全 文 ：2008年1月 唐嘉等：一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方法 ·37·
一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方法
唐 嘉1，陈朝银1，赵声兰2，夏静1，张 涛1．r
(1．昆明理工大学 清华大学生物资源开发工程研究所，昆明650224；
2．云南省中医学院 基础医学部，昆明650000)
摘要：尝试了固体碘熏蒸显示透明圈，然后直接传代培养菌株检测耐受时间及存活后产异淀粉酶的栖热茵酶活
变化。同时与碘液染色及碘液熏蒸进行对比。结果显示用0．04g碘固体熏蒸lrain效果较好，直接传代茵落存活
率高，对生产性能没有显著影响，不易污染杂菌，方便、快捷，可替代碘液显色法。
关键词：直接传代；碘熏蒸；耐受时间
中图分类号：Q939．11 文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)Ol-0037一04
Asimplifiedmethodf rprimaryscreeningofextracellular
amylolyticenzymeproducingstrains
TANGJial，CHENChao．yinl，ZHAOShen．1an2，XIAJin91，ZHANGTa01
(1．InstituteofBio舢umesR＆D，KunmingUniversityofScienceandTechnology，Kunming650224，Chins；
2．DepartmentofAppliedPharmacy，YunnanCollegeofTraditionalChineseMedicine，Kunming650220，China)
Abstract：Iodinevaporwasusedtovisualizehalosforscreeningofextracellularamylolyticenzymeprodu-
cingstrains．Thescr enedcoloniesw redirectlytransferredtotesthepersistenttimeandisoamylaseae—
tivityofThermus8p．Lugol’SiodinesolutioncolorationWr tscomparedwithLugolsiodinevapormethodin
thescreening．Experimentalr sultsshowedhatvaporwith0．04giodinefor1 minuteswapreferredcon—
ditionofefficientandharmlesstothestrainsa dtheproductiontraits．
Keywords：directt ansfer；iodine—vaporstaining；persistenttime
淀粉酶(EC3．2．1．x)是应用广泛的酶种之一，
主要来源于植物及微生物。目前初筛产胞外淀粉
酶的菌株主要采用碘液染色检测透明圈法¨-3J。即
培养基中加入可溶性淀粉，其螺旋(约25～30个残
基)中的短串螺旋和碘分子之间的相互作用形成稳
定的蓝一紫色的淀粉一碘络合物，而在产淀粉酶的菌
落周围，由于其产生的酶已将培养基中的淀粉水
解，因此不与碘结合，从而形成透明圈。国内外也
有利用碘固体易挥发的特性，使用碘熏的报道M引，
但由于认为碘有较强杀伤作用，目前尚未有在碘熏
后直接接种传代的报道。有报道[51在熏前先用滤
纸蘸上湿的淀粉，贴到菌落上，再用碘熏，以保护菌
株活性，检测后传代，操作较为繁琐。
本实验采用碘熏法检测胞外淀粉酶水解圈初
筛产酶活力较高菌株，然后直接传代培养检测耐受
时间及存活后产异淀粉酶的栖热菌酶活变化，同时
与碘液染色及碘液熏蒸进行对比。
收稿日期：2006．11-29
基金项目：云南省校共建生物工程重点学科资助
作者简介：唐嘉(1981一)，女，重庆市人，硕士研究生，研究方向：微生物发酵，酶工程。
联系人：陈朝银，教授，E—mail：ehaoyinchen@163．corn．
万方数据
· 38· 生物加工过程 第6卷第1期
1材料与方法
1．1菌株及试剂
栖热菌【9J、淀粉芽孢杆菌、黑曲霉及毕赤酵母
由本实验室保藏；可溶性淀粉，购于Sigma公司；酵
母粉、蛋白胨购于Oxoid公司；琼脂粉购于北京奥博
星生物技术责任有限公司；其他试剂均为分析纯。
1．2培养基及试剂配制
(1)栖热菌、淀粉芽孢杆菌培养采用添加质量分数
0．2％可溶性淀粉的MD培养基【l0|。
(2)曲霉培养采用添加质量分数0．2％可溶性淀粉
的察氏培养基¨1。。
(3)毕赤酵母培养采用添加质量分数0．2％可溶性
淀粉的麦芽糖蛋白胨培养基u1|。
(4)稀碘液试剂配制参考文献[11]。
1．3仪器与设备
无菌操作台，电子天平，恒温培养箱，Ultrospec
2000紫外分光光度仪(Phamacia)。
1．4方法
把栖热菌、淀粉芽孢杆菌分别点接后于60℃培
养24h，曲霉与毕赤酵母菌点接后28℃培养48h。
1．4．1固体碘量熏蒸效果对比实验
分别称量0．04，0．05，0．08，0．12，0．16g碘固
体对培养的栖热菌进行熏蒸显色，每隔2min挑菌
体划线培养，48h后观察生长情况。
1．4．23种方法对比实验
因生长时间较短而且均为耐热细菌，由此选用
淀粉芽孢杆菌与栖热菌做3种方法对比实验。
碘熏初筛方法：在已经采用点接培养出菌落的
平板盖子上面铺撒0．04g的碘固体，室温放置几分
钟，如果菌落周围出现透明圈，说明该菌落能够产
生胞外淀粉酶，由此可以筛选出阳性菌株。每隔2
min挑菌体划线培养检测耐受时间。
碘液熏蒸实验：在已经培养出菌落的平板盖子
上面滴碘液至基本覆盖盖子，室温放置，计算菌落
周围出现透明圈时间，之后每隔2min挑菌体划线
培养，48h后观察生长情况。
碘试剂染色法：把稀碘液直接滴在培养基表面
染色，室温放置，计算出现透明圈的时间，每2min
挑菌体划线培养，48h后观察生长情况。
1．4．3不同菌株碘熏耐受对比实验
‘分别对点接培养后的栖热菌、淀粉芽孢杆菌、
曲霉及毕赤酵母菌进行碘熏显色，每隔2min挑菌
体划线培养，48h后观察生长情况。
1．4．4碘熏对菌株生产性能的影响实验
以产异淀粉酶的栖热菌为例，对点接培养后的
栖热菌碘熏后每隔2min传代培养24h，再划线接
种于液体MD培养基培养24h，检测异淀粉酶酶活，
酶活测定采用DNS法¨2|，测定∞铷。酶活定义
为：在60℃条件下作用30min，每分钟产生的相当
于1i山mol葡萄糖还原力的酶活定义为一个酶活单
位。同时，为消除菌体量的差异，以菌悬液∞鲫确
定生物量变化。
2结果与分析
2．1 不同质量碘固体熏蒸效果对比实验结果
由图1可见，碘量0．03g显色时间较慢，且显
色效果不明显。0．04g与0．05g均能在1min后明
显显示透明圈，0。05g以后均能较快时间显色。栖
热菌耐受时间以0．04g碘熏后较长，0．05g碘熏后
菌体耐受时间相应缩短，因此得出碘熏量以0．04g
为宜，显色时间快，且对菌体毒害较小。
．虽
墨
厘
茁
献
篷
图1碘量熏蒸对比实验结果
Fig．1QuantitiesofiodineOlltheffectsofvaporing
2．2 3种方法对比实验结果
由表1可知，碘液显色后对菌落杀伤力较强，显
色后直接传代，部分菌种如栖热菌不能生长，生长
的菌落易染杂菌，而显色前传代延长了筛选时间，
且碘液配制费时，不宜采用。加碘液熏后10min能
显示透明圈，达到用固体碘0．04g熏1min的效果，
显色时间较长。显色后传代，栖热菌耐受时间达到
40min，淀粉芽孢杆菌可到450rain。然而碘液中碘
挥发、碘液易贴壁使得回收后使用浓度变化，不宜
重复使用。加固体碘0．04g熏1min后能显示明显
万方数据
2008年1月 唐嘉等：一种初筛产胞外淀粉酶菌株的简化方法 ·39-
透明圈，栖热菌最长耐受时间可达18min，淀粉芽孢
杆菌碘熏后耐受时间大于450min，且可重复使用，
不易染菌，效果相对较好。
表1 3种方法显色比较
Table1 Comparisonofthreem thodsfcolorizingthehalos
注：“一”表示不生长或不染菌、“+”表示染菌
2．3不同菌株耐碘熏对比实验
由表2显示，不同菌种对碘熏的耐受能力不同。
淀粉芽孢杆菌在熏蒸450min后传代仍能存活，而
栖热菌耐受时间最长仅为18min。由此可针对不同
菌株的耐碘能力，在碘熏后一定时间内对所筛选出
来的菌株直接接种传代。
表2不同菌株耐碘熏对比实验结果
Table2 Persistanttimeofdifferentstrainsiodine．vapor
栖热菌淀粉芽孢杆菌瞳霉毕赤酵母
最长耐熏时问／rain18 >450 24 60
2．4碘熏对菌株生产性能的影响
以产异淀粉酶的栖热菌为例，对比固体碘熏前
与分别经碘熏2—18min后直接传代的菌的存活及
所产异淀粉酶酶活变化情况。由图2显示，生物量
在2—12min熏蒸前后波动不大，相对于未经碘熏
的菌悬液有升有降，分析原因与接菌量有关。去除
生物量影响，异淀粉酶酶活变化波动较小。DNS法
测定异淀粉酶酶活结果表明，与未熏对照相比，固
体碘熏一定时间后直接传代不会显著影响异淀粉
酶酶活。
3讨论
利用固体碘升华显示水解圈法筛选产胞外淀
，
粉酶的菌株最早由Lyer等人[131报道，然而由于其
对菌株的毒性，使用前需先传代接菌，操作较为繁
图2碘熏时间对栖热菌生长和产异淀粉酶酶活的影响
Fig．2Effectofexposuretimeiniodine—vaportothe
isoamylaseproductiontraitofThermuasp．
琐，使用率较低。本实验在碘升华法显色后，采用
直接传代培养产酶菌株，结合显色时问及菌株耐受
时间得出最适碘熏量及时间。和碘液熏与碘液染
色对比结果显示，用碘熏检测法能在短时间内较好
显示筛选效果，对菌落杀伤力及酶活影响较小，显
色后可直接接种传代，并且省去了配制碘液的操
作，节约了碘的用量，待显色完毕，亦可将碘进行回
收处理。对4种菌株进行耐熏对比实验得出不同菌
株因其生理生化等结构的不同，对碘熏的耐受能力
不同，然而在碘熏后短时间内均能存活，可直接传
代。此改良碘熏法结合直接传代能方便、快捷地初
步筛选产胞外淀粉酶菌株，可替代碘液显色法推广
使用。
碘熏蒸方法中所用的碘能和各类淀粉质作用，
因此，要进一步确定淀粉酶的种类，需要采用别的
方法进行复筛。
参考文献：
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万方数据
·40· 生物加工过程 第6卷第1期
江苏洁美把“地沟油”炼成生物柴油
生物柴油作为一种可再生的“绿色能源”，近年来在欧美的发达国家已被市场接受。目前，美国生物燃
油的年产量约3．0×105t，原料全部采用色拉油、豆油及菜籽油等“好油”。国外生产的生物柴油由于黏度
大、易结焦，不能单独使用，只能和石化柴油混合使用，最多在柴油中加入25％。而洁美公司采用华东理工
大学的关键技术，原料全都是“地沟油”、废弃食用油等“差油”，不仅破解了黏度大、易结焦的难题，而且质量
指标达到或超过了欧盟标准，可完全取代0号柴油。经南京工业大学检测，使用这种生物柴油后，机动车尾
气中含有的有毒气体比0号柴油少96％。这一项目投产以来，年产量已达2．3×104t。批发价每吨比0号
柴油便宜约600元。
长沙本地产生物柴油明年有望作汽车燃料
湖南中和能源公司位于金洲新区的生物柴油项目分两期建设，首期占地16．7公顷，计划投资2．3亿元，
建成年生产生物柴油13万t的生产线。二期计划投资3亿元，建设年产40万t生物柴油生产线，预计项目
建成后年产值将达到30亿元以上。湖南中和能源公司计划在宁乡开发0．33×104公顷制造生物柴油的光
皮树。按照每公顷12000元收益计算，项目可为当地农民增收4000万元。长沙本地生产的成品生物柴油
有望作为汽车燃料，柴油供应紧张的局面将在一定程度上得到缓解。
(张春鹏)
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