全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ０１０
收稿日期：２０１２ － １０ － ２２
作者简介：尤小娜（１９８４—），女，河北省霸州人，硕士研究生，研究方向：生物制药；谢必峰（联系人），副教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｆｘｉｅ＠ ｆｊｎｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
对胞必佳生产菌株的重新鉴定
尤小娜，林锦彬，雷　 艳，谢必峰
（福建师范大学 生命科学学院，福州 ３５０１０８）
摘　 要：主要是从形态学观察、菌株脂肪酸成分和 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因全序列 ３ 个方面出发，重新对胞必佳生产菌株红
色诺卡氏菌（Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ）进行鉴定。 结果表明，该菌株并非诺卡氏菌属中的红色诺卡氏菌，而属于红球菌属。
１６Ｓ ｒＲＮＡ序列相似性比较和系统进化树进一步说明，该菌株与 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（ＡＹ１１４１１７． １）的同源性最高，是 １
株红色红球菌。
关键词：胞必佳；红色诺卡氏菌；红色红球菌
中图分类号：Ｒ９７９． １ ＋ ９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ００５５ － ０４
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ａｂｏｕｔ Ｎ⁃ＣＷＳ
ＹＯＵ Ｘｉａｏｎａ，ＬＩＮ Ｊｉｎｂｉｎ，ＬＥＩ Ｙａｎ，ＸＩＥ Ｂｉｆｅｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｕｊｉａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｆｕｚｈｏｕ ３５０１０８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ ａｂｏｕｔ Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｒｕｂｒａ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ， ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ １６Ｓ ｒＲＮＡ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｎｏｔ Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ， ｂｕｔ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ． １６Ｓ ｒＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｅｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｍｏｓｔ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ
ｒｕｂｅｒ（ＡＹ１１４１１７． １）．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｎ⁃ＣＷＳ； Ｎｏｃａｒｄｉａ ｒｕｂｒａ； Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ
　 　 红球菌属在 １８９１ 年由 Ｚｏｐｆ 建立，后被取消，
１９７７ 年，Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ 根据自己及许多学者对一些细
菌表型、化学、遗传学形状的研究，提出恢复红球菌
属，并将该属的定义为介于分枝杆菌和诺卡氏菌
Ｎｏｃａｒｄｉａ之间的一类微生物［１］，除紫红分枝杆菌外，
还包括多种老的诺卡氏菌。 因此，红球菌属与诺卡
氏菌属有着密切的亲缘关系。
胞必佳 （ Ｎｏｃａｒｄｉａ Ｒｕｂｒａ Ｃｅｌｌ Ｗａｌｌ Ｓｋｅｌｅｔｏｎ，
Ｎ⁃ＣＷＳ）是红色诺卡氏菌菌体经破碎、化学提取后
精制而成的冻干粉针剂，主要成分为诺卡氏霉菌
酸、阿拉伯半乳聚糖和黏肽［２］。 作为新一代的免疫
佐剂［３ － ４］，其免疫活性强，国内外已将其作为很有价
值的抗肿瘤新药。 福建省山河药业有限公司保藏
的菌株即胞必佳生产菌株，原名为红色诺卡氏菌，
是一种诺卡氏菌型放线菌。
随着科学技术的不断发展，只以形态描述、生
理生化特征等进行的分类已不足以说明问题，诺卡
氏菌型放线菌的分类已经发展到现在的多相分类，
且已有对保藏的诺卡氏菌进行重新分类的研究［５］。
但目前关于胞必佳的研究还主要着重于癌症、炎症
的临床治疗，尚未有关于该菌株菌种采用新方法鉴
定的报道。
笔者主要从形态学观察、菌株脂肪酸成分和
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因全序列 ３ 个方面出发，对该菌的菌种
做进一步的研究，以期使人们对胞必佳生产菌株进
一步认识的同时，也能为以后生产工艺的改进提供
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一些理论依据。
１　 材料和方法
１． １　 材料
１． １． １　 菌种来源
福建省山河药业有限公司保藏菌种，菌株分离
自昆明土壤，于 １９８２ 年收集［６］。
１． １． ２　 培养基
摇瓶培养基：酵母粉（Ｏｘｏｉｄ 公司）１０ ｇ、无水葡
萄糖 １０ ｇ、水 １ ０００ ｍＬ、ｐＨ ７􀆰 ２ ～ ７􀆰 ４、１１５ ℃，２５ ｍｉｎ
高压蒸气灭菌。
１． １． ３　 主要试剂
ＣＴＡＢ、Ｔｒｉｓ、ＥＤＴＡ、ＳＤＳ、琼脂糖均为上海生工
生物技术有限公司产品；ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＴａｑＤＮＡ 聚合
酶、１０ × ＰＣＲ 缓冲液 （含有 Ｍｇ２ ＋ ）、 ｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ
（２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）均为 ＴａＫａＲａ 公司产品；氯仿、异戊
醇、乙醇均为国产分析纯。
１． １． ４　 主要仪器
ＥＸ ５１ 型光学显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ 公司）；ＴＧ１６
Ｗ微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限
公司）；ＤＫ ８Ｄ 电热恒温水槽（上海一恒科技有限
公司）；ＰＴＣ １００ＴＭ ＰＣＲ 仪（美国 Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ）；ＤＹＹ
６Ｃ稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）。
１． ２　 实验方法
１． ２． １　 形态学观察
在液体摇瓶培养基上，一定时间后取样制片，
用光学显微镜观察形态并拍照。
１． ２． ２　 菌体脂肪酸的气相色谱分析
菌体脂肪酸的成分分析委托福建省农科院
完成。
１． ２． ３　 菌体的准备
挑取单菌落至装有 ５０ ｍＬ 生长培养基的 ２５０
ｍＬ三角瓶中，２２０ ｒ ／ ｍｉｎ、２８ ℃ 培养 ２ ｄ，菌液经
８ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、离心 １０ ｍｉｎ收集细胞。
１． ２． ４　 ＤＮＡ的提取
将收集的菌体于 － ２０ ℃预冷研钵中加液氮反
复研磨后，迅速装于 １􀆰 ５ ｍＬ ＥＰ 管中，加入 ６００ μＬ
６５ ℃预热的 ＣＴＡＢ溶液（用前加入体积分数为 ２％
的 β 巯基乙醇 １􀆰 ２ μＬ），６５ ℃温浴 １ ｈ；冷却后，加
入 ６００ μＬ 含有 Ｔｒｉｓ饱和酚、氯仿、异戊醇体积比为
２５∶ ２４∶ １的溶液，混匀，１３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ；吸
上清后装入一个新的 ＥＰ 管，加入 ６００ μＬ 含有氯仿
和异戊醇体积比为 ２４∶ １的溶液，１３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ 离心
１０ ｍｉｎ；吸上清，转入一个新的 ＥＰ 管中，加入 ７ ／ １０
体积的异丙醇混匀， 于 ４ ℃静置 ３０ ｍｉｎ，１３ ０００
ｒ ／ ｍｉｎ离心 １０ ｍｉｎ，弃上清；用预冷的 ７０％乙醇洗涤
２ 次后，将乙醇吸干置于吸水纸上倒置晾干后，加入
２０ μＬ ＴＥ溶液保存。
１． ２． ５　 １６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ 扩增
将提取的基因组 ＤＮＡ 作为模板进行 ＰＣＲ 扩
增。 ５０ μＬ 反应体系包括：模板 ＤＮＡ ４ μＬ， １０ ×
ＰＣＲ缓冲液（含有 Ｍｇ２ ＋ ） ５ μＬ，２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰ
ｍｉｘｔｕｒｅ ４ μＬ，１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ上游引物 ２ μＬ，
１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ １６Ｓ ｒＤＮＡ 下游引物 ２ μＬ， ５ Ｕ ／ μＬ
ＴａｑＤＮＡ聚合酶 ２ μＬ，双蒸水 ３１ μＬ。 ＰＣＲ 反应程
序为 ９５ ℃热变性 ５ ｍｉｎ，９４ ℃变形 ３０ Ｓ，５８ ℃复性
３０ Ｓ，７２ ℃延伸 ２ ｍｉｎ，进行 ３０ 个循环，７２ ℃延伸 １０
ｍｉｎ，４ ℃终止反应。 取 ３ μＬ ＰＣＲ产物用 １． ０％琼脂
糖凝胶电泳检测并拍照。
１． ２． ６　 序列的测定与系统发育分析
ＰＣＲ产物送上海华大基因生物有限公司进行测
序，获得 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因序列提交到 ＧｅｎＢａｎｋ 核酸序
列数据库，并利用 Ｂｌａｓｔ 工具与数据库中已知的相关
序列进行在线比对。 然后用 Ｍｅｇａ ４． １ 软件中的邻接
法（Ｎ⁃Ｊ） ［７］构建系统进化树，进行同源性分析。
２　 结果与讨论
２． １　 形态学的观察结果
取片镜检所示，基丝纤细，培养 １４ ｈ 后，形成分
枝，呈现初级分枝菌丝体（图 １）；而 ２４ ｈ 后菌丝体
断裂成新的杆状非活动小体，直径为 ２． ０ ～ ２． ５ μｍ，
无气生菌丝（图 ２）。
图 １　 １４ ｈ后的菌体形态
Ｆｉｇ． １　 Ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｆｔｅｒ １４ ｈ
所属科属的鉴定是以形态特征为主，同时还需
６５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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图 ２　 ２４ ｈ后的菌体形态
Ｆｉｇ． ２　 Ｍｙｃｅｌｉａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｆｔｅｒ ２４ ｈ
要参考细胞化学的内容。 红球菌属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）
是基于 Ｔｓｕｋａｍｕｒａ［８］和 Ｇｏｏｄｆｅｌｌｏｗ［９］等建立的，在此
之前，这类菌被归为分枝杆菌属或诺卡氏菌属［１０］。
因此，光进行形态学观察并不能确定该菌株归属，
还需要寻找更有力的证据。
图 ３　 菌株 ＹＯＵ ２０２ 及相关属、种间的 １６Ｓ ｒＤＮＡ系统进化树
Ｆｉｇ． ３　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ＹＯＵ⁃２０２，ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｒａ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
２． ２　 菌体脂肪酸的成分分析
对该菌株进行脂肪酸成分的气相色谱分析，可
知该菌株含有的脂肪酸成分共有 ４８ 种，其中，占优
势的脂肪酸成分有 １３ 种（表 １），其余脂肪酸成分的
质量分数介于 ０􀆰 ０７％ ～ １􀆰 ４９％之间。 由于目前对
诺卡氏菌科的脂肪酸气相色谱信息库仍不齐全，只
能获得该菌株的脂肪酸图谱信息，并不能鉴定出该
菌的从属。 从表 １ 可知：除 １９∶ ０（４２􀆰 ４５％ ），质量分
数较多的脂肪酸依次为 １６ ∶ ０、１８ ∶ １ ｗ９ｃ、Ｓｕｍｍｅｄ
Ｆｅａｔｕｒｅ ５，而 １８∶ ０含量很低，这与张建丽等［１１］对诺
卡氏菌型放线菌细胞中脂肪酸的气象色谱分析中
的某些结果一致，但仍需通过对该菌的 １６Ｓ ｒＤＮＡ
基因序列进行分析，进一步鉴定该菌。
表 １　 Ｎ ＣＷＳ生产菌株优势脂肪酸类型和质量分数
Ｔａｂｌｅ １　 ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｓ ａｎｄ ｔｙｐｅｓ ｏｆ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｏｆ Ｎ⁃ＣＷＳ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｒａｉｎ
脂肪酸类型 脂肪酸质量分数 ／ ％ 脂肪酸类型
脂肪酸质
量分数 ／ ％
１５∶ ０ ＩＳＯ ２． ４９ Ｓｕｍ Ｉｎ Ｆｅａｔｕｒｅ ３． １７
１５∶ ０ ＡＮＴＥＩＳＯ ２． ４６ １８∶ １ ｗ９ｃ ５． ４９
１６∶ ０ ＩＳＯ ２． ６ １８∶ １ ｗ７ｃ １． ９２
１６∶ ０ ９． ２３ １９∶ ０ ＣＹＣＬＯ ｗ８ｃ ３． ５１
１６∶ ０ １０ ｍｅｔｈｙｌ ３． ２５ １９∶ ００ ４２． ４５
１７∶ ０ ＩＳＯ ２． １７ Ｓｕｍｍｅｄ Ｆｅａｔｕｒｅ ５ ３． ７１
１７∶ ０ ＡＮＴＥＩＳＯ ２． １２ １８∶ ０ １． ４９
２． ３　 １６Ｓ ｒＤＮＡ的序列分析
该菌株的 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列全长包括 １ ３８１ ｂｐ，发
布在 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库中，序列登录号为 ＪＱ９０６２５８。
用 Ｂｌａｓｔ软件将该序列与 ＧｅｎｅＢａｎｋ 中已报道的 １６Ｓ
ｒＤＮＡ序列进行同源性比较，发现该菌株与红球菌属
的菌株同源性较高，达到 ９８％ ～ １００％。 将该菌株与
红球菌属中的 ９ 株菌和诺卡氏菌属中的 ７ 株菌进行
系统发育分析，得到其系统进化树，见图 ３。 由图 ３可
知，该菌株并未处于诺卡氏菌属的分支内，而是属于
红球菌属，且与 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（ＡＹ１１４１１７􀆰 １） 的相
似性最高，二者间的进化距离最短，应被分在同一个
种内。 因此，该菌为一株红色红球菌。
７５　 第 ４ 期 尤小娜等：对胞必佳生产菌株的重新鉴定
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３　 结　 论
实验所用菌株是由福建省微生物研究所于 １９８２
年从昆明土壤中分离筛选所得，由于当时诺卡氏菌型
放线菌的经典分类主要的依据是形态、培养特征和生
理生化特性，而该菌株菌丝体断裂这一形态特征及培
养、生理生化特征均类似于诺卡氏菌属，因此将该菌
判定为诺卡氏菌属里的红色诺卡氏菌。
鉴于目前对诺卡氏菌科的脂肪酸气相色谱信息
库仍不齐全，只能获得胞必佳生产菌株的脂肪酸图谱
信息，并不能匹配出该菌属的具体分类。 因此须运用
分析和修正红球菌属分类的最有力工具 １６Ｓ ｒＤＮＡ的
序列进行分析；由 １６Ｓ ｒＤＮＡ序列相似性比较和系统
发育分析可知，该菌株并非诺卡氏菌属的成员，而是
属于红球菌属，且与 Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ（ＡＹ１１４１１７􀆰 １）
亲缘关系最近。 因此建议将该生产菌株做进一步的
分类鉴定。
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ａ ｈｏｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ＂ ｒｈｏｄｏｃｈｒｏｕｓ＂ ｃｏｍｐｌｅｘ ［ Ｊ］ ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９７７，１００（１）：９９⁃１２２．
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８５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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