全 文 ：Aug．2006
·38·
生物加工过程
ChineseJoumalofBioprocessEIl舀neering
第4卷第3期
2006年8月
分子动力学模拟尿素对水溶液中
蛋白质构象转变的影响
张麟，卢滇楠，刘 铮
(清华大学 化学工程系，北京100084)
摘要：采用分子动力学方法和全原子模型研究尿素和水分子对模型蛋白s-肽链结构转化的影响。模拟结果显示
S_肽链的变性速率常数＆值随着尿素浓度的增加而先降低后升高，在尿素浓度为2．9哪ⅢL时达到最低值。模拟了
不同尿素浓度下尿素．肽链、水．肽链以及肽链分子氢键的形成状况。结果表明：尿素浓度较低时，尿素分子与S_肽
链的极性氨基酸侧链形成氢键，但不破坏其分子内的骨架氢键，尿素在s_肽链水化层外形成限制性空间，增强了孓
肽链的稳定性。随着尿素的升高，尿素分子进入s肽链内部并与其内部氨基酸残基形成氢键，导致S．肽链的骨架
氢键丧失，S_肽链发生去折叠。上述模拟结果与文献报道的实验结果一致，从分子水平上揭示了尿素对蛋白质分
子结构变化的影响机制，对于研究和发展蛋白质折叠及稳定化技术具有指导意义。
关键词：S_肽链；分子动力学模拟；尿素；氢键；蛋白质稳定化；蛋白质折叠
中图分类号：0629．73；1叼1936．2l文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2006)03—0038—06
7rhee肌ct0fIlI．翰ontheconfo删唿ti仰alt豫瑚itionofproteinin
aque0吣bymoleclllardy瑚IIlics洲atio璐
Zm埘GHn，LUDiall一nan，UUZheng
(DepanmenIofCheIIlicalE嚼neefing，T8irlgIluaUniversity，Be好堍100084，C}Iim)
A换Ih诅ct：’Ihee珏bctd’ureaandwatermoleculartotlleS—peptideco耐10mlationalnmsitioninnleproteinsaITl—
plewastu捌诚thallatommodelby咖lecuk如锄icsmethod．Thesirnulationsh矧出atwi出岫in-
creaseofureaconcentmtionledto，firstly，areductionandtIlenanincreaseoftheunfbldingmteco璐tant．
rIheIIlinim啪u山ldingmteco璐tantwasIeachedwhentheureae呻cen仃砒ionwas2．9mol／L．nehydmgen
bondbetweenS—p印tideandurea，S—peptideandwater，and埘t}linS—peptidewer_estudied．rnleresults
showedthatatalowconeemmtion0furea，theh灿genbondsbeMeenureaa11dthesidechains0fpolar枷no
acidresiduesg nemtedaureaco征nenlentamundthesuIIke0fS—peptide，舀VinganenhancedstabilitytoS—
peptide．Atahig}lconcentmti咖ofurea，however，t}leintra—molecularhydrogenbondsint11enativeS-peptide
wereovertakenbytIlehydrogenbondsbetweenureaand锄in0acidresidueslocatedatbackboneofpept试e，
leadingtotheu舶ld堍ofS—peptide．rnleresu tsweIesiIIlilart0山atrep0删elsewhere．neH眦hanjsmof
ureatotheproteinco fbm硪硅onal氆msiti硼TeVealedinmol cnlarlevelwasusefhlindevelopmemp∞teinsta—
bilizationandpmteinl-efbldingt￡，c】flnic．
收稿日期：2006—06．16
基金项目：国家自然科学基金(No．20376041)；国家重点基础研究发展规划项目(№．2003cB716004)
作者简介：张麟(1981．)，男，四川内江人，博士生，研究方向：生物化工。
联系人：刘 铮，教授，博士生导师，liu小eng@mail．tsin曲ua．edu．cn
万方数据
2006年8月张麟等：分子动力学模拟尿素对水溶液中蛋白质构象转变的影响 ．39．
一——————————————————————————————————————————————————————————————————————一 一
Keywol也：S。脚tide；m01eculardyllaIllicssimulation；urea；hydIDgenbonds；proteins abilizat岫p硪inf0Id．
ing
研究蛋白质在溶液中的结构变化及其影响因素
是发展蛋白质稳定化和蛋白质折叠等技术的基础。
尿素常用于蛋白质复性，其中高浓度尿素(6。10
啪l，L)用于溶解包涵体，而低浓度尿素(0．5，3
啪l／L)则常作为复性液组成部分，用于稳定蛋白质
及抑制聚集体¨J。watl越r等[21考察了8种碳水化
合物(其中6种是常见氨基酸的侧链)从纯水迁移到
7mol／L尿素溶液过程中的自由能变化，认为尿素对
蛋白质的变性作用缘于高浓度尿素溶液有利于非极
性侧链溶解。近年来提出了多种尿素变性蛋白质的
机理模型，这些模型可分为间接作用和和直接作用
鼹大类。间接作用模型(又称溶剂替换模型)认为尿
素在蛋白质第一水化层富集并能够结合到蛋白表面
的空穴中，这不仅破坏了蛋白质分子周围有序排列
的水分子，而且削弱了蛋白质分子内疏水相互作用，
导致蛋白质变性【3J。而直接机理(又称为结合模型)
则认为尿素与蛋白质内部的氨基酸残基形成氢键，
其与非极性氨基酸形成氢键会将水分子排开从而削
弱蛋白质分子内疏水相互作用。而尿素与极性氨基
酸残基形成氢键要强于水分子，这些因素均导致蛋
白质分子溶胀变性h5|。这些模型部分地得到热力
学限7|，实验聃驯和分子模拟[5，n133的支持，但也还存
在着争议，特别是对于低浓度尿素对蛋白质的稳定
作用的机理尚未达成共识。
采用全原子模型和分子动力学方法，以S．多肽
作为模型蛋白质，考察尿素浓度对其结构变化速率
的影响；模拟了尿素分子、水分子与s一肽链分子间
的相互作用对蛋白质构象转化的影响，以求从分子
水平阐明尿素对蛋白质稳定化和变性的作用机理；
最后将模拟结果与文献报道的实验结果进行比较以
检验上述分子模拟结果的正确性。
1模型与方法
1．1蛋白质模型
采用s．肽链作为模型蛋白，s．肽链是Rib0肌cle．
aseA(R．NaseA，PDB编号为7RsA)中的1—19氨基
酸，序列为KETAAAⅪ砸RQHMDS溺A，含有6个非
极性残基，6个不带电荷的极性残基，4个带正电荷
的残基和3个带负电荷的残基(pH=7)。该序列的
第4—11个残基构成一个a螺旋。天然S．肽链共含
8个氢键，结构如图1所示。
圈1 S-肽链的天然结构采用RASMOIjl41软件绘制
F’ig．1nen以VestnJctureofS_pepfidegureis
prepared、vitIl龇pmgmmRAsM0“川
1．2溶剂模型
水分子采用sPC模型，溶剂化效应参照文献
[15]处理。尿素采用软件GroHms设定参数。
1．3模拟方法
S．肽链采用全原子模型，其三维结构从PDB数
据库获得。模拟体系为3．774啪×5．372脚×
3．367nm的长方体盒子，在z，y，z3个方向上均使
用周期性边界条件，内含1个S．肽链及相应质量浓
度的溶剂分子，对应实际S．肽链质量浓度为51．O
IIlg／mL。
采用GROMACS3．1．4¨¨73软件进行分子动力学
模拟，力场为a的MOS9643a1(officiald stdbution)。
用N、，r11系综，BeI℃ndsen法控温，时间常数为0．1ps。
积分方法为半步蛙跳法，积分时间步长为0．002ps。
相邻原子列表截断，L『势能截断距离均为1．O砌，
库仑力截断为1．4砌。考察温度为400K时，尿素
浓度分别为0，0．8，1．5，2．9，4．1，6．0nlol，L条件下的
S一肽链的变性过程，从7个不同的初始构象出发，模
拟运行1000ps。
计算机配置为：IJenovoR510，Intel‰n3．2G
CPU，1．0GRAM，R-edHatLinuxES3．0￡DrEM64T。
1．4分析方法
采用变性动力学常数露、氢键和径向分布函数
(碰坍)来表征尿素对s．肽链结构的影响。s．肽链变
性的判据：将S一肽链中a一螺旋完全消失的状态定义
为变性，其所对应的时间为该初始构象条件下的变
性时间。不同初始构象具有不同的变性时间，其分
万方数据
·40· 生物加工过程 第4卷第3期
布反应了S．肽链在该温度和溶剂环境条件下的变
性动力学特性。
变性动力学常数后：将s．肽链变性示为一级动
力学过程，根据公式(1—3)拟合变性动力学曲
线㈨。
掣：后[Ⅳ]击 一“L”1
[u]+[Ⅳ]=[Ⅳ]。
厂：牌：1-e_缸o_[J7、r]。_1-e
(1)
(2)
(3)
其中[u]和[Ⅳ]分别为特定时刻变性和天然S一
肽链的数目，[Ⅳ]。为初始天然蛋白的数目，．厂为特定
时刻S一肽链的变性分率，矗为变性动力学常数，后值
越低，表明s．肽链变性速率越快，即越不稳定。
氢键分析：当给体原子D，如OH中的。原子和
NH中的N原子，与受体原子A，如O原子和N原子
间距离小于O．35啪，且H-D—A间夹角小于600时，
认为给体原子D和受体原子A之间形成氢键。
径向分布函数(皿坍)：分别计算水分子、尿素分
子和S．肽链氨基酸残基相对于s一肽链质心的径向
分布函数，以描述它们的空间分布情况。
2结果和讨论
2．1尿素浓度对S．肽链稳定性的影响
首先考察了r=400K时，尿素浓度对s．肽链变
性动力学常数是的影响。在该温度条件下，在模拟
时间范围内，各个尿素浓度条件下S．肽链均发生变
性，结果如图2所示。
O．9
O．8
— 0．7
t∞
4
0．6
O．5
O．4
cu。，(mol／L)
图2尿素浓度对S-肽链去折叠速率(南)的影响
Fig．2rIherelali帆sIlipbetweenu山ld崦mteof
s-peptide(＆)趴dureaconce曲嘶on
图2显示s．肽链的变性速率常数(七)随着尿素
浓度的增加而先降低后升高，在尿素浓度为29mol／L
时达到最低值，表明低浓度尿素可增强S．肽的稳定
性，而离浓度尿素则加速其变性。在蛋白质复性实
验中，常以6一10mol，L浓度的尿素作为变性剂，而
以0．5—3．0mol，L尿素作为复性剂添加剂[1]。Bhuv．
an等¨副的实验表明，添加4。5mol／L的尿素能提高
亚铁细胞色素c的结构稳定性，而高于5．0mol／L的
尿素则导致亚铁细胞色素c变性。图2所示的分子
模拟定性地再现了上述实验结果。
2．2尿素与S一肽链间氢键相互作用分析
为了从微观尺度描述尿素稳定和失稳蛋白的机
理，分别考察400K时s．肽链分子内氢键和s一肽链．
尿素间氢键数随尿素浓度的变化，结果如图3所示。
己
口
薹
皂
砉
主
c一“mol／L)
一●一PU：一u—PP
图3尿素浓度对§肽链一尿素间和s_肽链分子内氢键数
的影响
Fig．3弧ehydrogenbo d眦lbersvary船矗lnclion
ofuI℃aconcentIation
图3显示随着尿素浓度增加，S一肽链．尿素氢键
数增加，而S一肽链分子内氢键数则减少，这表明尿
素竞争性结合s．肽链内的氢键位点。当尿素浓度
高于3．0mol，L时，尿素分子与S．肽链形成氢键造成
其去折叠，与高浓度尿素导致蛋白质的直接作用模
型(结合模型)相符[4]。
2．3尿素和水分子的空间分布
分别考察了1．5和6．0md，L尿素条件下，水分
子和尿素分子相对于s一肽链质心的径向分布函数
(R卯)，结果如图4所示。
图4(a)显示，当溶液中的尿素浓度为1．5mol，L
时，S一肽链周围水分子富集在厚度为0．1—0．4啪的
盘山qco声}{-o_I占—ll罩Z
万方数据
2006年8月张麟等：分子动力学模拟尿素对水溶液中蛋白质构象转变的影响 ．41．
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(a)1，5moI／L尿素 (b)6．0mo儿尿素
图4尿素浓度对尿素和水分子径向分布函数的影响
Fig．4RD_F’ofureaandw刮盼moleaulesat出艉砌谴ureaconcenlra虹伽
范围内，而尿素分子则在O．5一1．o砌区间内富集，
表明此时尿素在s．肽链表面富集而稳定s．肽链。
图4(b)显示，当尿素浓度为6．0mol／L时，S．肽链表
面水化层依然存在，但是水分子分布前沿已从
0．094啪处移至0．127啪，尿素则分布在0．16～
o．60砌范围内，表明此时尿素渗透进入s．肽链的
内部，破坏水分子与S。肽链的相互作用，不利于多
肽的稳定。
表l给出了不同尿素浓度条件下，s．肽链、尿素
和水分子氢键以及与S．肽链相关的总氢键数。结
果表明，当溶液中不含尿素时，s．肽链上的氢键由两
部分组成：肽链分子内氢键和S一肽链一水分子氢键。
当溶液中尿素浓度为1．5mol，L时，尿素对S一肽链分
子内氢键和s．肽链总氢键数基本没有影响，但s_肽
链．尿素分子氢键数增加同时s．肽链一水分子氢键数
降低。结合图4(a)可知，此时尿素分子置换了s一肽
链表层的水分子，但不影响s．肽链分子内氢键和疏
水相互作用，由此提高了其稳定性。而6．0r加l，L尿
素则显著降低s．肽链分子内氢键数和s．肽链一水分
子间氢键数，同时显著增加孓肽链一尿素分子间氢键
数和总氢键数。结合图4(b)可知，此时尿素渗透入
S．肽链内部，在置换S．肽链．水分子间氢键的同时，
也竞争结合维系s．肽链天然结构的骨架氢键，从而
破坏s．肽链的结构。
表l尿素浓度对体系氯键数统计平均的影响
醌“e1 S眦isticalav哪ge0fhydrogenbo dn咖1l埘
atib缸br{emconcentIationofuI船
2．4尿素对S．肽链结构影响的微观分析
统计了尿素分子和水分子与s．肽链不同氨基
酸残基间形成氢键的分布，结果如图5所示。
图5(a)和(b)显示：当尿素浓度低于1．5H加d，L
时，水分子与所有氨基酸的骨架以及极性氨基酸
(Lysl，Glu2，nr3，L移S7，Glu9，A玛10，Glnll，Hisl2，
Aspl4，serl5，Serl6，既r17，serl8)的侧链均形成氢键。
而尿素分子仅与部分极性氨基酸侧链形成少量氢
键，且尿素。氨基酸骨架氢键数目远低于水．氨基酸
骨架间氢键数目。图5(c)和(d)显示，当尿素浓度
为6。0瑚1，L时，水分子与氨基酸骨架以及极性氨基
酸侧链形成氢键的数目降低，而尿素分子与孓肽链
氨基酸骨架和极性氨基酸侧链形成氢键的数目增
加，且尿素．氨基酸骨架间氢键数目明显高于水．氨
基酸骨架氢键数目。
上述结果表明，当溶液中尿素浓度较低时，尿素
万方数据
·42· 生物加工过程 第4卷第3期
”
2 4 6 8 lO 12 14 16 18
ReSidues
(a)J．5mrd／L尿索条件下孓肽链一尿素分子问氢键数
2 4 6 8 lO 12 14 16 18
Residues
(r)6』)mol／L尿素条件下s一肽链一尿素分子问氢键数
—一BackbOne
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Residues
m)1．5m01／L尿素条件下s一肽链一水分子问氢键数
8
7
6
5
4
3
2
1
0
2 4 6 8 10 12 14 16 18
Residues
(d)6．《Jmol／L尿素条件下s一肽链一水分子间氢键数
口Sidechain
图5不同尿素浓度下体系氢键的统计分析
Fig．5吼惦sticalanalysisofhydIDgenbo ds砒di如remureac嘶cenⅡ埘on
对s．肽链的表面水合和s．肽链内部氢键无破坏，且
尿素分子与极性氨基酸侧链结合而提高肽链的稳定
性。当尿素较高时则会造成s．肽链表面水合程度
降低而削弱疏水相互作用，尿素竞争性结合s．肽链
骨架氢键位点而造成其结构的破坏。
2．5尿素对S．肽链稳定／变性作用的机理分析
根据上述分子模拟分析以及文献报道的实验结
果，提出尿素影响s。肽链结构的机理，如图6所示，
其中蛋白质构象为天然态s．肽链，尿素分子分布以
a螺旋开始变化时为准。
当尿素浓度较低时，尿素分子不会破坏S．肽链分
子内氢键和维系肽链结构稳定所必需的S．肽链一水
分子氢键，而是与S．肽链表面的极性氨基酸侧链形成
氢键，从而起到稳定肽链结构的作用，如图6(a)所示。
而当尿素浓度较高时，尿素可以渗透到S．肽链核
心内部(图4(b))，此时，尿素不仅破坏了s．肽链水化
层及其分子内疏水相互作用；而且尿素分子与S．肽链
氨基酸骨架形成氢键(图5(c))并破坏维系肽链二级
结构的氢键，导致s．肽链变性，如图6(b)所示。
图6尿素对蛋白质影响机理分析采用RAsMOL【191软件绘翩
Fig．6rnlemech撕smofurea豳ctonpmteinw鹊剐dwit}l‰呻乎砌MOLMOL[191
8
7
6
5
4
3
2，
0
．1皇911口口L10q口o∞。Jp^工
4
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2
●
-占岛誊口勺IIoq
8∞。Jph|I
．13qgrI口勺L【0q口。吐ojp^工
4
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2
l
O
．I岩gTl目puoq蠹暑oJph}{
万方数据
2006年8月张麟等：分子动力学模拟尿素对水溶液中蛋白质构象转变的影响 ．43．
3结论
以S．肽链为模型蛋白，采用全原子模型和分子
动力学方法研究尿素浓度对模型蛋白结构的影响及
其机理。结果表明，s．肽链的变性速率常数后值随
着尿素浓度的增加而先降低后升高。对尿素．肽链、
水一肽链及肽链内部氢键的计算分析表明：当尿素浓
度较低时，尿素可与s．肽链上的氨基酸残基形成氢
键，围绕多肽形成尿素限制性空间并稳定孓肽链。
而当尿素浓度较高时，尿素可竞争性地结合S．肽链
分子内氢键而导致s一肽链变性。上述分子模拟结
果与文献报道的实验结果一致，表明上述分子模拟
结果的正确性，这对于发展新型蛋白质稳定和蛋白
质复性技术具有指导意义。
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