全 文 ：Nov．2008
·40·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第6期
2008年11月
Lactobacilluskefiranofaciens流加发酵法
生产开菲尔多糖
廖鲜艳1”，朱 至1’。，堵国成1’2，陈坚1’2
(I．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122o
2．江南大学 生物工程学院，生物系统与生物加工工程研究室，无锡214122)
摘要：研究了开菲尔基质乳杆菌(1_acwbacillwkefiranofaciens)在不同初始蔗糖浓度下的开菲尔多糖(Kefiran)分批
发酵过程。结果表明。分批发酵过程不能实现Kefiran高产量、高底物转化率和高生产强度的相对统一。在此基础
上，进一步考察分批补料、恒速流加和指数速率流加等不同培养方式时Kefiran发酵的影响。这几种培养方式都可
以实现乳酸茵细胞和Kefiran的高产。综合比较，4∥(L“)的蔗糖恒速流加为Kefiran生产较适宜的流加方式，细
胞干质量浓度为63．6s／L，Ketiran产量达到4．95g／L。
关键词：流加发酵；开菲尔多糖；开菲尔基质乳杆菌
中图分类号：Q939．9 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)06—0040—06
Fed—batchfermentativeproductionofKefiranbyLactobacilluskefiranofaciens
LIAOXian．yanl”，ZHUZhil”，DUGuo．chen91”，CHENJianl·2
(1．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；
2．1aboratoryofBiosystem&BioprocessEnsineering，SchoolofBiotechnology，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：Fiveinitialsucroseconcentrationswerestudiedtodeterminetheireffectsonmicrobialgrowth
andsubstrateconsumption．ItWilt8observedthathishconcentration，highyieldandhishproductivityof
bothcellsandKefirancouldnotbeachievedinabatchprocess．Basedonthresults，theeffectsof
differentfeedingmodes，includingbatchfeeding，constant-ratefeeding，andexponentialratefeeding，on
Kefiranproductionwerei vestigated．ThehighproductionofthecellsandtheKefiranw sallrealized
underthesecultivationmodes．Therefore，theed—ba chculturewithconstantfeedingrateat4g／(L·h)
wasamostsuitableapproachtoobtainhishconcentrations，hi【shyieldsandhishproductivitiesofcells
andKefiraninthecultivationofLkefiranofaciens．ThemaximumdrycellweightandKefiranproduction
reached63．6s／Land4．95g／L．
Keywords：fed-batch；Kefiran；Lactobacilluskefir nofaciens
开菲尔多糖(Kefiran)是～种乳酸菌胞外多糖‘¨，由开菲尔粒中分离出来的乳酸菌Lactobacillus
收稿日期：2008旬l一17
基金项目：国家杰出青年基金资助项目(20625619)；国家自然科学基金重点资助项目(20836003)；教育部长江学者和创新团队计划资
助项目(IRT0532)；国家重点基础研究发展计剐(973计划)资助项目(2007C骄14306)
作者简介：廖鲜艳(1975一)，女，湖南衡IrmA．，剐教授，博士。研究方向：发酵工程与生化工程。
联系人：陈 坚，教授，博士生导师，E-mail：jehen@jiangamn．edu．en。
万方数据
2008年11月 廖鲜艳等：Lactobacilluskefiranofaciens流加发酵法生产开菲尔多糖-41·
kefiranofaciens产生。这种新型的活性多糖不仅可以
作为增稠剂、稳定剂、乳化剂和凝胶剂，而且具有抗
真菌、抗细菌、降压、降血糖、降胆固醇和抗肿瘤的
特性，是一种很好的消炎降压及免疫激活物质，在
临床医药、食品工业及有关生物研究领域都有着广
泛的用途心。】。
发现Kefiran产生菌L．kefiranofaciens的历史不
长，1990年，Mukai等H1最早利用Lkefiranofaciens
发酵生产Kefiran，产量为63mg／L；1992年，Yokoi
等H1发酵生产Kefiran的产量达2040mg／L；1998
年，Takahiro等∞1利用紫外诱变后的厶kefiranofn．
ciensKF-75和TorulasporadelbrueckiiIF01626混合
培养的方法实现工业化生产开菲尔多糖，产量达
3700ms／L。2001年，Cheirsilp等¨o建立了LI|}e—
firanofaciens生产Kefiran的数学模型，考察了pH、底
物和产物对细胞生长的影响以及多糖的形成和底
物的同化作用。2004年，Cheirsilp等哺1又建立了pH
控制模型，并预测了流加发酵中底物乳糖的流加方
式。2007年，Tada等一1补料分批共培养厶kefirano-
faciens和Saccharomycescerevisiae提高Kefiran产量。
本文首先考察在分批发酵过程中初始蔗糖浓
度对LkefiranofaciensJCM6985T细胞生长和Kefi—
ran合成的影响，在此基础上重点研究各种流加方
式(主要为恒速流加和指数速率流加)下的Kefiran
发酵结果，并比较不同培养方式下Kefiran发酵的各
过程参数和指标，为进一步研究Kefiran发酵生产的
放大奠定基础。
1材料与方法
1．1 菌种
乳酸菌(LactobacilluskefiranofaciensJCM6985T)，
购于日本微生物系统保藏中心(JapanCollectionof
Microorganisms)o
1．2培养基和培养条件
1．2．1培养基
种子培养基(g／L)：吐温一801，葡萄糖25，酵母
粉35，无水乙酸钠5，KH：PO。2，柠檬酸三铵2，
MgSO。·7H200．25，MnS04·H200．065；培养基pH
为5．5。
发酵培养基(g／L)：吐温一804，MnSO。·H：0
0．2，CaCl20．56，MgS04·7H20l，NaCI．5，K2HP04
4，柠檬酸三铵4，无水乙酸钠5，蔗糖100，酵母粉
100；培养基pH为5．0。
流加培养基(g／L)：MnS04·H201，CaCl22．8，
MgS04·7H205，NaCI12．5，K2HP0420，柠檬酸三铵
20，无水乙酸钠25，蔗糖500。
1．2．2培养条件
种子培养：将保藏在甘油管中的菌种接种至装
有100mL种子培养基的250mL三角瓶中静置厌氧
培养，恒温培养箱温度30℃，培养时间70一75h。
发酵培养：全自动3L发酵罐装液量1．5L，接
种量10％，发酵前冲人N：以保证罐内无0：，搅拌转
速50r／min，通过流加8mol／L的NaOH溶液控制
pH在5．0，温度设定为28℃。指数速率流加发酵
速率F按下式计算：，=熟exp(∥)(1)‘ yx／s(|sF—S)～¨r7 ”7
式中：X和S分别为发酵罐中细胞和底物质量浓度，
g／L；g为生长速率，h～；V为发酵液体积，L；S，为补
加底物的质量浓度，g／L；y矗为细胞对底物的得率
系数；(vx)。为培养体系的初始细胞量，g。
1．3分析方法
1．3．1蔗糖的测定
采用间苯二酚法¨01。在紫外可见光分光光度计
(UV7500)上测500nm下吸光值，根据蔗糖标准曲线
计算出残余蔗糖的质量浓度。
1．3．2细胞干质量的测定
一定量的发酵液离心后用蒸馏水洗涤3次，得
到的新鲜菌体在60℃下烘至恒质量后称其质量，计
算出菌体的质量浓度。
1．3．3开菲尔多糖的测定
采用蒽酮硫酸法07l。在620nln下测定吸光值，
根据乳糖标准曲线计算得出多糖质量浓度。
2结果与讨论
2．1初始蔗糖质量浓度对开菲尔多糖分批发酵的
影响
由图1可知，在考察的初糖质量浓度范围内，所
获得的细胞量和Kefiran产量随初糖质量浓度的提
高而增加。
从不同初糖质量浓度下Kefiran分批发酵过程动
力学参数随时间变化情况可以看出，在较低的初糖质
量浓度下，达到最高比生长速率、最高Kefiran比合成
速率及最高蔗糖比消耗速率的时间最短，同时最高
Kefiran比合成速率及最高蔗糖比消耗速率最大。
万方数据
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100
80
60
40
20
0 24 48 72 0 24
t／h
(a)
瘿
却s
氍
O
48 72 0 24 48 72
t／h t／h
∞ (c)
巩 池
(e) (0
o、2．一34．5g·L-1；·、卜54．7g·L一1；口、4-一78．59‘L-1；．、5__99．9g。L-
图l 不同初糖质量浓度下Kefiran分批发酵过程随时间变化情况
Fig．1Time-COUlt葛e$onvariousinitialsucroseconcentrations
对不同初糖质量浓度下的分批发酵过程进行
总结(表1)，随着初糖质量浓度的提高，细胞对蔗糖
的利用速率加快，蔗糖的平均消耗速率相应提高；
细胞量和Kefiran产量逐渐提高，细胞及Kefiran的
生产强度也呈上升趋势。
表l 不同初糖质量浓度Kefiran分批发酵过程动力学参数比较
Table1 ComparisonofparametersinbatchKefiranproductionondiverseinitialBUCIOseconcentrations
动力学参数
初始蔗糖质量浓度／(g·L一)
17．8 34．5 54．7 78．5 99．9
残余蔗糖质量浓度／(g·L“) O．4 0．9 3．2 1．6 2．8
培养时间／h 42．0 55．0 57．5 66．0 70．0
获得最大细胞干质量浓度的培养时间／h 30．0 40．0 44．5 54．0 55．0
最大细胞干质量浓度／(g·L’‘)4．88．4 10．9 13．4 16．3
最大Kefrian产影(g·L一) 1．54 2．23 2．94 3．48 3．94
蔗糖消耗速率／(g·L～·h。1) 0．4l 0．61 0．90 1．16 1．39
最大比生长速率／h～0．160．12 0．18 0．13 0．13
最大Kefiran比合成速*-／h～0．0910．056 0．083 0．055 0．076
最大蔗糖比消耗速彰h— 1．25 0．86 0．76 0．45 0．29
细胞平均比生长速率／h一0．0510．043 0．047 0．039 0．042
Kefiran平均比合成速彰h～0．0210．017 0．020 0．014 0．019
蔗糖平均比消耗速彰h～0．360．29 0．25 0．20 0．17
细胞对蔗糖产率系数／(g·g’1)0．2730．251 0．211 0．174 0．168
Kefiran对蔗糖产率系数／(1Ilg·g’1)88．50 66．37 57．09 45．25 40．58
细胞产率·(g·L～·h。1)0．1580．21l 0．244 0．247 0．233
Kefiran产本y(mg．L～·h一) 36．67 加．54 51．13 52．73 56．28
一l-1，警一爨邕q
，．霉制耀
卜苗啦一
万方数据
2008年11月廖鲜艳等：Lactobacilluskefiranofaciens流加发酵法生产开菲尔多糖·43·
而与之相对的是，蔗糖平均比消耗速率，细胞
平均比生长速率以及Kefiran平均比合成速率都呈
下降趋势；最终菌体对蔗糖产率系数和Kefiran对蔗
糖产率系数明显降低。由此可见，较高初糖质量浓
度的分批发酵并不能实现高产量、高得率和高生产
强度的统一，但对于细胞生长和Kefiran合成，提供
足够的糖是必需的。所以有必要寻求其他的发酵
方式(如流加发酵)来满足Kefiran的高产。综合表
中的结果还可以得出分批发酵中20g／L左右的初
始糖质量浓度较为适宜。
争
蠢
甏
争
蓄
嚣
≮
2．2分批补料培养对开菲尔多糖生产的影响
由以上研究结果可知，为了获得较高细胞浓度和
Kefiran产量，必须增加底物蔗糖的供给，然而初始蔗
糖浓度又不宜太高。因此，以下尝试采用分批补料的
培养方式将蔗糖分批次加入培养体系，以考察对Ke—
titan发酵过程的影响。当分批发酵进行到29h，开始
补加蔗糖(总糖质量浓度97．9g／L)，分4次加入(时
间间隔约24h)，发酵过程中蔗糖的消耗、细胞生长和
Kefiran合成情况如图2所示。
图2蔗糖分批补料培养方式下Kefiran发酵过程随时间变化情况
Fig．2Time—coursesnd rbatchsuc-osefe ding
由图2可以看出，发酵至136h蔗糖(初糖+补
糖)全部消耗完毕，菌体量在细胞耗糖的同时逐渐
增加，并在112h达到最大值30．5g／L，Kefiran产量
也随着细胞的生长而平稳增加至2．45g／L。整个发
酵过程的一系列动力学数据通过计算可以得到，见
图2和表2。
表2不同培养方式下细胞生长和Kefiran合成过程参数比较
Table2 ComparisonofparametersforKefiranproductionunderdiversecultivationmodes
总糖质量浓度／(g·L“) 99．4 100．2 108．7 106．1 97．9 99．9
残余蔗糖质量浓度／(g-L一)0．60．9 0．8 1．7 1．2 2．8
培养时间／h 96 96 84 72 136 70
最大细胞干质量浓度／(g·L叫) 28．9 63．6 67．0 38．2 30．5 16．3
最大Kefiran产彰(g·L。1) 2．92 4．95 4．23 2．54 2．45 3．94
最大比生长速影h～0．0953 0．679 0．254 0．169 0．060 0．130
最大Kefiraa比合成速率／(唱·g一·h‘1)4．14 28．9 11．2 27．4 7．70 76．0
平均比生长速彰h～0．0380．084 0．050 0．052 0．016 0．042
Kernan平均比合成速率／(Illg·g一-h。1)2．26 4．62 2．52 7．12 28．8 19．0
细胞对蔗糖产率系数／(g·g“)0．2920．640 0．621 0．366 0．315 0．168
Kefiran对蔗糖产率系数／(1ng·g一)29．55 49．85 39．20 24．32 25．33 40．58
细胞产彩(g·L～·h。)0．3010．662 0．798 0．530 0．272 0．233
Kefiran产率／(1Ilg·L～·h“) 30．42 51．56 50．36 35．28 18．01 56．28
万方数据
·44· 生物加工过程 第6卷第6期
2．3恒速流加发酵对开菲尔多糖生产的影响
恒速流加作为较简单的底物SHJU方式，在合适
的补糖速率下可以用于细胞的高密度培养，进而实
现提高代谢物产量的目的。采用3种不同的恒定流
加速率，在发酵培养约24h开始补加蔗糖，使总糖
质量浓度达到约100g／L，然后经历一个分批发酵过
程至蔗糖消耗完全(图3)。蔗糖平均流速分别为
2、4、6s／(L“)。在所考察的发酵周期内，蔗糖都
出现了不同程度的积累，而恒速流加4g／(L．h)的
蔗糖积累最少，也最先被耗完，3种流速下细胞干质
30
?20
《
蓑10
q
80
■60
耋40
再
*20
q
量浓度分别能达到28．9，63．6和67．0g／L，Kefiran
产量分别为2．92，4．95和4．23g／L。
2．4指数速率流加发酵对开菲尔多糖生产的影响
根据指数速率流加方程式(1)，结合分批发酵
过程底物消耗和细胞生长的规律(表1)，同时考虑
到流加发酵过程中需要一部分营养物质参与维持
细胞代谢，因此选取肛=0．1h～，Vo=1．5L，Xo=
4g／L，yx／s=0．25g／g，S，=500g／L，按照计算出的
流量变化数据进行指数速率流加发酵实验。发酵
25h开始指数流加，至40h流加结束。
O 24 48 72 96 0 24 48
t／h t／h
(a) 彻
l
●
誊
遵·
72 96 0 24 48 72 96
t／h
(c)
·—29·L-1。h-1；口--49·L-1·h-1；A--69。L-‘’h一1
图3蔗糖恒速流加下Kefiran发酵过程随时间变化情况
Fig．3Time-coursesatdifferentco stantrates
蔗糖指数速率流加Kefiran发酵过程随时间变化
情况如图4所示，在指数速率流加前期，流加的蔗糖基
本可以完全消耗，细胞继续维持对数生长状态。当蔗
糖开始有积累时，细胞生长速度便有所减慢，至48h细
胞量及Kefiran量摹本稳定，发酵结束时，细胞量和Ke-
firan量分别达到最大值38．2g／L和2．54g／L。
图4蔗糖指数速率流加下Kefiran发酵过程随时间变化情况
Fig．4Time—courseatanexponentialrateofsucrosefe ding
2．5不同培养方式下开菲尔多糖生产情况比较
不同培养方式下的Kefiran发酵生产结果如表
2所示。通过比较可以看出，底物流加培养均明显
获得了比分批培养高的细胞量、细胞得率和细胞生
产强度。产物合成方面各种流加方式不尽相同，分
批补料方式下除细胞量、细胞得率及细胞生产强度
以外的其他指标都比分批发酵的低；指数速率流加
培养中Kefiran的产量也没有得到与菌体量相应的
提高；而在恒速流加培养方式下，4g／(L·h)和
6g／(L·h)的蔗糖流加速率下无论在产量、得率还
万方数据
2008年11月 廖鲜艳等：Lactobaeilluskefiranofaciens流加发酵法生产开菲尔多糖·45·
是在生产强度方面都比分批发酵有明显提高。综
合比较，4g／(L·h)的蔗糖流加速率下可以得到最
高的细胞量和细胞生产强度、Kefiran产量和Kefiran
发酵强度，是开菲尔多糖生产较适宜的流加方式。
流加培养操作的优点是使发酵系统中保持低
的营养物浓度，一方面消除了C源快速利用引起的
阻遏效应，另一方面又避免了培养基中某些成分的
毒害作用，而且还可以起到稀释发酵液以降低黏度
的效果。因此，流加发酵可以延长细胞对数生长期
和平衡期的持续时间，增加生物量和平衡期细胞代
谢产物的积累。本研究结果印证了这一理论，但流
加培养的操作过程复杂，成本较高，因此，流加培养
模型的建立将是后续研究方向。
3结论
1)随着蔗糖质量浓度的增加，细胞对蔗糖的利
用速度加快，细胞和Kefiran生产强度相应提高，但
细胞平均比生长速率和Kefiran平均比合成速率却
逐渐下降，最终细胞和Kefiran对蔗糖的得率均有所
降低。因此，仅通过分批培养难以实现细胞和Kefi—
ran高产量、高得率和高生产强度的有机统一。
2)分批补料、恒速流加和指数速率流加等培养
方式都可以实现乳酸菌细胞的高产。但综合比较
Kefiran的产量、得率和生产强度，4g／(L·h)的蔗糖
恒速流加是Lkefiranofaciens发酵生产Kefiran较适
宜的流加方式。
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