全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
6;CE@G@SDK2E3JDF/CDA2DL@GG^ E4CE@@2CE4
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IDC"&%>(5 7`>CGGE>&5*$ ?(5*!>$%&%>%#>%%!
收稿日期"$%&% ?%# ?%#
基金项目"国家重点基础研究发展计划#*( 计划$资助项目#$%%*6/*%*!%.&$%%6/*$.*%($)国家自然科学基金资助项目#$%%5%%($
作者简介"王晨飞#&!.%$&女&浙江新昌人&硕士研究生&研究方向"微生物基因工程及代谢调控)谭天伟#联系人$&教授& 1^M3CJ" B3EBNfM3CJ>
9KLB>@IK>LE
丙酸梭菌简易培养及电转化方法
王晨飞&王凤寰&田平芳&谭天伟
#北京化工大学 生命科学与技术学院&北京市生物加工过程重点实验室&北京 &%%%$$
摘"要"建立了一种简易的丙酸梭菌#速有效 基于输液瓶蜡封法&采用电击缓冲液 <^/&结合 %h%( 47MZ维生素6的方法&通过对不同对数生长期的菌
体细胞进行实验&在无需借助厌氧培养箱的条件下&成功地将外源质粒 AQS&%(#( $!( 9A$转化丙酸梭菌&结果表明
处于对数生长中期#&! ;$的丙酸梭菌细胞最适宜用于电转化 该研究为严格厌氧微生物的培养提供了一种普适
的方法&并且为丙酸梭菌的分子生物学操作奠定了一定的基础
关键词"厌氧培养)丙酸梭菌)电转化)对数生长期
中图分类号"8!&$)8!&(>& o&""""文献标志码"P""""文章编号"&5*$ ?(5*!#$%&%$%# ?%%(# ?%.
,36F3405/I060:F429245F.2/27=/&+7"##0)-"&-#&1#$0)
TP,Q6;@E1F@C&TP,Q)@E41;K3E&Y_P,
/@C`CE4XEC[@2GCBHDF6;@MCL3JY@L;EDJD4H&/@C`CE4&%%%$&6;CE3$
*H1F45:F"PM@B;DI FD2B;@3E3@2D9CLLKJBK2@DFN3G@GB39JCG;@I>XGCE4B;@M@B;DI 3EI <^/@J@LB2DAD23BCDE9KF@2LDEB3CECE4%h%( 47MZDF[CB3MCE 6&
@VD4@E@DKGAJ3GMCI AQS&%( #( $!( 9A$ N3GGKLL@GGFKJHCEB2DIKL@I CEBD<>-"&-#&1#$0)CE ICF@2@EBJD41
32CB;MA;3G@GCEI@A@EI@EBDF3BMDGA;@2@L;3M9@2>_BN3GFDKEI B;3BB;@GB23CE CE JD432CB;MMCI1A;3G@
#&! ;$ N3GMDGBGKCB39J@FD2B23EGFD2M3BCDE>Y;@GBKIHA2D[CI@I B;@93GCGFD2B;@FD2B;LDMCE42@G@32L; DE
B;@MDJ@LKJ32M3ECAKJ3BCDE DF<>-"&-#&1#$0)>
L0G K24I1"3E3@2D9CLLKJBK2@)""丙烯酸是一种重要的化工原料&广泛应用于涂
料(化纤(纺织等行业 随着化石燃料资源的日益
枯竭&依赖于石油资源的各种化学品价格日趋上
升&丙烯酸即是其中一种*&+ 因此&目前用可再生
生物原料制取丙烯酸受到了广泛关注*$ ?(+ 丙酸梭
菌*.+ #一直未得到深入研究与广泛应用&但由于其具有与
丙烯酸生物合成相关的特殊代谢途径*#+ &在生物法
制取丙烯酸方面受到特别关注 丙酸梭菌为专性
厌氧梭状芽孢杆菌&生长后期形成芽孢&其培养和
电转化均需借助厌氧培养箱等设备&操作过程十分
繁琐 另外&丙酸梭菌是革兰氏阳性菌&细胞壁较
厚&到目前为止&尚未有关于丙酸梭菌电转化方法
的相关报道
""本研究建立一种简易的厌氧培养方法%%%输
液瓶蜡封法&以确立基于该培养方法的丙酸梭菌电
转化可行条件&较大程度上简化丙酸梭菌的培养和
遗传转化工作&为利用丙酸梭菌生产生物基丙烯酸
提供一定的基础数据和工艺
C?材料与方法
CMC?实验材料
&h&h&"菌株
""丙酸梭菌#<>-"&-#&1#$0)$购买于 PY66#美国
标准保藏中心$&编号为 $##$$
&h&h$"培养基及缓冲液
""&$梭菌强化培养基#47Z$" 牛肉蛋白胨 &%&牛
肉膏 &%&酵母粉 (&?I 丙氨酸 (&半胱氨酸盐酸盐
%h#&可溶性淀粉 &&刃天青 %h%(&,36J(&乙酸钠 (
,3-+调 A+至 *h%
""$$复苏培养基 #& Z$"蛋白胨 &% 4&牛肉膏
&% 4&酵母粉 # 4&c
$
+<-
.
$ 4&柠檬酸三铵 $ 4&
吐温?$! %h& MZ&,3PL# 4&b40-
.
%h# 4&bE0-
.
%h$# 4&?I 丙氨酸 ( 4 用,3-+调 A+至 *h%
""($电击缓冲液#<^/$"%h# MDJ7Z蔗糖&%h# MMDJ7Z
b46J
$
&& MMDJ7ZA+*h. ,3
(
<-
.
缓冲液
&h&h("主要仪器
""$#% MZ输液瓶#徐州天一玻璃制品有限公司$&
冷冻离心机# A^A@EIDF公司$&电转化仪#/CD1W@I 公
司$
CMA?实验方法
&h$h&"输液瓶蜡封法%%%厌氧简易培养法
""在$#% MZ输液瓶中加入&%% MZ梭菌强化培养
基&由于-
$
指示剂刃天青*5+的存在&培养基呈紫红
色 将培养基加热煮沸去除溶氧&此时刃天青由红
色变为无色&同时培养基由紫红色变为淡黄色 立
即向去除溶氧的培养基中通入高纯,
$
&使培养基在
快速降温的同时始终维持黄色无氧状态 培养基
温度降至室温时&加大 ,
$
流速&增加输液瓶中 ,
$
分压&约(% G后快速拔出 ,
$
管并立即用输液瓶配套
丁基胶塞封住瓶口 最后用纱布和线绳加固瓶塞&
使其在高温灭菌中不会迸出而脱离瓶体 进行接
种操作时&用注射剂直接扎入丁基胶塞&将种子液
注射到培养基中 接种完后&立即用蜡烛熔化的蜡
液对针孔进行蜡封处理&使瓶内厌氧环境得以维持
#下文中所有丙酸梭菌的培养均采用该方法$
&h$h$"丙酸梭菌孢子悬浮液的形成
""将丙酸梭菌培养物置于. i环境中&* I后菌体
转化为孢子悬浮液*.+ &在输液瓶中可保藏 5 j!
个月
&h$h("丙酸梭菌芽孢的萌发和培养
""对丙酸梭菌芽孢采用热激的处理方式&为芽孢
萌发提供能量 将接入丙酸梭菌孢子悬浮液的培
养基立即置于*% i水浴中&热激&% MCE**+ &然后迅
速使其降至室温&并在(* i中静置培养
&h$h."丙酸梭菌生长曲线的测定
""将丙酸梭菌由孢子悬浮液起&活化两代&按体
积分数 &g#下同$接菌量接入梭菌强化培养基中&
(* i静置培养&前期每$ ;取一次菌液测 H?
5%%
&到
达对数生长期每小时测样一次 以吸光度为纵坐
标&培养时间为横坐标&绘制生长曲线
&h$h#"丙酸梭菌感受态细胞的简易制备
""将活化后的丙酸梭菌按 &g接菌量接入梭菌强
化培养基中&分别取不同对数生长期#前(中和后
期$菌液各(% MZ&同时向菌液中加入已过滤除菌的
维生素6#d
6
$水溶液&其终质量浓度为%h%( 47MZ
菌液冰浴 &% MCE后&低温 . i( . %%% 27MCE离心
&% MCE收集菌体&再用预冷的添加 d
6
#终质量浓度
为%h%( 47MZ$的 <^/溶液悬浮洗涤菌体 ( 次&将洗
涤后的菌体用$%%
#
Z含 d
6
的 <^/溶液重悬&分装
并立即用于电转化实验或冻存于?!% i备用
&h$h5"丙酸梭菌的电转化实验
""取$
#
Z外源质粒 AQS&%(#带氯霉素抗性&质量
浓度约为$%%
#
47
#
Z$&加入&%%
#
Z丙酸梭菌感受态
细胞&混匀后冰上放置&% MCE&按下列方案进行电转
化实验"
""&$不同电击缓冲液的电转化"用含 d
6
的 <^/
溶液和不含d
6
的 <^/溶液分别制备对数生长期中
期的丙酸梭菌感受态细胞&在恒定电压$h# ad和时
间# MG条件下进行电转化实验
""$$不同对数生长期的电转化"将 AQS&%( 分别
与对数生长初(中和后期的丙酸梭菌感受态细胞混
匀后&在恒定电压$h# ad和时间# MG条件下进行电
转化实验
""将转化后的细胞转移到装有# MZ复苏培养基
的厌氧管中&(* i静置复苏& ;&用注射器将复苏的
细胞转移到装有&%% MZ梭菌强化培养基的输液瓶
中&同时向瓶中加入终质量浓度为&*
#
47MZ的氯霉
素&(* i静置培养
&h$h*"丙酸梭菌转化子质粒的酶切鉴定
""&$丙酸梭菌质粒的提取"取 (% MZ在氯霉素抗
性下得到的丙酸梭菌培养物&用质粒提取试剂盒
5( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
#博迈德生物技术有限公司$提取质粒
""$$质粒的酶切鉴定"将提取得到的质粒进行
G$&W_单酶切&凝胶电泳鉴定质粒大小
A?结果与讨论
AMC?输液瓶蜡封法
""刃天青为无毒害 -
$
指示剂&可与 -
$
进行可逆
结合&通过其颜色变化可直观表明培养基是否含
氧 制备无氧培养基过程中&培养基由最初的紫红
色含氧状态&经过煮沸除氧&变为淡黄色无氧状态&
在通,
$
降温驱氧和高温灭菌过程中该状态得到维
持 使用注射器对培养基进行接种的过程中&针孔
的存在可导致输液瓶内的无氧环境的改变&用熔化
的蜡液对针孔进行及时密封&可使瓶内无氧状态在
接种后得以长期维持 采用输液瓶蜡封法成功培
养得到大量丙酸梭菌菌体&较传统采用厌氧箱进行
厌氧培养工作更具高效性和简捷性 输液瓶蜡封
法与常规厌氧培养方法的比较&如表 & 所示
表 C?厌氧培养方法的比较
D5H60C?,2J954.12/27I.7040/F5/5042H.::36F340J0F-2I1
厌氧培
养方法 特点 优缺点比较
输液瓶
蜡封法
使用刃天青作为 -
$
指示剂&不需借助除
氧剂除氧&用于专性
厌氧菌的培养
操作简单&费用少&可
用于 &%% j$%% MZ规
模的厌氧培养
厌氧箱
培养法
用于专性厌氧菌的
培养和其他操作
操作繁琐&费用高&可
用于一切厌氧操作
厌氧管
培养法
用于专性厌氧菌的
培养
操作简单&仅适用于
&% MZ规 模 的 厌 氧
培养
大管套
小管法*!+
使用焦性没食子酸
作为除氧剂&用于专
性厌氧菌的培养
操作简单&仅适用于
&% MZ规 模 的 厌 氧
培养
AMA?丙酸梭菌生长曲线
""丙酸梭菌生长曲线如图 & 所示 由图 & 可知"
丙酸梭菌菌体细胞生长周期约为.% ;&经过 ;的延
迟期进入对数生长期&(% ;后细胞进入衰退期&因此
对数生长期的前(中和后期约为接种后的 &.(&! 和
$. ; 另外&绘制生长曲线实验也证明了用输液瓶
蜡封法培养专性厌氧微生物简易可行
AMQ?<
,
对感受态细胞制备及电转化的影响
""丙酸梭菌为专性厌氧菌&一般对其进行的任何
图 C?丙酸梭菌生长曲线
T.;=C?%42KF-:34N027=2-"&-#&1#$0)
操作均需借助厌氧培养箱&这为感受态细胞的制备
带来不便 d
6
具有抗氧化作用&在刃天青显示为红
色含氧的培养基中加入 d
6
后&培养基红色迅速消
退&因此d
6
可在短时间内有效降低水环境中 -
$
的
含量 在空气环境中制备丙酸梭菌感受态细胞及
进行电转化操作时&在电击缓冲液中添加d
6
可以有
效防止空气中氧气对菌体细胞的侵害&使感受态细
胞保持较高的细胞通透性 d
6
对感受态细胞制备
及电转化的影响见图 $
图 A?维生素,对电转化的影响
T.;=A?#70:F127N.F5J./,2/060:F429245F.2/
AMR?不同对数生长期细胞对电转化的影响
""根据 $>$ 中绘制的生长曲线&收集处于不同对
数生长期的丙酸梭菌菌体细胞&制备感受态并进行
电转化实验 经过重复实验表明&只有对数生长中
期的菌体细胞电转化成功#图 ($
""由图 ( 可知"丙酸梭菌为革兰氏阳性菌&细胞壁
较厚&因此电转化效率较低 对数生长期尤其是对
数生长中期的菌体细胞&生长最为旺盛&细胞壁相
对较薄&并且与细胞所处的分裂状态较为同步&这
些特点为外源质粒通过电穿孔进入胞内创造必要
条件
*("第 # 期 王晨飞等"丙酸梭菌简易培养及电转化方法
图 Q?不同对数生长期细胞对电转化的影响
T.;=Q?#70:F127I.7040/F62;54.F-J9-4510
:0612/060:F429245F.2/
AM@?丙酸梭菌转化子质粒的酶切鉴定
""对在氯霉素抗性条件下得到的丙酸梭菌转化
子培养物&进行质粒提取和 G$&W_单酶切&凝胶电
泳鉴定结果如图 . 所示 由图 . 可知&电泳中条带
& 为酶切得到的 R,P条带&与 AQS&%( 理论大小
( $!( 9A相符 鉴定结果表明丙酸梭菌电转化实验
成功&结果正确
b%R,Pb32a@2) &%AQS&%( IC4@GB@I 9HG$&W_
图 R?转化子质粒酶切鉴定结果
T.;=R?S0136F279%(CBQ I.;01F0IHG >$&S)
Q?结?论
""本研究建立的输液瓶蜡封法是一种简易有效
的厌氧培养方法 运用该方法&在无需借助厌氧培
养箱条件下&丙酸梭菌成功得到培养&其芽孢经
*% i(&% MCE热激处理后迅速萌发&大大缩短传统
萌发时间 基于输液瓶蜡封法& 绘制了丙酸梭菌生
长曲线&并据此收集得到处于对数生长中期菌体细
胞 通过对该时期菌体细胞进行 <^/电击缓冲液
结合d
6
水溶液的洗涤处理&在无需借助厌氧培养箱
条件下&经$h# ad(# MG电转化&成功将外源质粒
AQS&%( 转化丙酸梭菌 质粒酶切鉴定结果表明本
研究确立的丙酸梭菌电转化条件和方法正确可靠&
对数生长中期菌体细胞最适宜用于外源成型质粒
的遗传转化
参考文献"
*&+"张岚>丙烯酸及酯的市场回顾与展望*S+>化工中间体&$%%
#&&$"51&&>
O;3E4Z3E>0CBK3BCDE 3EI FD2@L3GBDF3L2HJCL3LCI 3EI 3L2HJCL@GB@2
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*5+"陈国华&冯书亮&曹伟平&等>温度预处理对苏云金杆菌芽孢萌
发的影响*S+>中国生物防治&$%%.&$%#$$"&$*1&(%>
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JD4CL3J6DEB2&$%%.&$%#$$"&$*1&(%>
**+"代淑艳&王殿钧&解华&等>硫乙醇酸盐培养基中的刃天青的作
用分析*S+>中国生物制品学杂志&$%%#&&!##$".$51.$!>
R3C0;KH3E&T3E4RC3E K`E&\C@+K3&@B3J>)KELBCDE DF2@G3:K2CE CE
B;CD4JHLDJ3B@M@ICKM*S+>6;CE S/CDJD4CL3JG& $%%#& &! # # $"
.$51.$!>
*!+"马同锁&张燕&刘宏博&等>腐败梭菌的培养方式及生化特性鉴
定*S+>河北师范大学学报"自然科学版& $%%#& $ # # $"
#&51#&!>
b3YDE4GKD&O;3E4]3E&ZCK +DE49D&@B3J>Y;@LKJBK23JLDEICBCDEG
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DF+@9@C,D2M3JXEC[@2GCBH",3B0LC^ I&$%%#&$##$"#&51#&!>
!( 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"