全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
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收稿日期&$%%. 8%# 8%
基金项目&四川省教育厅自然科学科研基金资助项目$%-$*%,$%
作者简介&李德荣$&.!&#%"女"山东临沂人"护士"研究方向&生物质化学与材料)朱"斌$联系人%"副教授"XN<=;G&34H2;?$$.%$.)e&$)7C><
人胎盘中胶原蛋白的提取和表征
李德荣&"于相梅&"朱"斌$
$&7临沂市兰山区人民医院"临沂 $-)%%%) $7四川职业技术学院"遂宁 )$.%%%%
摘"要&采用碱 酶结合法以人胎盘为原料提取胶原蛋白"并使用原子力显微镜$(\a%(差示扫描量热仪$US*%(圆
二色光谱$*U%和傅立叶变换红外光谱$\_[Z%对所得胶原蛋白产品进行表征 结果表明&此工艺路线的胶原蛋白
得率高"达到 %f&%$k)提取时间由,! 4以上减少到$, 4以内"而且所得胶原蛋白分子完整地保留了其螺旋纤维结
构 此法是从人胎盘中提取胶原蛋白的一种行之有效的方法
关键词&表征)人胶原蛋白)提取)胎盘
中图分类号&1!&.""""文献标志码&(""""文章编号&&)-$ 8#)-!$$%&%%%# 8%%! 8%,
#LG45:G.2/5/J:-545:G04.I5G.2/27-3H5/S965:0/G5 :265;0/
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BEBC:;]BE>FBI:F=C:;?J:4BC>G=JB? EF><4H<=?N9G=CB?:=7
N0B O24J1&C4=F=C:BF;3=:;>?) C>G=JB?) BI:F=C:;>?) 4H<=?N9G=CB?:=
""胎盘作为维持胎儿在母体内生长发育的临时
性器官"因其特殊的屏障功能与内分泌功能"自古
以来就为人们所重视,&- 近年来"人们对胎盘的
研究逐步深入"在加工上也由简单的烘干与水煮
发展到生物萃取"使人们对胎盘所含的有益成分
及生物活性物质有了更深入的了解 其中"自人
胎盘中提取胶原蛋白是人们感兴趣的研究方向
之一,$ 8,-
现有的胶原蛋白提取方法主要以富含胶原蛋
白的动物组织为原料"采用酸法(碱法(酶法或酸酶
结合法等进行,- "但普遍存在着提取时间过长或产
品得率低等问题 笔者首次采用碱溶液预处理和
胃蛋白酶提取相结合的碱 酶提取法从人胎盘中提
取胶原蛋白"以期降低提取时间和提高产品得率
而且"使用原子力显微镜$(\a%(差示扫描量热仪
$US*%(圆二色光谱$*U%和傅立叶变换红外光谱
$\_[Z%对所得胶原蛋白产品进行表征
E?实验部分
E=E?仪器与材料
S4;<=@3H S5a .)%% 原子力显微镜"日本岛津
公司)/B:3DC4 $%%5*差示扫描量热仪"德国耐池公
司)W(S*+ W!&% 圆二色光谱仪"日本分光公司)
5BFA;?NXG美国5BFA;?XGE=C?实验方法
&7$7&"碱 酶法提取胶原蛋白
取正常分娩的胎盘"去除表面的膜(血液等杂
质$提取操作均在 , l条件下进行%"用去离子水洗
涤 # g 次"然后用刀将其切成小块$约 %f C%f C<% 将胎盘小块于& <>G0T的/=+L溶液中浸
泡 &% @ 左右"然后用去离子水洗涤 # g 次"再用
$% <<>G0T的XU_(溶液洗涤 # g 次"最后用去离
子水将其洗涤至中性 将胎盘小块匀浆"并用胃蛋
白酶 在 %f <>G0T醋 酸 溶 液 中 酶 解 $, 4" 用
%f <>G0T醋酸溶液稀释酶解液 $ g# 倍并过滤"用
%f <>G0T的/=*G溶液盐析"离心(透析"再进行一
次盐析(离心(透析"最后冻干"得到人胎盘胶原蛋
白试样"并置于 , l保存备用
&7$7$"原子力显微镜$(\a%的测定
将胶原蛋白溶解于 %f <>G0T醋酸溶液中"配
制成质量浓度约为 &f% j&% 8, J0酸溶液"并于 , l平衡 &$ @ 后用于 (\a检测 将
一小滴$约 %f#
!
T%胶原蛋白溶液滴在新剥离的云
母片上"然后于超净台上自然干燥成膜 胶原蛋白
的 (\a图使用敲击模式下的原子力显微镜进行
测试
&7$7#"差示扫描量热仪$US*%的测定
准确称取一定质量$& g$ 样尽可能干燥%于 US*铝坩埚中并加盖密封"取另
一空坩埚作为参照"从 $% l加热至 &$% l"升温速
率为 l0<;?"试样室的/
$
流量为$% &7$7,"圆二色光谱$*U%的测定
将胶原蛋白溶解于 %f <>G0T醋酸溶液中"配
制成质量浓度为 $f% j&% 8, J0溶液"并于 , l平衡 &$ 4 后用于 *U检测 胶原蛋
白溶液及加热至 % l之后的胶原蛋白$明胶%溶液
的圆二色全吸收光谱$&.% g$,% ?<%由 W(S*+
W!&% 圆二色光谱仪测得
&7$7"傅立叶变换红外光谱$\_[Z%的测定
将胶原蛋白溶液和水浴加热至 % l的胶原蛋
白溶液冷冻干燥"得胶原蛋白和变性胶原蛋白$明
胶%干品 然后使用傅立叶变换红外光谱仪进行检
测 红外测试的范围为 ,%% g, %%% C<8&"并以 cYF
为参照
C?结果与讨论
C=E?碱 酶法提取胶原蛋白结果
采用碱溶液预处理和胃蛋白酶提取相结合的
碱 酶提取法从人胎盘中提取胶原蛋白"与已有方法
相比在胶原的酶法提取前增加了碱预处理过程
通过碱对人胎盘的预处理"可以使胎盘中的胶原纤
维充分溶胀分散"有利于下一步酶对纤维的作用"
使提取时间从以前 ,! 4以上降低到 $, 4以内"大大
提高了酶的提取效率)同时碱处理可以降解胎盘中
的油脂和杂蛋白"有利于提高胶原蛋白产品的纯
度 并且"此方法与已有方法相比,,-胶原蛋白产品
的得率较高$表 &%
表 E?胶原蛋白的得率
F5M60E?,265;0/B.06J
胎盘质量0J 胶原质量0J 得率0k
& %%% &f%$ %f&%$
C=C?胶原蛋白的*QA检测
由碱 酶法提取的人胎盘胶原蛋白"制备成胶原
蛋白海绵材料"并使用原子力显微镜对其微观结构
进行观察"结果如图 & 所示 胶原蛋白分子为纤维
状大分子"当其受热时会发生变性"纤维状胶原蛋
白分子会发生解旋变成无规则线团"即胶原蛋白热
变性成明胶 图 & 中明显地显示出胶原蛋白分子的
纤维状结构"说明此胶原蛋白的提取工艺不会使胶
原蛋白变性 而且"还可以看出图 & 中全部为纤维
状蛋白质"即胶原蛋白"说明胶原蛋白的提取工艺
对去除原材料中的杂蛋白是行之有效的"使所得胶
原蛋白产品有较高的纯度
图 E?人胎盘胶原蛋白的*QA图
Q.;=E?*QA .H5;027:265;0/0LG45:G0J
742H-3H5/S965:0/G5
."第 # 期 李德荣等&人胎盘中胶原蛋白的提取和表征
C=@?胶原蛋白的Y!,测试
胶原蛋白分子各单链间由水分子为架桥形成
的氢键和疏水作用对胶原蛋白超螺旋结构的热稳
定性具有巨大的贡献,) 8!- 当对胶原蛋白加热时"
胶原蛋白分子间的氢键和疏水作用被破坏"胶原蛋
白即变性成明胶"而对于胶原蛋白是否变性"US*
是一种很好的测试手段 图 $ 是所提取出的人胎盘
胶原蛋白US*图 由图 $ 可知"胶原蛋白的热变性
温度在 )f! l"这与文献,.-的变性温度很接近"
说明本研究提取的胶原蛋白没有变性"其分子保持
了天然的纤维结构 本实验所得人胎盘胶原蛋白
保持其天然的超螺旋纤维结构"可以用于生物医学
材料
图 C?胶原蛋白的Y!,图
Q.;=C?F0H9045G340J090/J0/:027190:.7.:-05G
:595:.GB $,
9
% 27:265;0/
C=T?胶原蛋白的圆二色光谱测试
对于胶原蛋白的超螺旋结构"*U则有特殊的
吸收"即在$$% ?<左右会有正吸收"在&.! ?<左右
会有一个更强的负吸收 当胶原蛋白完全变性"失
去超螺旋结构后"*U曲线将变得平滑,&%- 图 # 为
胶原蛋白溶液和加热至 % l后的胶原蛋白溶液
$明胶%的*U全吸收图谱
图 @?胶原蛋白溶液在不同温度下的,Y谱$E[D eCTD /H%
Q.;=@?,Y190:G45 27:265;0/1263G.2/5G
J.7040/GG0H9045G340
由图 # 可知"胶原蛋白溶液椭圆率值在$$% ?<
和&.! ?<处有明显的吸收"而加热至 % l后的胶原
蛋白溶液特征吸收峰消失 说明加热至 % l后的
胶原蛋白溶液中的胶原蛋白分子发生变性"而提取
得到的胶原蛋白分子很好地保持了其超螺旋状纤
维结构
C=U?胶原蛋白的傅立叶变换红外光谱测试
图 , 为胶原蛋白和加热至 % l后的胶原蛋白
$明胶%的傅立叶变换红外光谱图
图 T?胶原蛋白和变性胶原$明胶%的傅立叶转换红外图谱
Q.;=T?QF)V190:G45 27:265;0/5/J;065G./
""\_[Z是研究胶原蛋白和变性胶原分子二级结
构的有效工具"它可以直观地显示出胶原蛋白和变
性胶原分子二级结构的变化"而这些变化可以通过
蛋白质红外光谱的酰胺 (带(酰胺 [带$& )#) g&
))& C<
8&
%(酰胺 [带$& ,. g& ! C<8&%和酰胺
[[带$& $%% g& #%% C<8&%的变化而获得 根据前
人的工作"酰胺 (带是由于 /#L的伸缩振动而引
起的)酰胺[带是由于
(
* +的伸缩振动而引起的)
酰胺[带是由于/#L的弯曲振动和*#/的伸缩
振动而引起的 而且对于胶原蛋白"变性会使胶原蛋
白的酰胺(带(酰胺[带(酰胺[带和酰胺[[带强度
降低"并使酰胺 [带的主峰由& ))% C<8&左右变为
& )#% C<
8&,&& 8&#-
由图 , 可以看出"与胶原蛋白相
比"变性胶原蛋白溶液$明胶%酰胺(带(酰胺[带(酰
胺[带和酰胺[[带的强度明显降低)胶原蛋白酰胺
[带的最大吸收值在& ))% C<8&处"而明胶的在
& )#% C<
8&处 由此可知"本工作提取的胶原蛋白没
有变性"其分子保持了天然的超螺旋结构
@?结?论
采用碱 酶提取法从人胎盘中提取胶原蛋白"
即用碱溶液对原料进行预处理"然后使用胃蛋白
酶提取胶原蛋白 结果显示&此方法胶原蛋白的
%) 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
得率高"可以达到 %f&%$k)提取时间由 ,! 4 以上
减少到 $, 4以内 对所得胶原蛋白产品的原子力
显微镜$(\a%(差示扫描量热仪$US*%(圆二色光
谱$*U%和傅立叶变换红外光谱$\_[Z%检测表明"
本工艺路线所得胶原蛋白分子完整地保留了超螺
旋纤维结构"而且产品有较高的纯度"可用作生物
医学材料
参考文献&
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