全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期"#$%$ 6%$ 6%#
作者简介"陈清霞#%!37%$&女&福建莆田人&硕士研究生&研究方向"分子生物学(黄建忠#联系人$&教授&@FPBQE"=e
陈清霞&江贤章&刘锦清&宋芬芬&黄建忠
#福建师范大学 生命科学学院 工业微生物教育部工程研究中心 福建省现代发酵技术工
程研究中心&福州 &$%$3$
摘"要"为了构建高产
%
亚麻酸的卷枝毛霉稳定遗传转化体系&利用酶解法对卷枝毛霉#<$4&*42*42,#(&2%#"()*$
@,` %$的孢子进行原生质体制备 研究酶液组成)渗透压稳定剂)酶解温度)酶解时间等对卷枝毛霉孢子原生质
体形成和再生的影响&建立了制备卷枝毛霉孢子原生质体的最适条件"%g纤维素酶和 #g溶壁酶为酶解体系&$j
PDE:U-B9E作为渗透压稳定剂&酶解温度 &# k&酶解时间 #j =&再生培养基为 $j PDE:U-B9E高渗培养基 用双
层平板培养法进行原生质体再生&在此条件下原生质体的形成量为 %j# p%$7个:PU&再生率为 8$jg
关键词"
%
亚麻酸(卷枝毛霉(原生质体(孢子
中图分类号"+!&""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$0! 6$0
X409545E.2/5/H40;0/045E.2/27942E29651E127=$2&*20*20,#(&0%#"192401
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Q`HOD;QDEDMXDNA=J` QCQ(AOXDN@KIHBAQDC&9DEJMJDNUQNJ4HQJCHJ&[IeQBC -DOPBESCQZJO(QAX& [I<=DI &$%$3&9=QCB$
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FEQCDEJQHBHQK( <$4&*42*42,#(&2%#"( )ODAD)EB(A( ()DOJ(
""
%
亚麻酸#
%
FEQCDEJQHBHQK& WUY$是人体所必需
的含
7的高度不饱和脂肪酸&具有降低胆固醇)降
血糖)降血压)抑菌)抗癌)抗炎症)改善动脉粥状硬化
等功能*% 6&+ 卷枝毛霉是
%
亚麻酸的主要产生菌&
具有重要的应用价值 然而利用卷枝毛霉产生
%
亚
麻酸时&存在着其他杂酸含量高)油脂产量较低等问
题*0+ 因此需要通过基因组改组等方法&选育适合工
业化的
%
亚麻酸高产菌株*+ 利用同源重组可以获
得稳定的卷枝毛霉
%
亚麻酸高产菌株&需要制备其
原生质体进行转化育种研究*7+ ZBC .JJ(LQeHc*8+通
过9B9E
#
:>@W介导的原生质体转化法建立了卷枝毛
霉的遗传转化体系&但其制备的原生质体是以菌丝体
为材料&卷枝毛霉菌丝是二倍体&存在着制备的原生
质体可能不是单核的问题&影响后期的遗传转化育
种 本文以
%
亚麻酸产生菌卷枝毛霉@,` %$的孢
子为出发菌株&建立和优化原生质体制备与再生的条
件&为进一步的同源重组以获得
%
亚麻酸高产菌株
奠定基础
C?材料与方法
CNC?材料
%j%j%"菌种
卷枝毛霉()*@,` %$&由福建师范大学工业微
生物教育部工程研究中心提供
%j%j#"培养基
]>W液体培养基#M:U$"葡萄糖 #$&蛋白胨 %$&
酵母提取物 &
]>WY固体培养基#M:U$"葡萄糖 #$&蛋白胨
%$&酵母提取物 &&琼脂 #$
高渗再生培养基" ]>WY固体培养基加终浓度
为 $j PDE:U的-B9E
%j%j&"工具酶
溶壁酶购于广东省微生物研究所&纤维素酶购
于上海国药集团
CN@?方法
%j#j%"酶液的制备
用 $j PDE:U-B9E或其他不同的渗透压稳定剂
配制各种酶系组成&7 $$$ O:PQC 室温离心 %$ PQC&
取上清液过滤除菌后使用
%j#j#"原生质体的制备与纯化
孢子悬浮液制备"用无菌水从新鲜斜面培养物
洗脱孢子至有玻璃珠的三角瓶&振荡使孢子分散&
过滤除去菌丝和成团的孢子
孢子萌发"取 % PU孢子悬液#浓度为 %$3个:PU
左右$到 $ PU]>W液体培养基中&&$ k培养 j =
左右直至孢子萌发出一个小突起
无菌酶液制备"配制 %$ PU$j PDE:U-B9E溶
液#含 %$$ PM纤维素酶和 #$$ PM溶壁酶$&将配制
好的酶液离心#7 $$$ O:PQC&%$ PQC$&取离心后的上
清液过滤获得无菌酶液
酶解"离心#0 $$$ O:PQC&%$ PQC$收集萌发的孢
子&用无菌水洗涤 % 次&渗透压稳定剂再洗 % 次&加
入酶液&置 &# k摇床 $ O:PQC 进行酶解#将酶液置
于 7 HP培养皿中进行酶解$&每隔 &$ PQC 取一次
样&显微镜下观察原生质体的产生情况
纯化"将酶解完毕的酶液置于 -^Y回收柱中&
0 $$$ O:PQC离心 PQC# -^Y回收柱预先除去 -^Y
回收膜&塞一些脱脂棉后马上灭菌$ 离心后去上
清液&原生质体液用手轻轻地弹一下&使原生质体
分散
%j#j&"原生质体的再生
经纯化的原生质体用渗透压稳定剂稀释至 %$7
个:PU浓度&并用渗透压稳定剂进行不同浓度稀
释&采用双层平板培养法进行再生"吸取 %$$
"
U稀
释的原生质体与 0 PU再生半固体培养基中混匀后&
倒于再生固体培养基上&&$ k恒温培养# h& K 原
生质体的再生率按下式计算"
再生率o960
<
p%$$N #%$
式中"9为再生菌落个数#混合液加高渗溶液&涂布
于再生培养基上生长的菌落数$(0为未原生质体化
细胞个数#酶解混合液加蒸馏水破坏原生质体&涂
布于普通琼脂培养基后生长的菌落数$(<为原生
质体个数
@?结果与讨论
@NC?孢子培养方式对原生质体形成的影响
大多数丝状真菌用菌丝体作为材料制备原
生质体&极个别菌株也可用孢子获得原生质
体 *3+ 孢子制备的原生质体是单核的&有利于后
期的融合育种和转化育种 而不同的培养方式
获得的孢子对原生质体的释放量有明显的影响
本文首先观测了孢子在液体摇瓶培养 j = 后开
始萌发出一个小突起并以此作为孢子的菌龄&可
以得到 %j# p%$7个:PU的原生质体&而从试管斜
面培养的孢子却很难分离到原生质体&这与
D`DOJ等 *!+从黄曲霉孢子制备原生质体的结论相
一致
@N@?酶液组成对原生质体形成与再生的影响
卷枝毛霉孢子在 $j PDE:U-B9E配制的不同酶
液#&# k酶解 #j =$中酶解&比较溶壁酶)纤维素酶
及混合酶对卷枝毛霉孢子原生质体释放量的影响&
结果如表 % 所示 由表 % 可知"制备卷枝毛霉孢子
的原生质体&混合酶优于单独酶&#g的溶壁酶加
%g的纤维素酶效果最好 总之&用于水解的酶浓度
要适当&酶浓度过低&作用不彻底&不利于原生质体
形成(浓度过高&处理时间过长&会影响原生质体数
量和活性&导致再生率下降
$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 C?酶液组成对原生质体形成与再生的影响
D5K60C?#70:E1270/[MJ0J.GE3402/E-09409545E.2/
5/H40;0/045E.2/27942E29651E1
A
#溶壁酶$:g
A#纤维
素酶$:g
原生质体产量:
#%$
个!PU6%$
再生率:g
$ $j j8
$ %j$ 8j%
$ #j$ 8j!
% $ 7j0
% %j$ 3j3
% #j$ !j8 &7j$
# $ 3j#
# %j$ #%j$ 7$j
# #j$ %%j #$j3
@NO?酶解时间对原生质体形成与再生的影响
在 &# k)#g溶壁酶和 %g纤维素酶的酶系中&
分别酶解 $)$j)%)%j)#)#j)& 和 &j =&结果如图
% 和图 # 所示 由图 % 和图 # 可知"在 $j =开始有
少量的原生质体形成&随着时间的延长&原生质体
产量逐渐增加&酶解至 & = 时达到最高峰 但是超
过 #j =后原生质体的再生率急剧下降&其可能原
因是酶解时间过长&原生质体膜形成不可逆损伤而
无法再生*%$+ 综合考虑原生质体产量和再生率确
定酶解时间为 #j =&此时的原生质体产量为%j# p
%$
7个:PU
图 C?酶解时间对原生质体形成的影响
U.;=C?#70:E1270/[MJ26M1.1E.J02/E-09409545E.2/
27942E29651E1
@NP?酶解温度的确定
丝状真菌的生长温度一般是 &$ k左右&因此选
择 #7 h&3 k进行试验#图 &$ 由图 & 可知"当酶解
温度在 #7 h&# k时&随着温度的升高&原生质体释
图 @?酶解时间对原生质体再生的影响
U.;=@?#70:E1270/[MJ26M1.1E.J02/E-0
40;0/045E.2/27942E29651E1
放量逐渐增加&在 &# k时原生质体释放量最大
#%j# p%$
7个:PU$ 随着温度继续升高&原生质体
产量则急剧减少 因此酶解最适温度为 &# k
图 O?酶解温度对原生质体形成的影响
U.;=O?#70:E1270/[MJ26M1.1E0J940E3402/E-0
9409545E.2/27942E29651E1
@NQ?渗透压稳定剂的选择
渗透压稳定剂具有平衡原生质体内外渗透压
的作用&从而稳定和保护原生质体&因此渗透压稳
定剂也是影响原生质体制备和再生的重要因素*%%+
分别采用 EPDE:U山梨醇) $j7 PDE:U蔗糖) $j
PDE:U_9E)$j PDE:U-B9E和 $j3 PDE:U M`45
0
作
为稳定剂&对卷枝毛霉孢子进行酶解试验&结果如
图 0 和图 所示 图 0 和图 表明"不同的渗透压
稳定剂对原生质体的形成和再生有显著的影响
以 $j PDE:U-B9E作为渗透压稳定剂时&原生质体
的得率最高&同时也最适合原生质体再生 因此渗
透压稳定剂对原生质体产量的影响与其对原生质
体再生的影响相吻合
@NR?培养方式对原生质体再生的影响
采用]>W固体再生培养基&研究单层平板培养
与双层平板培养 # 种培养方式对卷枝毛霉原生质体
再生率的影响&结果如表 # 所示 表 # 表明双层培
%"第 # 期 陈清霞等"卷枝毛霉孢子原生质体的制备与再生
图 P?渗透压稳定剂对原生质体形成的影响
U.;=P?#70:E12721J2E.:940113401E5K.6.[042/E-0
9409545E.2/27942E29651E1
图 Q?渗透压稳定剂对原生质体再生的影响
U.;=Q?#70:E12721J2E.:940113401E5K.6.[042/E-0
40;0/045E.2/27942E29651E1
养法的再生率明显高于单层培养法 其原因可能
是原生质体较脆弱&将原生质体直接涂布到固体再
生培养基上&对原生质体损伤较大&再生率比较低&
只有 8g 而用双层培养法容易保持原生质体的完
整性&再生率比较高&可以达到 8$jg
表 @?培养方式对原生质体再生的影响
D5K60@?#70:E127:36E.W5E.2/J2H02/E-0
40;0/045E.2/27942E29651E1
培养方式 再生率:g
单层培养 8
双层培养 8$j
O?结论
本实验对卷枝毛霉孢子的原生质体制备条件
进行优化&得到了卷枝毛霉孢子原生质体的最佳条
件"摇瓶培养 j = 的孢子&酶液组成为 %g纤维素
酶和 #g溶壁酶&渗透压稳定剂为 $j PDE:U-B9E&
酶解温度 &# k&酶解时间 #j = 最终卷枝毛霉孢
子的原生质体释放量达到 %j# p%$7个:PU&再生率
为 8$jg
参考文献"
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# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"