全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%$ 年 & 月
生"物"加"工"过"程
38GH=-=S?FBHDE?AbG?.B?J=--LHIGH==BGHI
c?E/! 4?/#
UDB/#$%$
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收稿日期$#$$) *$+ *$&
基金项目$国家高技术研究发展计划"!+& 计划#资助项目"#$$2;;$#Q#%)#
作者简介$张德荣"%)!#%#&男&河南濮阳人&硕士&研究方向$化学生物学任宇红"联系人#&研究员&L1/=@F/JH
生物法合成达泊西汀
张德荣&任宇红&黄"磊&魏东芝
"华东理工大学 鲁华生物技术研究所 生物反应器工程国家重点实验室&上海 #$$#&2#
摘"要$通过固定化青霉素R酰化酶"9R;#对 " q# = 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙酸进行酶法拆分&得到合成
达泊西汀的中间体"-# & 氨基 & 苯基丙酸&"-# & 氨基 & 苯基丙酸经过还原+甲基化+缩合等多步化学合成
得到最终产物达泊西汀( " q# = 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙酸的最佳拆分条件$底物" q# = 苯乙酰基 &
氨基 & 苯基丙酸 #i!& I&固定化的青霉素酰化酶 #i++ I&.K2i& # g反应 , 8&"-# & 氨基 & 苯基丙酸收率
为 !)i,j&#>#>值 ))i&j( 达泊西汀的总收率 #ij&#>#>值 )+i2j(
关键词$& 氨基 苯基丙酸达泊西汀青霉素酰化酶拆分
中图分类号$(!%, )^%,""""文献标志码$;""""文章编号$%+2# *&+2!"#$%$#$# *$$%& *$
!K/F-01.127"!#RG592Y0F./0IK I.2E0F-2G
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J0K L24G1$&1DGH= .=HGJGEGH RDJWED-= B=-?EF>G?H
""将生物酶催化和有机合成相结合&为高光学纯
度药物的研究提供了一个重要途径)%* (
达泊西汀是一种选择性 羟色胺再吸收抑制
剂"NN 0^#&可用于治疗抑郁症和相关的情感障碍+
早泄"9L# )# *&*等(
达泊西汀的制备方法主要是化学合成法&该法需
要使用化学手性试剂&且具有副反应多+产物分离纯
化较复杂等缺点),* ( 但酶法拆分具有选择性强+环境
友好等优势)* ( 文献)%*报道使用脂肪酶对达泊西
汀的中间体进行拆分&进而合成达泊西汀&但由于该
法氨基在合成中要加以保护&增加了合成步骤&且保
护基试剂价格昂贵&不适合大规模制备( 青霉素酰化
酶对苯乙酰胺基团有立体选择性&可用于胺的拆
分)+* ( 用固定化青霉素R酰化酶"9R;#的酰基转移
作用对 " q# = 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙酸进
行水解&得到单一的对映体"-# & 氨基 & 苯基丙
酸&本拆分方法无副反应&反应条件温和&而且底物与
产物容易分离&从而避免了上述 # 种方法的不足(
"-# & 氨基 & 苯基丙酸经过还原+甲基化+缩合等 多步化学合成得到最终产物达泊西汀(
图 C?达泊西汀的青霉素酰化酶法合成路线
N.;=C?!K/F-01.1942:01127"!#RG592Y0F./0
C?材料与方法
C=C?仪器和试剂
_QQ1%N型自动数字旋光仪&上海安锐自动化
仪器有限公司;IGE=H>%%$$ -=BG=-液相色谱仪& 安
捷伦公司38GBDEJ=EVS1K分析柱"
!
<&#i$ J,i+ <<#&日本达赛尔比学公司c;^ 0;4$$ UK7
核磁共振仪&德国布鲁克公司(
环氧聚乙烯 树 脂 固 定 化 青 霉 素 酰 化 酶
"?>@&(/#&湖南福来格生物技术有限公司正己烷和
异丙醇&色谱纯&上海国药集团化学试剂有限公司
其他试剂均为市售分析纯(
C=@?分析方法
底物转化率+产物得率和产物对映体过量值
"#>#>值#均采用高效液相色谱法测定&检测波长
#%$ H<&流速 $i, A"正己烷#hA"异丙醇#hA"甲酸# k$h$h$i%&进
样量
!
Z&出峰时间"-# = 苯乙酰基 & 氨基
& 苯基丙酸 %#i## 氨基 & 苯基丙酸 %#i)% 核磁共振波谱测定(
C=M?外消旋体" Z# M 氨基 M 苯基丙酸"M#的
制备
""苯甲醛")i# $i$)% "%$ 水冷却后抽滤&滤饼用冷乙醇洗涤&用A"甲醇#hA"水#
k%$h%混合溶液重结晶&得白色颗粒状晶体 M"%$i2
I5p&收率2#i)j#&熔点 #%+ m#%! g "文献)2*$#%! m
#%) g#(
C=P?外消旋体" Z# " 苯乙酰基 M 氨基 M 苯
基丙酸"P#的制备
"" " q# & 氨基 & 苯基丙酸 " %+i I&
$i% #
V"%&$ 加至 #$ $ g&然后& 分别同时滴加苯乙酰氯 " % $i%% 完全后&$ g搅拌 # 8&常温搅拌 & 8&滴加#i$ 盐酸&至溶液 .Kk&&过滤干燥&干燥固体用正己烷
洗涤&得白色粉状固体 P"#+i# I5p&收率 )#i+j#&
熔点 %&& m%&! g "文献)!*$%&, m%,$ g#(
C=S?生物酶催化水解法制备"!# M 氨基 M 苯
基丙酸"S#
""" q# = 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙酸
"#i!& I5p&$i$% 4K
&
!K
#
V调节 .K至 2i&使固体完全溶解&定容至
%$$ 酶&缓慢搅拌开始反应( 反应液的 .K通过 .K1->D>
滴加 #i$ &
!K
#
V始终控制在一定范围内&
温度通过温度控制仪控制&反应一定时间&过滤&固
定化酶用少量水冲洗回收利用&向滤液缓慢滴入
#i$ 得白色固体 S "在最佳条件下得%i,2 I5p&收率
!)i,j#&熔点 ##$ m##% g(
,% 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
C=U?"!# M 氨基 M 苯基丙醇"U#的制备
""四氢呋喃" K`P#"&$ 基丙酸"%+i I&$i% $ g&慢慢加入ZG;EK
,
"%%i, I&$i& 流 8&然后将反应液冷却至 $ g&滴加入 #i$ 4DVK水溶液"%$$ #
NV
,
干燥&减压蒸
干得油状物&经柱色谱分离&蒸干得白色固体U"%,i I&
收率 )+j#&)
"
*
#$
k*)i! "J%&U=VK#(
C=X?"!# M 二甲氨基 M 苯基丙醇"X#的制备
""),j甲酸" I&$i% 冰浴下加入物质 U"& I5p&$i$#加入 &2j甲醛溶液"&i! I&$i$, 油浴搅拌 & m 8( 冷却至室温&冰浴下加 + .K%&&加水"#$ 次&无水4D
#
NV
,
干燥&过滤&滤液蒸干&剩余物经柱色
谱分离&得无色透明油状物质 X "#i& I5p&收率
+,i2j#( )
"
*
#$
k n&+i "J$i& 3K3E
&
#( L01UN
"+8B#$%2) "U
n
#( 核磁图谱% K14U^ "\UNV1@
+
#$
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k%i2# "<&#K#&#i$# "-&+K#&#i$2 "<&#K#&&/#&
"<&#K#&&i&,"@@&%K#&2i#% m2i&!"<&K#(
C=>?达泊西汀的制备
在4
#
氛围下&向三颈烧瓶中加入 4DK "%i I&
$i$+ 液将物质 X "%$ I5p&$i$+ 混合液于 $ g反应 % 8&滴加入 % 氟萘"+i $i$) #
加水
"&$$ 4D
#
NV
,
干燥&活性炭脱色&真空减压蒸干黄色油状物&
经柱色谱分离得无色油状物 C"%%i I& 收率+!j#&
#>#>值 )+i2j&)
"
*
#$
k n)i "J$i&3K3E
&
#核磁
图谱% K14U^ "3\3E
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浓度$i $
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2i "<& )K#& 2i2# m2i2+ "<& %K#&!i#$ m!i#,
"<& #K#(
@?结果与讨论
@=C?底物"P#的合成反应
""底物的纯度会直接影响到酶拆分的效率&因
此&提高底物的纯度非常重要( 从化学反应机理来
看&由于白色颗粒状晶体 M 的羧基和氨基都是活泼
基团&如不加保护白色颗粒状晶体 M 可能发生自身
缩合反应&使产品不纯( 实验发现&利用 NJ8?>=H1
bDF以致酶法拆分不能顺利进行但是在适当浓度的
4DVK水溶液中&反应可以顺利进行&并且得到了高
纯度的= 苯乙酰化产物 P&基本无副产物&产物 P
的水溶性很差&调节 .K至 & 左右&容易从水溶液中
析出&收率达到 )+j))* (
@=@?酶法拆分的条件优化
""根据建立的高效液相分析条件&对酶法拆分的
反应进行条件优化(
""在$i# 成很好的线性相关物质 P的标准曲线方程和相关系
数分别为$0k%) ++2iCn!i2& 3# k$i))) !( 因此&
可以用响应值"即峰面积#代替反应浓度的计算)%$* (
#/#/%"温度对酶促反应的影响
温度为酶促反应的影响如图 # 所示( 由图 # 可
知$在 % m&$ g温度范围内&酶的立体选择性较高
温度低于 % g时&酶活性低&拆分速率慢温度高于
& g时&酶的立体选择性又开始下降( 最佳反应温
度是 #$ m# g&此时产物S 的转化率和 #>#>值最
高&转化率 !)i,j&#>#>值 ))i&j(
图 @?温度对酶促反应的影响
N.;=@?#70:F127F0E9045F3402/F-0401263F.2/40136F
#/#/#"反应时间对酶促反应的影响
""反应时间对酶促反应的影响如图 &所示( 由图 &
可知$随着时间的延长&产物 S 的转化率逐渐增加&而
#>#>值有轻微变小趋势&这是因为青霉素酰化酶随时间
活性有所降低( 从产物 S的转化率和#>#>值 #个因素
考虑&本实验选择最佳反应时间为 #,$ #/#/&".K对酶促反应的影响
青霉素酰化酶催化反应的最适 .K为 + m)),* &
本实验选择考察 .K+i m) 的环境下&.K对酶促反
%"第 # 期 张德荣等$生物法合成达泊西汀
图 M?反应时间对酶促反应的影响
N.;=M?#70:F127405:F.2/F.E02/F-0401263F.2/40136F
应的影响&结果见图 ,( 由图 , 可知$.K对产物 S
的转化率影响较大.K在较小范围内时反应速率
小&转化率低.K较大时酶活性降低&产物转化率降
低( 反应的最佳 .K为 2i(
图 P?溶液9"对酶促反应的影响
N.;=P?#70:F1279"2/F-0401263F.2/40136F
#/#/,"底物浓度对酶促反应的影响
#i++ I固定化酶&水 %$$ , 8时考察底物浓度为酶促反应的影响&结果见图 (
由图 可知$底物的量过大时&在溶液中不能完
全溶解酶促反应溶液底物浓度较大时&还会导致
产物 S 的 #>#>值下降( 因此最佳底物浓度确定为
%i# m%i, 图 S?底物浓度对酶促反应的影响
N.;=S?#70:F12713I1F45F0:2/:0/F45F.2/2/F-0
401263F.2/40136F
#/#/"酶用量对酶促反应的影响
#i!& I底物水 %$$ 察酶用量对酶促反应的影响&结果见图 +(
由图 + 可知$酶促反应的效果随着酶用量的增
加而有明显变化&当酶量低于 ! O范围内&酶的用量
增加&产物的转化率和#>#>值也增加当酶量高于 !
O时&产物 S 的转化率仍然有增加趋势&但是由于酶
量过多&酶的单一选择性下降&造成产物#>#>值明显
下降( 故选择最佳酶用量 ! O(
图 U?酶量对酶促反应的影响
N.;=U?#70:F1270/VKE0:2/:0/F45F.2/2/F-0
401263F.2/40136F
""综上所述&青霉素酰化酶拆分底物的优化条
件$底物"" q# = 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙
酸##i!& I"%i# <#i++ I"! O#&.K2i&于 # g反应 , 8( 在此优化
条件下做 & 次平行实验考察实验的重现性&所得产
物 S 的平均转化率为 !)i,j&#>#>值 ))i&j(
@=M?达泊西汀的制备
酶促反应得到的溶液&调节 .K至 & 左右&"3#
= 苯乙酰基 & 氨基 & 苯基丙酸以固体形式析
出&"-# & 氨基 & 苯基丙酸留在水溶液中&然后
利用碱性离子交换树脂脱盐&#i$ &
!K
#
V
洗脱&洗脱液蒸干得"-# & 氨基 & 苯基丙酸(
拆分得到的"-# & 氨基 & 苯基丙酸经过还原+
甲基化+缩合等化学合成步骤得到最终产物达泊
西汀(
M?结?论
利用生物法制备达泊西汀&#>#/值 )+i2j&总收
率 #ij&此法简单+易工业化&而且固定化的青霉
素酰化酶对酰胺基团有很好的立体选择性&它来源
易得&造价低&对 .K的耐受能力强&可以反复利用
多次&比其他酶更有优势(
+% 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
参考文献$
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-W<<=>BW&%))&+"2#$%+$%1%+%$/
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)S*/合成化学&#$$2&%"%#$+)12#/
KFDHIRFDH8FD&MGDN8GY=H/LH7WGJ^ =-?EF>G?H ?A6&D1.8=H1
WEDEDHGH=>?-WH>8=-G7=61.8=HWEDEDHGH=)S*/38GH=-=S?FBHDE?A
NWH>8=>GJ38=BW&#$$2&%"%#$+)12#/
)%$* 匡春兰&钱俊青&邹小明&等/3 丁酸缩水甘油酯的酶法拆分
研究)S*/浙江工业大学学报&#$$,&&#"#$!%1!,/
eFDHI38FHEDH&(GDH SFHaGHI&Q?F MGD?DE/N>F@W?H ?.>G1
JDEB=-?EF>G?H ?AJ8GBDE@BFI-GH>=B<=@GD>=31IEWJG@WE6F>WBD>=6WEG1
.D-=)S*/S?FBHDE?AQ8=TGDHIOHGC=B-G>W?A` =J8H?E?IW&#$$,&&#
"#$
$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$$
!%1!,/
国内简讯
微生物分子生物学检测新技术问世
""据.科学时报/报道&中国地质科学院水文地质环境地质研究所经过积极探索&反复实验&建立了适合土
样和地下水样的微生物分子生物学检测高新技术(
""微生物分子生物学检测技术通过对不同试样微生物\4;的提取&将提取的\4;进行扩增并识别&来确
定试样中微生物的多样性和种属&具有先进性和准确性&免去了烦琐+需时长的培养过程&可检出传统方法
不可培养的微生物&并能原位反映微生物群落结构的真实情况( 微生物分子生物学技术的建立&突破了长
期以来一直采用的传统微生物培养技术方法( 该技术在污染修复+成岩成矿成油机理研究+微生物找矿+污
水处理等方面具有广泛的应用前景&是一种快速准确的高新技术(
""传统的微生物培养方法只能检测少量可培养的微生物&不能揭示其余大量的微生物&以致对水土环境
中微生物的多样性认识以偏概全( 近年来&通过直接对试样的\4;分析揭示其微生物种类的技术得到了较
大发展&该技术可不通过对微生物进行培养的方法&更快速+准确地反映微生物种群的多样性&为研究水土
环境中的微生物组成开辟了一条崭新的道路( 通过对水土试样\4;提取纯化&利用聚合酶链式反应"93^ #
技术&对试样\4;进行扩增&对扩增后的产物再利用变性梯度凝胶电泳"\RRL#技术&将不同微生物类型的
\4;基因片段分离&直观显示试样中微生物群落的多样性( 还可将\RRL技术的产物再扩增&然后测序&准
确鉴定微生物种属( 从试样\4;提取纯化&到93^ 扩增&再到 \RRL分离和测序&构成了一整套水土环境
中微生物组成多样性和种属鉴定研究的分子生物学检测技术(
""微生物分子生物学检测技术的建立&突破了长期以来一直采用的传统微生物培养技术方法&可以更加
直观全面地将试样的多样性展示出来&以及准确鉴定微生物种属( 它不仅可以应用于科学研究&在具体的
实践工作中也具有很好的应用前景$可显示在污染环境修复过程中&是哪类微生物大量繁殖并修复污染&可
人工添加这类微生物至类似污染环境&加速污染修复过程( 同时&在成岩成矿成油的过程中&通过微生物参
与技术&可以找到并鉴定相关的微生物种类&为成岩成矿成油机理研究以及利用微生物找矿而建立一种快
速有效的手段( "文伟河#
2%"第 # 期 张德荣等$生物法合成达泊西汀