 M个月
没有显著活力损失。
2*! 海藻酸钙包埋固定化细胞
取冻干细胞悬浮于适量生理盐水中，与海藻酸钠
溶液混合搅匀，细胞终质量分数为 2*!5，海藻酸钠终
质量分数为 $*!5。混合物逐滴滴入 4*2 OCD N K 的
)1)D$溶液中，生成的固定化细胞在相同溶液中固化 $
@后，置于 24 OOCD N K )1)D$溶液中，! G保存待用。
$44!年 22月 陈 亚等：有机溶剂介质中固定化不动杆菌细胞催化拆分（+!）"环戊烯酮乙酸酯的研究 ·$#·
万方数据
!"# 固定化细胞水解 $%&’乙酸酯
称取 (") * 固定化细胞（湿重），悬浮于 !( +,
-./0缓冲液（!(( ++12 3 ,，4$5"(，含 #( ++12 3 , ’6’27
以及不同浓度的水溶性溶剂）中，加入消旋 $%&’乙
酸酯至终浓度为 !(( ++12 3 ,。混合物 8( 9，!)( . 3
+/:振摇。每次取 ("# +,反应液，等量乙酸乙酯萃
取，气相色谱分析。
一个活力单位（;）定义为每分钟水解生成 !
!+12 $%&’所需的酶量。
!") 气相色谱分析
乙酸乙酯萃取液用 <’=!>’气相色谱仪，?@-A
B@C-%手性柱进行分析。色谱条件：柱温 !#( 9，进
样器及检测器温度均为 75( 9。
对映选择率（!）的计算：! D 2:（（!= ""0）3（! E
""0 3 ""4））3 2:（（! E ""0）3（! E ""0 3 ""4））。其中 ""0 和
""4分别为底物 $%&’乙酸酯及水解产物 $%&’的
对映体过量值。
!"F 不动杆菌酯酶粗酶液以及光学纯 $%&’乙酸
酯的制备
不动杆菌酯酶部分纯化参见文献［>］。对映纯
（#）=$%&’乙酸酯（ G H5I ""）和对映富集的（$）=
$%&’由固定化细胞对消旋 $%&’乙酸酯水解拆分
而得，硅胶柱纯化。对映富集的（$）=$%&’加入醋
酸乙烯酯，用 &J脂肪酶进行转酯化反应，获得光学
纯的（$）=$%&’乙酸酯（ G H5I ""）。
! 结果与讨论
7"! 添加水溶性溶剂对固定化细胞活力的影响
$%&’乙酸酯在水中溶解度较低。在反应体系
中添加水溶性溶剂可以提高疏水性底物的溶解度，
并且能提高某些酶的活力，从而提高反应速率。本
文选择甲醇、乙醇、异丙醇、叔丁醇、丙酮、二甲基亚
砜、乙睛、四氢呋喃、二甲基甲酰胺等几种水溶性溶
剂，添加到反应体系中，考察它们对固定化细胞催化
的影响，溶剂的浓度均为 7(I。结果如图 7 所示，
与纯缓冲体系相比，添加醇类溶剂，反应 !7 K 后的
转化率显著提高，其中异丙醇的效果最明显。而其
它几种水溶性溶剂效果不明显，甚至对酶活有抑制
作用，转化率较低。
共溶剂异丙醇的浓度对固定化细胞的活力有显
著影响。如图 8所示，当异丙醇体积分数低于 !(I
时，固定化细胞的活力随异丙醇的加入而不断提高。
图 7 水溶性有机溶剂（7(I）对反应速率和对映选择性的影响
O/*P7 @QQNRS 1Q T6SN.=+/0R/U2N 012LN:S0（7(I，% & %）1: .N6RS/1:
.6SN 6:V N:6:S/10N2NRS/L/SW
异丙醇体积分数为 !(I时，固定化细胞的活力最
高，为 )"77 ++12 3（,·+/:·* B’X），与未添加异丙醇
的对照组（>"(H ++12 3（,·+/:·* B’X））相比，提高了
#(I。当异丙醇浓度继续提高，固定化细胞的活力
下降，但即使在异丙醇体积分数 7(I时，固定化细
胞的活力仍较对照组高。最终选择在反应体系中添
加 !(I的异丙醇。
图 8 异丙醇体积分数对固定化细胞活力的影响
O/*P8 @QQNRS 1Q /014.146:12 R1:RN:S.6S/1: 1: SKN 6RS/L/SW 1Q /++1=
U/2/YNV RN220
7"7 异丙醇对细胞膜的通透
不动杆菌 ’<%’’ (F5H 所产的酯酶为胞内酶，
异丙醇的加入会显著影响细胞膜的渗透性，从而提
高整细胞催化剂的催化活力。为考察异丙醇对细胞
通透性的影响，我们将固定化细胞置于 !(I异丙醇
溶液中进行预处理，在不同的时间取出进行活力测
定。如图 >所示，固定化细胞的活力随处理时间的
延长而增长，在 7> K达到最大，是未处理固定化细
胞的 !)7I。
同时，我们对经通透性预处理的固定化细胞进
行了对映选择性考察，结果表明与未处理固定化细
胞相比，对映选择性（! 值）相差不大，表明细胞通
透对固定化细胞的对映选择性几乎没有影响。
·7>· 生物加工过程 第 7卷第 >期
万方数据
图 ! 异丙醇（"#$）预处理对固定化细胞活力的影响
%&’(! )**+,- .* "#$（ ! " !）&/.01.023.4 01+5-1+2-6+3- .3 -7+ 2,5
-&8&-9 .* &66.:&4&;+< ,+44/
=>? 异丙醇对固定化细胞对映选择性的影响
如图 " 所示，在反应体系中加入 =#$的异丙
醇，不仅提高了反应转化率，还提高了固定化细胞的
对映选择性，其 # 值较空白对照有显著增长。
我们以消旋 @ABC乙酸酯为底物，考察了添加
与不加 "#$异丙醇的情况下，@ABC乙酸酯两个对
映体的固定化细胞催化水解进程曲线。由图 D可以
看出，体系中添加异丙醇，对于（$）5@ABC乙酸酯而
言，其水解速率略有增长，但差异不大；而对于（%）5
@ABC乙酸酯而言，其水解速率显著加快。添加
"#$的异丙醇，=! 7后（%）5@ABC乙酸酯已经基本
消耗完，而此时，在未添加异丙醇的对照组中，（%）5
@ABC乙酸酯还有约 "E$的残留。添加了异丙醇之
后，固定化细胞的对映选择性显著提高。对实验数
据进行非线性回归，在添加了 "#$异丙醇的反应体
系中，固定化细胞的 # 值为 F! G E，较之未添加异丙
醇的反应体系（# H D! G E），提高了 I#$。
图 D （%，$）5@ABC乙酸酯的酶法水解进程
%&’( D )3;962-&, 79<1.49/&/ .*（ %， $）5@ABC 2,+-2-+ &3 -7+
6+<&N6 L&-7 .1 L&-7.N- &/.01.023.4（"#$，! " !）>
= >! 异丙醇对不动杆菌酯酶对映选择性的影响
整细胞中含有多种组分，为进一步阐明异丙醇
对反应对映选择性的影响，我们对不动杆菌 COACC
#IPF酯酶进行了部分纯化，并用对映纯的 @ABC乙
酸酯分别对不动杆菌酯酶的水解动力学参数进行了
考察，结果总结于表 "中。
表 " 部分纯化不动杆菌酯酶催化 @ABC乙酸酯各对映体水解动力学参数
Q2:4+ " R&3+-&, 79<1.49/&/ 02126+-+1/ .* +2,7 +323-&.6+1 .* @ABC 2,+-2-+ ,2-249;+< :9 021-&2449 0N1&*&+<
&’()*+,-.’+*/ /0> COACC #IPF +/-+12/+
异丙醇
S $
（062T）J （062T）M
66.4 S（U·7·6’）
（16）J
S（66.4 S U）
（16）M
S（66.4 S U）
（062T S 16）J
S（7V "·6’V "）
（062T S 16）M
S（7V "·6’V "）
#
# #>?D" #>"?! #>P#P !>FP #>!?! #>#=E F "E>"
"# #>PD= #>"I! ">=I F>!I #>EI" #>#"P ! ?E>D
添加 "#$的异丙醇，不动杆菌酯酶对两个对映
体的 062T值都提高，但 %5对映体的 062T提高较大，
是空白的 =>! 倍，而 $5对映体提高不大；添加 "#$
的异丙醇后，两个对映体的 16 值均增大，其中 %5
对映体的 06 提高为空白的 = 倍，而 M5对映体仅为
">D倍。其综合效果为：添加异丙醇后，%5对映体的
专一性常数 2,2-（2,2- H 062T S 16）提高较显著。
酶反应对映选择性的的高低可由酶对两种对映
体的专一性常数 062T S 16 的比值来表示，也即 # H
（062T S 16）J S（ 062T S 16）M。根据实验结果，在添加
了 "#$异丙醇的情况下，对映选择率 # 值由 "E>"
提高到 ?E>D。
=>D 固定化细胞的重复利用
反应体系中异丙醇的添加同时提高了固定化细
胞的活力以及对映选择性，与此同时，反应介质中存
在 "#$异丙醇时，固定化细胞仍具有良好的操作稳
定性（见图 E）。
如图 E所示，当底物消旋 @ABC乙酸酯浓度为
"## 66.4 S U时，每批反应 =! 7转化率即可达到 D#$
（下转第 ?D页）
=##!年 ""月 陈 亚等：有机溶剂介质中固定化不动杆菌细胞催化拆分（%$）5环戊烯酮乙酸酯的研究 ·=D·
万方数据
［!"］苏 怡，候延文，高珉之 # 医用生物蛋白胶生物性能的研究［$］
# 预防医学杂志情报，"%%!，!&（’）：())*()+ ,
［!)］-. / 0 !’11’#!"*"%%%# 医疗器械生物学评价第 !"部分：样品制
备与参照样品［2］,
［!(］-. / 0 !’11’#+*"%%)# 医疗器械生物学评价 第 +部分：体外细胞
毒性试验［2］,
［!+］田 菲，吴军正，鲁开化，等 # 聚丙烯酰胺水凝胶对 34"4细胞
的细胞毒性研究［$］# 实用美容整形外科杂志，!444，!%（’）：)"’*
)"4 ,
［!’］王 昕，施燕萍，朱雪涛，等 # 500法评价医用高分子材料的细
胞毒性［$］# 山东生物医学工程，"%%)，!：(’*(&
,［!&］米 钰，惠 俊，范代娣，等 # 类人胶原蛋白生物相容性实验
研究［$］# 西北大学学报（自然科学版），"%%(，)(（!）：’’*’1 ,
［!1］-. / 0 !’11’#!!*!44&# 医疗器械生物学评价 第 !!部分：全身毒
性试验［2］,
［!4］-. / 0 !’11’#!%*"%%%# 医疗器械生物学评价 第 !%部分：刺激与
致敏试验［2］,
［"%］丛 锐，王全平，冯立宁，等 # 骨缺损修复材料可降解速固化骨
水泥的生物相容性研究［$］# 中国临床康复，"%%"，’（(）：+%"*
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
+%) ,
（上接第 "+页）
图 ’ 不动杆菌固定化细胞的操作稳定性
789#’ :6;<=>8?@ A>=B8C8>D ?E 8FF?B8C8G;H IJ8@;>?B=J>;< A6# J;CCA#
左右，此时，水解产物（"）*K5LM的 !! 值在 4%N左
右（视转化率不同有所差异）。从图中可以看出，固
定化细胞非常稳定，连续重复反应 !%批，其活力以
及选择性没有显著下降，显示了良好的工业应用前
景。
参考文献：
［!］ 58>AOH= 2，PF;FO<= 0，K88?@ ?E =@ ?6>8J=CCD 6O<; A;J*
?@H=Q;>8J 6D<;>Q58J;JQ@?C，!411，"4：)!%*)!+#
［"］ RQ=? SO*T8=?（赵玉巧），UO KO8*SO=@（武慧渊），VO $8=@*K;（许
建和），;> =C# WA?C=>8?@ =@H =66C8J=>8?@ ?E #$%&!’()*$’!+ A6# ST ")!
Q89QCD 68?A;C;J>8X; ;A>;<=A;A［$］# MQ8@ $ I66C Y@X8.8?C#（应用与环境生物学报），"%%"，1（’）：’(%*’()#
［)］ MQ;@ S=（陈亚），UO KO8*SO=@（武慧渊），VO $8=@*K;（许建和），
;> =C# 不动杆菌及采用该菌种拆分制备手性环戊烯酮的方法
［L］# 中国发明专利：R3%"!)&%!4 "，"%%(，%4，"4#
［(］ T8=@ $K，VO $K#M=>=CD>8J 6;8?A;C;J>8X;
（"）*;A>;< QDH; #$%&!’()*$’!+ A6# M-5MM %&14
［$］# $ 5?C M=>=C .：Y@GDF=>8J，"%%(，"&：""&*")"#
［+］ RQ=? SO*T8=?（赵玉巧），VO $8=@*K;（许建和）# :6>8F8G=>8?@ ?E <;*
=J>8?@ J?@H8>8?@A E?< B8?J=>=CD>8J <;A?CO>8?@ ?E（[，2）*(*QDHF;>QDC*"*（"*6*"*;@?@; BD <;A>8@9 J;CCA ?E #$%&!’(,
)*$’!+ A6# ST ")!［$］# MQ8@ M=>=（催化学报），"%%)，"(（1）：’!)*’!1#
［’］ MQ;@ S=，VO $8=@*K;，L=@ $8=@9，;> =C# M=>=CD>8J <;A?CO>8?@ ?E（ "-）*
K5LM =J;>=>; BD 8FF?B8C8G;H J;CCA ?E #$%&!’()*$’!+ A6# M-5MM %&14
8@ = F;H8OF Z8>Q ?<9=@8J J?A?CX;@>［$］# $ 5? M=>=C .*Y@GDF=>8J，"%%(，
)%："%)*"%1 ,
"%%(年 !!月 王 欣等：聚谷氨酸*明胶生物胶生物学评价 ·)+·
万方数据