全 文 ：第6卷第1期
2008年1月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Jan．2008
· 5l ·
耦合培养对紫杉醇产量的影响
程 龙1，一，张 梁2，陶文沂2，陶冠军3，周红，张兰芳
(1．无锡卫生高等职业技术学校，无锡214028；2．江南大学生物工程学院，无锡214122；
3．江南大学分析测试中心，无锡214122)
摘要：以美丽镰刀茵和东北红豆杉细胞为实验材料，通过耦舍式生物反应器进行耦合培养，以紫杉醇作为研究指
标，研究内共生真茵与宿主植物细胞的的关系。经耦合培养，两种细胞的紫杉醇产量均有不同程度的提高，美丽镰
刀茵达29倍，相应的东北红豆杉悬浮细胞增加了3．5倍。
关键词：耦合培养；美丽镰刀茵；紫杉醇；东北红豆杉
中图分类号：Q813．1+l 文献标识码：A 文章编号：1672-3678(2008)01-0051-05
Theffectsofcouplingcultivationonthepaclitaxelyield3
CHENGLon91”，ZHANGtaand，TAOWen．yi2，TAOGuan-jun3，ZHOUHon91，ZHANGLan．fan91
(1．WuxiHigherHeahhVocationalTechnologySchool，Wuxi214028，China；
2．BiologicalEngineeringInstitute，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China； ，
3．Analysis＆TestCenter，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：TostudytherelationshipbetweenndosymbiosisfungiandthehostplantceHsbyobservingthe
Paclitaxelyieldthroughthecouplingcultivationintheindependentlysignedcouplingbioreactorwith
thematerialofFusariummaireiandceHsofTaxuscuspidate．ThepaclitaxelyieldofFusariummaireiand
Taxuscuspidatacellinesincreased29timesand3．5timeswiththecouplingcultivation，respectively．
Keywords：couplingcu tivation；Fusariummairei；paclitaxel；Taxuscuspid ta
1993年，Stierle等⋯首次从短叶紫杉(Taxus
brevifolia)的韧皮部中分离出一种新的内共生真菌
Taxomycesandreanae，可在半合成培养液中产生紫杉
醇和紫杉烷类化合物，表明有的内共生真菌具有合
成和宿主植物相同或相似的活性成分的能力，这一
发现为用微生物发酵法生产紫杉醇以解决紫杉醇
药源危机提供了一条新途径。
内共生真菌和宿主植物的相互作用机理，是一个
值得深入探究的课题。一般认为，植物与内共生真菌
呈互利共生的关系：一方面内共生真菌可以从宿主植
物中吸取营养，并得到保护；另一方面内共生真菌产
生的代谢物，能够促进宿主植物生长发育，增强宿主
植物对生物胁迫(食草动物、昆虫、病原菌)及非生物
胁迫(高温、干旱、高盐等)的抗逆性。
文献[2]研究表明，在病原侵染后，植物细胞可
能通过其表面或胞内的受体识别病原体产生的激
发子(elicitors)信号，来启动一系列由多组分参与的
防御反应。但植物激素能否对内共生真菌产生作
用和其作用机理目前知之甚少。
为此，利用自行设计制造的耦合式生物反应器
(图1)对Emairei和Taxuscuspidata植物悬浮细胞
进行耦合培养，以期在植物提取药物的现代化研
收稿日期：2007-07-23
基金项目：国家自然科学基金资助项目(30470016)；国家863重点基金资助项目(2flOTAA021501)；江苏省自然科学基金资助项目(m囝吣70篮)
作者简介：程龙(1964一)，男，江苏常熟人，副教授，博士，研究方向：生物制药，E-mail：samchel2008@yahoo．com．cn
万方数据
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究，特别是对珍稀濒危天然植物药物的生产研究上
形成新的研究方向。
美丽
镰刀
图1耦合式生物反应器原理图
Fig．1Basiccircuitofcouplingbioreaetor
豆衫
本耦合式生物反应器是将两个相同的通气搅
拌式生物反应器通过O．22mm微孔膜进行分隔、耦
合，组成一个能使全部物质发生通透而不同细胞间
不能互相接触的耦合生物反应系统。
以紫杉醇产量为最终检测指标，通过HPLC／
MS，检测耦合培养过程中的物质变化。
研究发现：植物激素氯化氯胆碱对Fusarium
mairei产紫杉醇有抑制作用而赤霉酸无任何作用。
1材料与方法
1．1材料
美丽镰刀菌(F瓣adummairei，国家发明专利
ZL20051 038424．8)，本实验室保藏；
东北红豆杉(Taxuscuspidata)植物细胞蒙天津
大学元英进教授惠赠。
1．2仪器、试剂和培养基
耦合式生物反应器(国家发明专利
ZL200410014227．8)；生物反应器(Biotech-2001，上
海保兴生物设备工程有限公司)；生物反应器(Bio．
Tron-7，BioengineeringAGCH)；HPLC／MS(Platform
ZMD4000，WATERS)；MasslynxV4．0SP4(Mi—
clolnassLtd．)。
Paclitaxel标准品(97％，HPLC)购自Sigma公
司，其余试剂均为分析纯。
MS液体培养基。
1．3方法
用普通通气搅拌式生物反应器对Fmairei进
行培养、普通通气搅拌式生物反应器对Zcuspidata
悬浮细胞进行培养、耦合式生物反应器对只mairei
和zcuspidata进行耦合培养，分别比较其中间产物
的变化和最终紫杉醇的产量。
1．3．1 Zcuspidata悬浮细胞单独培养优化
以MS为基本培养基进行优化，得较优配比为：
装液量体积分数60％，搅拌转速50r／min，25℃，通
气量0．3vvm；接种量体积分数10％；并根据其生长
情况进行流加补糖，随时调整pH5．8，适时消泡。
自动检测、记录罐温、pH、溶氧，培养液每24h
取样检测糖并取样进行HPLC／MS全扫描检测，测
定紫杉醇量及相关化合物含量；培养结束时检测残
糖、生物量；HPLC／MS全扫描检测总紫杉醇量和提
取液中的总物质。
1．3．2Fmairei单独培养优化
根据耦合培养要求，E mairei培养应采用z
cuspidata相同的培养基，经优化采用装液量60％，
搅拌转速250r／min，25℃，通气量1vvm，接种量
3％；并根据其生长情况进行流加补糖，随时调整pH
5．8，适时消泡。
检测同1．3．1。
1．3．3耦合培养
在耦合式生物反应器两个部分分别培养F
mairei和zcuspidata悬浮细胞。两者同为MS培养
基，装液量均为60％，搅拌转速Emairei250r／
min、zcuspidate50r／rain，25℃，通气量分别为1
v啪和O．3wm；接种量zcuspidata悬浮细胞体积
分数10％，Fmairei体积分数3％；并根据其生长
情况进行流加补糖，随时调整pH5．8，适时消泡。
检测同1．3．1。
2 结 果
2．1 两种细胞单独培养优化
zcuspidata悬浮细胞培养7d，紫杉醇质量浓
度12．05ms／L；Fmairei培养7d，紫杉醇质量浓度
5．64ms／L。
2．2耦合培养紫杉醇的产量变化
耦合培养7d，紫杉醇质量浓度分别为只
mairei165．74ms／L、Zcuspidata悬浮细胞41．73
mg／L，均较单独培养有所增加。但从增加的倍数来
万方数据
2008年1月 程龙等：耦合培养对紫杉醇产量的影响 · 53·
看，显然Fmairei要大得多，达29倍，相应的z
cuspidata悬浮细胞增加了3．5倍。
2．3耦合培养Emairei培养液中紫杉醇的产量变化
耦合培养过程中，经过两种细胞间的相互作
用，Pmairei培养液紫杉醇产量有明显的增加；特别
是到第7天，培养液中紫杉醇产量较前一日猛增23
倍(图2)。
6
堂4
×
器
值
暂2
O
4 5 6 7
时间，d
图2耦合培养时Emeirai培养液中紫杉醇含量的变化
Fig．2Thechangetrendoftaxolyieldinthebrothby
couplingculturef om4血一7山day
2．4耦合培养中其他物质的变化
耦合培养中，发现一些物质在培养过程中出现
较大的变化，HPLC／MS全扫描图显示，单独培养时
两种细胞有独自的代谢物质(图3)，但在耦合培养
时，两者的代谢物逐渐趋同(图4)。
再比较只ma／re／在耦合培养4-7d的HPLC／MS
全扫描图(图5)，我们能看到，第4—6天，其I-IPLC／MS
全扫描图只是峰高出现变化，峰形基本不变，提示培养
液中的物质组成基本不变，只是量发生了改变；但到了
第7天，HPLC／MS全扫描图峰形发生了巨大变化，提
示此时的培养液中的物质组成已发生了极大的变化，
这样的改变只能是两种细胞相互作用的结果。
对于具体物质的变化也有相似的提示：(1)
HPLC／MS全扫描图中约18．6min处的m／z=738
的物质量持续极大地增加了近40倍；(2)HPLC／
MS全扫描图中约12．6rain处的m／z=426．7的物
质从少到多，到第5天达最高，然后逐步减少，于第
7天消失；(3)HPLC／MS全扫描图中约12．75min
处的m／z=664的物质在不断减少，至第7天消失
(图略)。所有这些，均提示在两种细胞进行耦合培
养时，它们的相互作用直接影响各自的代谢，并逐
步趋向一致，达到共生。
0 5 lO 15 35
0 5 10 15 35
图3 Emairei和植物细胞单独培养7d时的HPI_ffJMS全扫描图
Fig．3I-IPLC／MSfull．$ca／1mapofbrothofF．maireiandZcuspidamcellinsolo．culturea 7山day
万方数据
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0 5 lO 15 20 25 30 35
t／min
- 21．91
0 5 10 15 20 25 30 35
t／min
图4耦合培养7d时两种细胞的HPLC／MS全扫描图
Fig．4HPLC／MSfull-scanmapofbrothof只maireiandZcu,pidatacellincouplingcultureat7血chy
0 5
6d
15 20 25 30 35
14．39
0 5 10 15 20 25 30 35
O 5 lO
1．15
20 25 30 35
0 5 10 15 20 25 30 35
tlnfm
圈5只mairei在耦合培养4～7d的HPLC／MS全扫描图
Fig．5HPIF_．／MSfull。$c缸mapofbrothofEmaireiincouplingculturef om4出to7thday
万方数据
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3讨论
3．1紫杉醇的产量
紫杉醇作为一种抗生素，其作用原理是通过诱
导、促进微管蛋白的聚合，防止解聚，稳定微管，导
致细胞在有丝分裂时不能形成纺锤体和纺锤丝，使
染色体分离失败，抑制了细胞分裂和增殖而产生抗
肿瘤作用。在自然环境下，紫杉醇更是一种生物
“防卫素”，起着抵御外界生物侵入的作用，因此，可
以设想，在耦合培养时，两种细胞的紫杉醇含量均
应较单独培养时有所提高，实验已证实了这一点。
3．2紫杉醇的外泌
实验中发现，在单独培养时，Emairei所产的紫
杉醇少量(约1／3)存在于胞外，大量的(2／3)存在
于胞内。从理论上分析，紫杉醇作为一种抗生素，
在遇到外界刺激因子时，细胞应外泌紫杉醇以消除
外界的生物影响，通过实验证实了这一点，培养至
第7天，外泌的紫杉醇比胞内水平更高，此时外泌的
紫杉醇超过了总量的70％。
3．3两种细胞的共生关系
从耦合培养能够进行不难看出，本文中内共生
真菌Fmairei和植物细胞的关系应如Honegger【3J
所言的第一种或第三种情况，即内共生真菌可以不
以吸器插入宿主细胞内而达到共生。并从E
mairei能离开植物细胞独立生长来看，第一种情况
的可能性更大。
3．4两种细胞的相互作用
由于在耦合培养的起始阶段(1—3d)，植物细
胞浓度较大，而此时两种细胞的HPLC／MS图较单
独培养时未见有明显的变化，提示该Fmairei与植
物细胞的相互作用(“免疫”反应)是由内共生真菌
的生长而分泌的信号物质，从而引发了一系列的连
锁反应，从而导致各自的正常代谢途径发生改变，
反映在HPLC／MS图上，就出现了4～6d时的
HPLC／MS全扫描图信号的巨大改变。这些物质是
生物毒素还是激发子(elicitors)或是其他类型的物
质有待深入研究，但是可与兰文智等Mo的结果相互
佐证。
由于耦合培养的两种细胞原就是以内共生的
形式存在，在“免疫”反应的过程中，两者将达到一
种“妥协”，此时，两种细胞将出现真正的“共生”局
面。此推论与邹文欣等"1的推论较为接近。
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[5]邹文欣，谭仁祥．植物内共生真菌的研究新进展[J]．植物学
报，2001，钙(9)：881-892．
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