全 文 ：漆酶高产工程菌构建及漆酶对 !""!的脱色作用
刘卫晓，钞亚鹏，钱世钧!
（中国科学院 微生物研究所，北京 #$$$%$）
摘 要：研究提取产漆酶白腐菌（!"#$ %&’(")*)）的总 !&’，利用 !()*+!克隆到漆酶的 ,-&’，并将其克隆到表达载
体 ./’*0’，重组质粒经线性化、电激转化 +&,-&. /.)0"1&) /1##2、通过底物显色反应筛选漆酶生产工程菌株，在最适
培养条件下该菌株产酶活力高达 34$5 6·789 #。纯化得到漆酶对 !""!（!:7;<=> ?@A>>A;BC ?>D: !）有很好的脱色作用，
该酶的最适脱色 .E为 24$，最适脱色温度为 5$ F。当溶液中漆酶活力为 #4$ 6·789 #，在最适脱色条件下作用
#G H，#$$ 7I·89 #!""!溶液脱色率可达 3$J以上。
关键词：产漆酶工程菌；!""!；脱色
中图分类号：K%#L43 文献标识码：’ 文章编号：#MNG 9 5MN%（G$$L）$# 9 $$G# 9 $L
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7-4 8"&/$：>;,,;U:)U:,@:CABI :BIAB::@:Y UC@;AB；!""!；Y:,=>=@A<;CA=B
漆酶（^+#4#$454G）是一种含铜离子的多酚氧化
酶，广泛分布于高等植物（如漆树）和许多真菌中［#］。
漆酶多为分泌型糖蛋白，且一般为单体酶。该酶具
有广泛的底物作用范围，可以氧化多种酚类化合物
及其衍生物；在助剂（如 ’"(1［G\G);)
?:BAB:)M)UDV=BA, ;,AY）］，G，G\)偶氮)双)（5)乙基)
苯并噻唑)M)磺酸））存在的情况下，还可以氧化降解
一些不含酚羟基的酚类类似物。因此，它在许多方
面都有着重要的应用价值，如在造纸工业中用于生
物漂白及漂白废水的处理，食品工业中防止果汁产
生沉淀，制漆工业中用于改善油漆的性能等等［G)L］。
! 收稿日期：G$$5)##)GL
基金项目：国家 %M5项目资助（G$$#’’G#L#M#）
作者简介：刘卫晓（#3NM)），女，博士研究生，研究方向：酶工程。
联系人：钱世钧，^ )7;A>：KA;BUT_ UDB‘ A7‘ ;,‘ ,B，(:>：$#$)MGM2#23%
第 G卷第 #期
G$$L年 G月
生 物 加 工 过 程
+HAB:U: a=D@B;> =V "A=.@=,:UU ^BIAB::@ABI
b:?‘ G$$L
·G#·
万方数据
近年来，随着人们环保意识的增强，漆酶在环境污染
物治理方面的应用显得越为重要［!］，其中，用漆酶降
解印染工业废水中的合成染料，便是当前研究的热
点之一。
常用的合成染料按其化学结构可分为以下几大
类：偶氮类、三芳香甲烷类和蒽醌类染料等。大量的
研究结果表明，在三大类染料中蒽醌类染料最易被降
解，偶氮类次之。"##"（"$%&’() #*+))+&,- #).$ "）是
一种重要的工业染料，属于蒽醌类染料。它广泛应用
于印染和纺织工业，还经常用作许多合成染料的前体
物质。许多研究结果表明，一些产生漆酶的白腐菌对
"##"有很好的脱色作用。许多研究工作者还发现，
可以利用 "##"的这个特点来筛选漆酶产生菌株。
本实验室利用该方法筛选到一株产漆酶白腐菌
（!"#$ %&’(")*)）［/］。但利用白腐菌进行染料废水处理
有一定的技术难度，因为白腐菌培养时极易被污染，
产酶活力不稳定同时其产酶活力相对都比较低，这就
造成利用白腐菌进行污水处理效果不太理想。因此
在本文中，我们从产生漆酶的原始菌株出发克隆了漆
酶的 0123，构建了漆酶高产工程菌、优化了其发酵条
件，经纯化得到了电泳纯的漆酶，并研究了该酶在不
同实验条件下对 "##"的脱色作用。
! 材料与方法
454 材 料
3#67［898:&’+,(;+<:（=:$->?);$,’->+&()+,$:/:<.@(,+0
&0+A）］（7+B%&）
"##"（"$%&’() #*+))+&,- #).$ "，7+B%&）
抗生素 C$(0+,（D,E+-*(B$,）
FG3HC3（D,E+-*(B$,）
+&,-&. /.)0"1&) G744!（D,E+-*(B$,）
原始菌株：!"#$ %&’(")*)（由本实验室筛选保存）
458 工程菌构建
45854 引物设计
根据 ! 5 %&’(")*) 中漆酶基因序列（由本实验室
克隆得到并注册到 G$,#&,I，->$ &00$<<+(, ,.%;$*，
3J4/KLM8）设计下列引物：
H2 !9:6G3NG3366N36G66NNGN66N33N3NG:=9
HN !9:63GNGGNNGN6N3G6GG6N3G33GGG:=9
45858 构建重组表达载体
提取 ! 5 %&’(")*) 总 "23（6*+’() I+-，D,E+-*(B$,），
以 ()+B(:（A6）4!反转录合成 0123，"6:HN"扩增得到
漆酶的 0123，将其克隆到表达载体 FG3HC3（ D,:
E+-*(B$,），重组质粒 FG3HC3:0123构建如图 4所示。
图 4 表达载体构建（FG3HC3:)00）
O+B54 N(,<-*.0-+(, (@ $PF*$<<+(, E$0-(*（FG3HC3:)00）
4585= 工程菌获得
重组表达载体经 2)/34 酶切后，电激转化毕赤
酵母 G744!，筛选阳性转化子。
45= 培养基
JH1（J$&<- $P-*&0- 4L B，F$F-(,$ 8L B，葡萄糖 8L B，
用蒸馏水定容至 4 Q）。
筛选阳性转化子用培养基；JH1琼脂培养基，其
中含有 4LL!B·%Q
R 4 C$(0+, 抗生素，L58 %%()·QR 4
3#67和 L54 %%()·QR 4 N.7SM。
表达漆酶用发酵培养基：液体 JH1 中含有
N.7SM L5M %%()·QR 4
［K］。
45M 漆酶酶活测定
按参考文献［T］略作改动。= %Q反应体系中，含 L54
%Q酶液，85K %Q醋酸:醋酸钠缓冲溶液（L54 %()5QR4，FU
M5!），加入 L58 %Q 3#67（L5! %%()5 QR 4）以启动反
应，8! V水浴保温 ! %+,，测定 5M8L。一个酶活单位
（W）是指上述条件下，反应体系中每分钟催化 4!%()
·QR 4 3#67氧化所需的酶量。
45! 漆酶的分离纯化
将工程菌接种到液体发酵培养基，于 8L V，8!L
*X%+, 培养 8 A，发酵液于 M V，/ LLL *X%+, 离心
4L %+,，取上清。粗酶液按文献［T］所述方法：经硫
酸铵分级沉淀、1Y3Y纤维柱层析、H>$,() 7$F>&*(<$6Z
/ O&<- O)([疏水柱层析进行纯化。
45/ 脱色处理及脱色率计算
在 "##" 溶液中加入一定量的纯酶液，使得
"##"的终浓度为 4LL %B·QR 4，在不同实验条件下
作用一段时间后，测溶液的吸光度 5!\!（"##"最大
吸收波长为 !\! ,%）。相同实验条件下，加入等量
·88· 生物加工过程 第 8卷第 4期
万方数据
!"" #灭活 $ %&’的酶液作为对照，测其吸光度 !"，
脱色率（(）)（!" * !）+ !""( , !"［-］。
! 结果与分析
./! 产漆酶工程菌构建
经 012340克隆到漆酶的 5678，测序结果表明
该序列含有 ! $$9 :;（<=’>?’@ ?55=AA&B’ ’C%:=D，
8EFG$..H）。经 I5B0 J和 7BK J双酶切，克隆到表达
载体 ;<83L8（./- @:;）。建好的重组表达载体经
"#$%& 酶切线性化、纯化后，电激转化毕赤酵母
紫色物质，这是该转化子产生了胞外漆酶，使得培养
基中的 8>1M发生氧化发生颜色变化。
./. 漆酶的表达
将筛选到的阳性转化子进行摇瓶试验，我们研
究了培养温度、培养基中 4C. N的浓度等试验因子对
工程菌产酶活力的影响。结果表明该工程菌在
." #，.$" D,%&’，采用含 "/O %%BP·Q*! 4CMRO的 E36，培
养至第 . S F T时产酶活力较高，最高可达 -/"F U·%Q*!
（图 .）。其产酶活力是原始菌株的 F S O倍，最适产酶
时间比原始菌株缩短 F S $ T。
图 . 工程菌产酶活力曲线
V&W/. 1X= P?55?A= ?5K&Y&KZ B[ KX= KD?’A[BD%?’K（;<83L8,P552
%=’K=T ?K ." #，.$" D,%&’
./F 漆酶的纯化
粗酶液经硫酸铵分级沉淀、6I8I纤维柱层析、
3X=’BP M=;X?DBA=1] G V?AK VPB\疏水柱层析纯化后，经
M6M238其分子量（约为 GG/$ @6?）大于原始菌株所产漆酶
（G"/F @6?）［H］，这可能是在毕赤氏酵母中表达的漆
酶过度糖基化所致。
Q?’= !：]?D@=D；P?’= .：;CD&[&=T X=K=DBPBWBCA P?55?A=
图 F 漆酶的 M6M238V&W/F M6M238图 O 溶液 ;^和时间对 0>>0脱色率的影响
V&W/O I[[=5KA B[ ;^ B’ KX= T=5BPBD&_?K&B’（(）B[ 0>>0 ?K
T&[[=D=’K K&%=A
./O 实验因子对 0>>0脱色率的影响
./O/! 溶液 ;^和处理时间对脱色率的影响
获得的纯酶液经适当稀释后，加到 ;^O/"、$/"、
G/"的 0>>0质量溶液中，使得溶液中 0>>0质量浓
度为!"" %W·Q*!，漆酶活力为 !/" U·%Q*!。于 F" #，
.$" D,%&’处理，每 . X检测脱色率（(）。结果如图 O
所示，漆酶作用的前 G X内，0>>0的脱色率随处理
时间延长而显著增加，且溶液的 ;^对脱色率有明
显的影响［脱色率（;^ O/"）‘脱色率（;^ $/"）‘脱
.""O年 .月 刘卫晓等：漆酶高产工程菌构建及漆酶对 0>>0的脱色作用 ·.F·
万方数据
色率（!" #$%）］。在 # &后，!" ’$%的 ())(溶液脱
色率增加缓慢，而其他两溶液中脱色率仍继续增加。
在 *+ &时，,种溶液中 ())(的脱色率均达到最大，
其中 !" -$%的 ())(溶液脱色率最高达到 .%$*/。
+$’$+ 样品处理状态对脱色率的影响
在 !"’$%、-$%、#$% 的 ())(（*%% 01·23 *）溶液
中，分别加入酶液使酶活力为 *$% 4·023 *。其中一
组样品于,% 5，+-% 67089处理，另一组于 ,% 5静止
放置，*+ & 后测定脱色率，结果如图 - 所示，于 ,%
5，+-% 67089处理三种溶液脱色率均显著高于 ,% 5
静止放置处理的样品。由于漆酶催化氧化反应需要
:+的参与，所以工业化应用中应采用充气处理，以提
高脱色效率。
图 - 样品处理状态对脱色率的影响
;81$- <==>?@A B= @&> @6>C@0>9@ A@C@>A B9 @&> D>?BEB68FC@8B9
（/）B= ())(
+$’$, 温度对脱色的影响
将浓度为 *%% 01·23 *，漆酶活力为 *$% 4·
023 *，!"为 -$%的 ())(溶液，分别于 +%、,%、’%、-%
和 #% 5的条件下处理 # &和 *+ &后测定脱色率，结
果如图 #所示。由图可以看出，温度对脱色反应影
响显著。在处理的前 # &内，当低于 ’% 5时，随着
温度的升高脱色效率明显增强，但随着处理时间延
长，在 ,% 5时，处理 *+ &时脱色率达到最高。其中
-% 5和#% 5的样品是静置处理。
! 结 论
本文提取产漆酶白腐菌（!"#$ %&’(")*)）总 (GH，
利用 (IJKL(技术克隆到漆酶的编码基因 ?MGH，并
将其克隆到表达载体 !NHKOH中，所获得的重组质
图 # 温度对脱色率的影响
;81$# <==>?@A B= @>0!>6C@P6> B9 @&> D>?BEB68FC@8B9（/）B= ())(
粒经线性化、电激转化 +&,-&. /.)0"1&) NQ**-、通过底
物（H)IQ）显色反应筛选漆酶产生工程菌株。该菌
株在最适培养条件（+% 5，+-% 67089，利用含有
LPQ:’ %$’ 00BE·23 *液态 RKM培养基）下产酶活力
最高达 .$%, 4·023 *。其产酶活力是原始菌株的
, S ’倍，最适产酶时间比原始菌株缩短 , S - D。
试验结果表明纯化得到的漆酶对 ())(有很好
的脱色作用。该酶的最适脱色 !"为 -$%，最适脱色
温度为 ,% 5。于 ,% 5，+-% 67089处理的样品，其脱
色效率要显著好于 ,% 5静止处理，这主要是由于漆
酶催化底物的反应需要有氧气的参与。当溶液中漆
酶活力为 *$% 4·023 *，在最适脱色条件下作用 *+
&，*%% 01·23 *())(溶液脱色率可达 .%/以上。本
文首次利用工程菌所产漆酶，对蒽醌类染料 ())(
进行降解，而且降解效果理想，这同时说明在利用白
腐菌进行染料降解时，漆酶起了非常重要的作用。
参考文献：
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（下转第 +.页）
·+’· 生物加工过程 第 +卷第 *期
万方数据
分子蛋白，当载体表面所担载的酶分子数量多到一
定程度后，即使再增加载体表面的结合位点，也会因
为空间位阻的限制而使酶分子无法结合到载体上。
这与小分子戊二醛不同，戊二醛量增加，会使酶蛋白
变性［!"］
! 结 论
提出“柔性固定化酶”的模型，其特点是：柔性
固定可改善因直接固定化及手臂固定化使酶失活的
缺陷，并提高固定化酶的自由度；本文选用粒径单分
散 #$微球，通过傅%克酰基化反应对其表面羧基化，
并将淀粉氧化得到含有醛基的 &’$作为柔性链，再
使柔性链偶联在羧基载体上得到柔性固定化载体，
以此载体进行柔性固定化所得到的酶活回收率相当
于传统戊二醛手臂固定化的两倍；另外酶活回收率
随着 &’$柔性链上醛基含量增加而提高，但醛基含
量多到一定程度后，由于酶分子空间位阻的影响，酶
活回收率基本不变。
参考文献：
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76C5@V;=%F@=C06=6=V G;56I0C6I;: @AC06=;G D5@4 G60>G;<1G; F;>>3>@:;［/］J
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