全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ０１２
收稿日期：２０１３－０３－２６
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）（２０１２ＡＡ０２１５０３）；国家自然科学基金（３１３７１７３２）；教育部博士点基金（２０１０３２２１１１０００６）；江苏
省普通高校研究生科研创新计划（ＣＸＺＺ１２＿０４１８）
作者简介：王彦媛（１９８７—），女，河北衡水人，硕士研究生，研究方向：生物化工；徐　 虹（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｈ＠ ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ对来源于
Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５蔗糖异构酶的抑制动力学
王彦媛，李　 莎，姚　 忠，徐　 虹
（南京工业大学 食品与轻工学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：从重组大肠杆菌 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ｐＥＴ２２ｂ ｐａｌⅠ）中纯化得到来源于 Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５ 的蔗糖异构酶
（ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＳＩａｓｅ，ＥＣ ５􀆰 ４􀆰 ９９􀆰 １１），以纯酶为对象考察其酶活力抑制动力学。 结果表明：ＳＩａｓｅ 纯比酶活
１ ５１２􀆰 ７７ Ｕ ／ ｍｇ，动力学常数 Ｋｍ ＝ ２６０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，Ｖｍａｘ ＝ ３９􀆰 ４１ μｍｏｌ ／ （ Ｌ·ｓ） 。 以化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ
（ＷＲＫ）对重组蔗糖异构酶进行抑制反应，反应体系中随着 ＷＲＫ浓度的升高，ＳＩａｓｅ与底物蔗糖的亲和力常数 Ｋｍ增
大，最大反应速度 Ｖｍａｘ在一定范围内保持稳定。 通过对 ＳＩａｓｅ的抑制动力学分析可得到，ＷＲＫ 对 ＳＩａｓｅ 的抑制类型
为可逆的竞争性抑制，这可能与 ＷＲＫ与蔗糖的结构类似，与可竞争性的结合 ＳＩａｓｅ的活性中心有关。
关键词：蔗糖异构酶；抑制动力学；化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ
中图分类号：Ｑ５　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００６２－０５
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ ｆｒｏｍ Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ⁃５ ｂｙ
Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ
ＷＡＮＧ Ｙａｎｙｕａｎ，ＬＩ Ｓｈａ，ＹＡＯ Ｚｈｏｎｇ，ＸＵ Ｈｏｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ （ＳＩａｓｅ，ＥＣ５􀆰 ４􀆰 ９９􀆰 １１） ｆｒｏｍ Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ⁃５ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ｐＥＴ２２ｂ⁃ｐａｌⅠ） ｃｕｌｔｕｒｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｕｒｅ ＳＩａｓｅ
ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｗｉｔｈ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（ＷＲＫ）􀆰 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ＳＩａｓｅ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ １ ５１２􀆰 ７７ Ｕ ／ ｍｇ，ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ⁃Ｍｅｎｔｅｎ ｃｏｎｓｔａｎｔｓ ｏｆ Ｋｍ ＝ ２６０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ａｎｄ
Ｖｍａｘ ＝ ３９􀆰 ４１ μｍｏｌ ／ （Ｌ·ｓ）􀆰 Ｋｍ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ｂｕｔ Ｖｍａｘ ｋｅｐｔ ｓｔａｂｌｅ
ｗｉｔｈｉｎ ｌｉｍｉｔｓ􀆰 Ｔｈｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ＳＩａｓｅ ｂｙ ＷＲＫ ｗａｓ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ａｎｄ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ，ｐｒｏｂａｂｌｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｓｉｍｉｌａｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＷＲＫ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｋｉｎｅｔｉｃｓ；Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ
　 　 蔗糖异构酶（ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，ＳＩａｓｅ，ＥＣ ５．４．９９．１１）
是催化蔗糖异构化，生成异麦芽酮糖（６ Ｏ α Ｄ 吡
喃葡糖基 Ｄ 果糖，ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ）和海藻酮糖（１ Ｏ α
Ｄ 吡喃葡糖基 Ｄ 果糖，ｔｒｅｈａｌｕｌｏｓｅ）的关键酶（图 １）。
作为蔗糖的同分异构体，异麦芽酮糖和海藻酮糖除具有
与蔗糖类似的物理性质和口感外，还有低热量、不致龋
齿、不吸湿、耐酸解的特点，被美国 ＦＤＡ 确定为普遍公认
安全食品（ＧＲＡＳ），是很好的蔗糖替代品［１－４］。
图 １　 蔗糖异构酶生物催化蔗糖反应式
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｓｕｃｒｏｓｅ ｔｏ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ ｂｙ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒａｓｅ
　 　 ＳＩａｓｅ催化蔗糖异构化的产物组成比例随着产酶
微生物来源和催化条件的不同而存在差异，这与
ＳＩａｓｅ的催化机制息息相关。 ２００７ 年 Ｒａｖａｕｄ 等［５］获
得了来源于红色精朊杆菌的 ＳＩａｓｅ 晶体结构 （ＰＤＢ：
３ＧＢＤ），并初步解析了 ＳＩａｓｅ 水解和异构化蔗糖的两
步催化机制，提出 ＳＩａｓｅ 的活性中心是由 Ｄ２１４、Ｅ２６８
和Ｄ３４２组成。 目前，国内外对 ＳＩａｓｅ的研究主要涉及
酶学性质、基因的克隆表达［６－８］，对 ＳＩａｓｅ的抑制动力
学研究未见报道。 ＳＩａｓｅ在酶法合成系列功能性甜味
剂方面具有良好的产业化应用前景，因而对其催化机
制及其特性的研究具有重要意义。
化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ（Ｎ⁃ｅｔｈｙｌ⁃５⁃
ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｉｕｍ⁃３′⁃ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ＷＲＫ ）是一种可以与
羧基结合的化学修饰剂，可作为酶的化学抑制剂，
与活性位点的 Ｇｌｕ 或 Ａｓｐ 结合生成复合物，而发挥
对酶的抑制作用［９－１１］，此外 ＷＲＫ 与 ＳＩａｓｅ 最适底物
蔗糖具有相似的主体结构 （图 ２），可作为一种结构
类似物酶抑制剂。
本文 通 过 考 察 ＷＲＫ 对 来 源 于 Ｅｒｗｉｎｉａ
ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５ 的 ＳＩａｓｅ 的抑制动力学，旨在为研
究 ＳＩａｓｅ的构效关系提供实验依据，并为酶催化特
异性机制的认识和酶分子改造奠定基础。
图 ２　 ＷＲＫ和蔗糖的结构
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＷＲＫ ａｎｄ ｓｕｃｒｏｓｅ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料与仪器
蔗糖异构酶（ＳＩａｓｅ）由笔者所在实验室构建的重
组菌株 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ ｐａｌⅠ） 发酵产生，并经纯
化 得 到； Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ （ Ｎ⁃ｅｔｈｙｌ⁃５⁃
ｐｈｅｎｙｌｉｓｏｘａｚｏｌｉｕｍ⁃３′⁃ｓｕｌｆｏｎａｔｅ，ＷＲＫ），Ｆｌｕｋａ公司。
Ｓｐｅｃｔｒｕｍｌａｂ７５２Ｓ型紫外可见分光光度计（上海
棱光有限公司）， Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ３２０Ｒ 型台式离心机
（Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ），ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ 电泳仪（Ｂｉｏ⁃
Ｒａｄ公司），ＪＹ９２ ＩＩ 型超声细胞粉碎机 （宁波新芝
生物技术研究所），Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ 高效液相色谱系统
（Ａｇｉｌｅｎｔ公司），ＫＦ ５ Ｌ 型发酵罐 （高百特发酵机
（上海）有限公司），ＨＶＥ ５０ 型全自动灭菌锅（日
本 ＨＩＲＡＹＡＭＡ公司），ＰＨＳＪ ４Ａ 型精密 ｐＨ 计（上
海雷磁仪器厂）。
１􀆰 ２　 实验方法
１􀆰 ２􀆰 １　 菌体培养及 ＳＩａｓｅ纯酶的获得
重组菌构建［１２］、培养基及培养条件参照文献
［１３］。
蔗糖异构酶的纯化方法参照文献［１２］，其纯度
经由质量分数 １２％的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳检测［１４］。
３６　 第 ６期　 王彦媛等：化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ对来源于 Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５蔗糖异构酶的抑制动力学
１􀆰 ２􀆰 ２　 蛋白浓度的测定
参照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法［１５］，以牛血清蛋白为标准蛋白
绘制标准曲线。
１􀆰 ２􀆰 ３　 酶活测定
酶活定义：在 ３０ ℃、ｐＨ ６􀆰 ０ 的最适反应条件
下，每分钟催化生成 １ μｍｏｌ 异麦芽酮糖所需的酶量
定义为一个酶活力单位（Ｕ）。
酶催化反应体系与转化方法：２０ μＬ ＳＩａｓｅ 纯酶
液用 ｐＨ ６􀆰 ０的磷酸缓冲液（ＰＢＳ）稀释至 １００ μＬ，加
入 ５０ ｇ ／ Ｌ的底物蔗糖溶液 ４００ μＬ，在 ３０ ℃、ｐＨ ６􀆰 ０
条件下反应 １５ ｍｉｎ，转化反应结束后，将转化液于沸
水浴中灭活 ５ ｍｉｎ［１６］。
异麦芽酮糖含量的测定方法：采用高效液相色
谱法（安捷伦 １２００ 型液相色谱系统），色谱条件为
色谱分离柱 Ｒｅｚｅｘ ＲＣＭ ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ Ｃａ２＋
ｃｏｌｕｍｎ （Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，ＵＳＡ）、流动相为纯水、流速为
０􀆰 ５ ｍＬ ／ ｍｉｎ、检测器为示差折光检测器 （ Ｓｈｏｄｅｘ
Ｒ１０１）、进样量为 ２０ μＬ、柱温为 ８０ ℃。
以异麦芽酮糖的标准样品作色谱分析的标准
曲线。
１􀆰 ２􀆰 ４　 ＳＩａｓｅ催化蔗糖异构化的反应动力学
以不同浓度蔗糖溶液 （２９２、５８５、８７７、１ １６９、１ ４６２
和 １ ７５４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）为底物进行酶催化反应，反应体系
及转化条件同 １􀆰 ２􀆰 ３。 测定反应结束时异麦芽酮糖的
生成量，计算 ＳＩａｓｅ 纯酶液催化蔗糖异构化生成异麦
芽酮糖的反应速率 Ｖｓ（Ｖｓ ＝ ｃ（异麦芽酮糖） ／ ｔ），此催
化反应符合单底物的 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ Ｍｅｎｔｅｎ 方程。 根据
双倒数作图法，以 １ ／ Ｖｓ对 １ ／ ｃ（蔗糖） 作图，可求得
ＳＩａｓｅ的米氏常数（Ｋｍ）和最大反应速率（Ｖｍａｘ）。
１􀆰 ２􀆰 ５　 不同 ＷＲＫ浓度下 ＳＩａｓｅ 的酶活随处理时间
的变化
２０ μＬ ＳＩａｓｅ 纯酶液反应体系中加入终浓度分
别为 ２、４和 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的ＷＲＫ，终体积 １００ μＬ，处理
温度 ３０ ℃，处理时间分别为 ５、１０、１５、２０、２５、３０ 和
４０ ｍｉｎ，经处理后的酶液以 １４６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的蔗糖溶液
为底物，反应体系及转化条件同 １􀆰 ２􀆰 ３，测定此时异
麦芽酮糖的生成量，以无抑制剂存在的条件下测得
的酶活为 １００％，计算相对酶活力。
１􀆰 ２􀆰 ６　 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的抑制效应分析
测定不同 ＳＩａｓｅ 酶量经不同浓度 ＷＲＫ 处理后
的催化反应速率，处理体系中 ＷＲＫ 的终浓度分别
为 ２、４ 和 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，酶浓度依次为 ３􀆰 ０７７、３􀆰 ８４６、
４􀆰 ６１５、６􀆰 １５４和 ７􀆰 ６９２ μｍｏｌ ／ Ｌ，按照总体积 １００ μＬ
计算酶液及抑制剂的加入量，３０ ℃温育 １０ ｍｉｎ，以
１４６ ｍｍｏｌ ／ Ｌ蔗糖溶液为底物，反应体系及转化条件
同 １􀆰 ２􀆰 ３，测定反应结束时异麦芽酮糖的生成量，计
算抑制剂存在条件下的反应速率 Ｖｓ，以反应速率 Ｖｓ
对酶浓度 ｃ（酶）作图。
１􀆰 ２􀆰 ７　 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的抑制类型和抑制常数分析
将 ２０ μＬ 纯化过的 ＳＩａｓｅ 纯酶液在不同 ＷＲＫ
浓度（２、４和 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）的体系中温育 １０ ｍｉｎ（总体
积 １００ μＬ），处理后的酶液用于其抑制动力学的测
定，ＳＩａｓｅ经抑制剂处理后降低了酶的活性，降低反
应体系中底物浓度（分别为 ７３、１４６、２１９、２９２ 和 ３６５
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）以便于实验结果的测定，反应体系及转化
条件同 １􀆰 ２􀆰 ３，测定反应结束时异麦芽酮糖的含量，
计算 ＳＩａｓｅ催化蔗糖异构化反应速率 Ｖｓ，根据双倒
数作图法，以 １ ／ Ｖｓ对 １ ／ ｃ（蔗糖） 作图，可求得不同
浓度 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ抑制后的的米氏常数（Ｋｍ）和最
大反应速率（Ｖｍａｘ），并计算不同浓度 ＷＲＫ 对 ＳＩａｓｅ
的抑制常数（ＫＩ）。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 蔗糖异构酶 ＳＩａｓｅ的纯化
重组 Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＥＴ２２ｂ ｐａｌⅠ） 菌株在最适
条件下发酵所得菌体经洗涤、超声破碎、离心后取
上清液即为粗酶液，过 Ｎｉ ＮＴＡ 柱纯化，洗脱液经
超滤除盐浓缩后，用质量分数 １２％的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ
电泳检测其纯度，结果见图 ３。 由图 ３可知，ＳＩａｓｅ已
纯化至电泳纯，其蛋白相对分子质量在 ６􀆰 ５×１０４左
右，所得 ＳＩａｓｅ 酶液的蛋白质量浓度为 １􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ，
比酶活为 １ ５１２􀆰 ７７ Ｕ ／ ｍｇ。
Ｍ为标准蛋白；１—粗酶液；２—穿透液；３—洗杂液；
４—Ｎｉ ＮＴＡ活性洗脱液；５—浓缩后酶液
图 ３　 纯化后 ＳＩａｓｅ的 ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ＳＤＳ⁃ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
４６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ２　 ＳＩａｓｅ催化蔗糖异构化的反应动力学
分别配置不同浓度的蔗糖 （ ２９２ ～ １ ７５４
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）溶液，考察 ＳＩａｓｅ催化不同浓度蔗糖生成异
麦芽酮糖的情况，计算蔗糖异构化反应速率 Ｖｓ，以
１ ／ Ｖｓ对 １ ／ ｃｓ 作图，如图 ４。 计算可得 Ｋｍ和 Ｖｍａｘ值分
别为 ２６０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ和 ３９􀆰 ４１ μｍｏｌ ／ （Ｌ·ｓ）。 与之前报
道的其他来源的 ＳＩａｓｅ 相比，Ｅ􀆰 ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５ 来
源的 ＳＩａｓｅ 与蔗糖的结合能力优于 Ｅ􀆰 ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ
ＮＣＰＰＢ １５７８ 来源的 ＳＩａｓｅ （Ｋｍ ＝ ２８０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ［１７］，
但明显低于 Ｋ􀆰 ｓｐ􀆰 ＬＸ ３［１８］和 Ｐ􀆰 Ｒｕｂｒｕｍ［１９］来源的
ＳＩａｓｅ，其 Ｋｍ值分别为 ５４􀆰 ６和 ３２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
图 ４　 ＳＩａｓｅ催化蔗糖异构化反应动力学
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ＳＩａｓｅ
图 ５　 ＷＲＫ处理对 ＳＩａｓｅ酶活力的影响
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＷＲＫ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ
ｏｆ ＳＩａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ
２􀆰 ３　 不同 ＷＲＫ 浓度下 ＳＩａｓｅ 的酶活随处理时间
的变化
　 　 测定不同 ＷＲＫ浓度，不同处理时间时 ＳＩａｓｅ 的
酶活力，以 ＳＩａｓｅ 的酶活力对时间作图，０ ｍｉｎ 为未
经抑制剂处理的 ＳＩａｓｅ 所具有的酶活，结果见图 ５。
由图 ５可知：在所选浓度范围内，ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的催
化活力有显著的抑制作用。 在相同处理时间下，随
ＷＲＫ浓度升高，ＳＩａｓｅ的活力逐渐下降，对酶活力的
抑制作用增强；当 ＷＲＫ浓度为 ８ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，处理时间
为 １０ ｍｉｎ时，ＳＩａｓｅ几乎丧失活力，ＷＲＫ的抑制作用
达到最高。 不同浓度的 ＷＲＫ 对 ＳＩａｓｅ 酶活力的抑
制作用在处理 １０ ｍｉｎ后基本稳定。 因此，在以后的
抑制动力学测定实验中，抑制剂对 ＳＩａｓｅ 的处理时
间均为 １０ ｍｉｎ。
２􀆰 ４　 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的抑制效应分析
不同 ＷＲＫ终浓度下对不同酶液量的体系进行
预处理后，测定反应速率 Ｖｓ，以反应速率 Ｖｓ对酶浓
度 ｃ（酶）作图，结果见图 ６。 由图 ６ 可知：加入不同
浓度 ＷＲＫ 后，ＳＩａｓｅ 酶的活力均随酶液量的增加而
增大，且酶活力与酶液量呈明显的线性关系。 随着
ＷＲＫ浓度的提高，直线的斜率逐渐降低，表明 ＷＲＫ
对 ＳＩａｓｅ的抑制作用是可逆的［２０］。 此抑制作用下导
致酶活力下降的原因是抑制剂浓度的增加，而不是
减少有效酶量。
图 ６　 ＷＲＫ浓度对蔗糖转化速率与酶液量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＷＲＫ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙ
ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ Ｖｓ ａｎｄ ｃ（ＳＩａｓｅ）
２􀆰 ５　 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的抑制类型和抑制常数分析
经不同浓度的 ＷＲＫ处理后的 ＳＩａｓｅ 酶液，测定
在不同底物浓度下 ＳＩａｓｅ 催化生成异麦芽酮糖的
量，计算蔗糖异构化的反应速率 Ｖｓ，以 １ ／ Ｖｓ对 １ ／ ｃｓ
作图，结果见图 ７。 由图 ７可知：不同抑制剂浓度的
３条直线相交于 Ｙ 轴，表明在 ＳＩａｓｅ 反应过程中
ＷＲＫ仅影响该酶促反应的米氏常数，Ｖｍａｘ在一定范
围内保持不变；而米氏常数随抑制剂浓度增大而增
大。 由此可以推断 ＷＲＫ 是 ＳＩａｓｅ 的一种竞争性抑
制剂［２１－２２］。
当竞争性抑制剂存在时，酶催化反应速率与底
物浓度的关系满足式（１）。
１
Ｖｓ
＝
Ｋｍ
Ｖｍａｘ
１ ＋
ｃＩ
ＫＩ
æ
è
ç
ö
ø
÷
１
ｃｓ
＋ １
Ｖｍａｘ
（１）
式中，ｃＩ、ｃｓ 分别为抑制剂和底物浓度。
表 １为不同浓度 ＷＲＫ 对 ＳＩａｓｅ 处理后，求得的
米氏常数 Ｋｍ和最大反应速率 Ｖｍａｘ以及由式（１）求得
５６　 第 ６期　 王彦媛等：化学抑制剂 Ｗｏｏｄｗａｒｄ′ｓ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋ对来源于 Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ ＮＸ ５蔗糖异构酶的抑制动力学
图 ７　 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的竞争性抑制动力学
Ｆｉｇ􀆰 ７　 Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ＳＩａｓｅ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｌｙ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｂｙ ＷＲＫ
的不同 ＷＲＫ浓度下的抑制常数 ＫＩ值。 加入竞争性
抑制剂后，Ｋｍ与 Ｖｍａｘ均发生了变化，且 Ｋｍ随抑制剂
浓度的增加而增大，而 Ｖｍａｘ在一定范围内维持稳定。
ＫＩ值随 ＷＲＫ 浓度升高而减小，符合竞争性抑制的
特点。 推测是由于 ＷＲＫ 具有与蔗糖相似的结构，
当其与蔗糖同时存在时，ＷＲＫ具有相对于蔗糖较小
的相对分子质量（２５３􀆰 ２７），易于进入酶的催化中心
区域，可竞争性的占据底物结合部位，因此降低了
ＳＩａｓｅ与底物蔗糖结合的能力，但当底物浓度足够大
时能与酶活性位点重新结合发生催化反应。
表 １　 不同浓度ＷＲＫ抑制前后 ＳＩａｓｅ催化
蔗糖异构化动力学参数的比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｋｍ ａｎｄ Ｖｍａｘ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ
ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｉｎｔｏ ｉｓｏｍａｌｔｕｌｏｓｅ ｃａｔａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ
ＳＩａｓｅ ｐｒｅ⁃ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ ＷＲＫ
ｃ（ＷＲＫ） ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
Ｋｍ ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
Ｖｍａｘ ／
（μｍｏｌ·Ｌ－１·ｓ－１）
ＫＩ ／
（ｍｍｏｌ·Ｌ－１）
０ ２６０ ３９􀆰 ４１ —
２ ２７８ ３３􀆰 １４ ２８􀆰 ８９
４ １ ９５４ ２７􀆰 ３２ ０􀆰 ６１
８ １１ ９４３􀆰 ３ １８􀆰 ８３ ０􀆰 １８
３　 结论与展望
１）重组蔗糖异构酶经过一步 Ｎｉ ＮＴＡ柱纯化，
可得到电泳纯的 ＳＩａｓｅ，其质量浓度为 １􀆰 ３ ｍｇ ／ ｍＬ，
比酶活为 １ ５１２􀆰 ７７ Ｕ ／ ｍｇ。
２）研究得到 ＳＩａｓｅ 的动力学常数 Ｋｍ ＝ ２６０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ，Ｖｍａｘ ＝ ３９􀆰 ４１ μｍｏｌ ／ （Ｌ·ｓ），对 ＳＩａｓｅ 的抑制
动力学开展研究，以 ＷＲＫ 为化学抑制剂，通过其对
ＳＩａｓｅ的抑制动力学研究，阐明了 ＷＲＫ 是 ＳＩａｓｅ 的
竞争性抑制剂，初步分析认为这与 ＷＲＫ 与该酶最
适底物蔗糖的结构类似有关。
３）为进一步研究 ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ 的抑制作用，计
划开展 Ｅｒｗｉｎｉａ ｒｈａｐｏｎｔｉｃｉ 来源 ＳＩａｓｅ 的晶体结构及
ＷＲＫ与 ＳＩａｓｅ 的共结晶结构解析研究，用以深入认
识 ＳＩａｓｅ 的催化机制，并从结构角度进一步解析
ＷＲＫ对 ＳＩａｓｅ的作用机制。
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（下转第 ９５页）
６６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
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（责任编辑　 荀志金）
５９　 第 ６期 潘慧敏等：７种广西产甜茶抗氧化活性的比较