全 文 ：第 １３卷第 ５期
２０１５年 ９月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １３ Ｎｏ􀆰 ５
Ｓｅｐ􀆰 ２０１５
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１５􀆰 ０５􀆰 ００６
收稿日期：２０１４－１０－０９
作者简介：冯晨龙（１９８８—），男，河北石家庄人，硕士研究生，研究方向：生物化工；王丽丽（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｗａｎｇｌｉｌｉ８６３２＠ ｓｉｎａ􀆰 ｃｏｍ
耐高渗拟布氏乳杆菌的富集选育
冯晨龙，葛人杰，段　 俐，王丽丽
（河北科技大学 生物科学与工程学院，河北 石家庄 ０５００１８）
摘　 要：拟布氏乳杆菌 Ｋ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｋ１）在厌氧条件下可以有效转化果糖生成甘露醇。 但当果糖浓
度逐步升高时，菌体生长及甘露醇产生速度减慢。 为了提高 Ｋ１菌株在高浓度果糖条件下的生长及转化速率，设计
了定向富集耐渗突变株的实验，采用 １０ Ｌ发酵罐，在高渗条件下连续转接培养，培养过程中果糖质量浓度经 ４次梯
度增加，从 ２７０ ｇ ／ Ｌ增加到 ３００ ｇ ／ Ｌ。 经 ５５ ｄ传代培养后分离纯化，获得耐渗突变株 Ｋ２。 通过 ２ Ｌ发酵罐验证试验，
发现 Ｋ２菌株在 ３００ ｇ ／ Ｌ果糖条件下，果糖利用速率提高 １０３％，发酵周期缩短 ４６􀆰 ４％，甘露醇的平均产量达到 １８９
ｇ ／ Ｌ，达到理论转化率的 ９４􀆰 ０％。
关键词：拟布氏乳杆菌；定向筛选；甘露醇
中图分类号：ＴＱ９２０．１　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１５）０５－００３１－０６
Ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｏｓｍｏｓｉｓ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｏｆ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ
ＦＥＮＧ Ｃｈｅｎｌｏｎｇ，ＧＥ Ｒｅｎｊｉｅ，ＤＵＡＮ Ｌｉ，ＷＡＮＧ Ｌｉｌｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｂｅｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００１８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｋ１ ｃａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｎｖｅｒｔ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｔｏ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ． Ｈｏｗｅｖｅｒ， ａｓ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ， ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ
ｄｅｃｒｅａｓｅ． Ａ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｈｅ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｌ􀆰 ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｋ１ ａｔ ｈｉｇｈ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ． Ａ ５５⁃ｄａｙ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ ｗａｓ
ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ａ １０⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ｗｉｔｈ ｆｏｕｒ⁃ｔｉｍｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ２７０
ｔｏ ｕｌｔｉｍａｔｅ ３００ ｇ ／ Ｌ． Ｌ􀆰 ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｋ２， ａ ｍｕｔａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｈｉｇｈ ｏｓｍｏｔｉｃ ｐｒｅｓｓｕｒｅ， ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ｂｙ １０３％ ｉｎ ａ ２⁃Ｌ ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ ａｔ ３００ ｇ ／ Ｌ ｆｒｕｃｔｏｓｅ． Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ
ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ ｂｙ ４６􀆰 ４％ ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｋ１ ｓｔｒａｉｎ􀆰 Ｔｈｅ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ １８９ ｇ ／ Ｌ，
９４􀆰 ０％ ｏｆ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ； ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ； ｍａｎｎｉｔｏｌ
　 　 甘露醇（ｍａｎｎｉｔｏｌ）是一种天然的六碳糖醇，在
自然界中广泛存在于海藻、水果和蔬菜内［１］，食品、
医药和化工等领域已有广泛应用［２－３］。 目前，甘露
醇的主要生产方法有海带提取法、果糖氢化法和微
生物发酵法。 其中，微生物发酵法由于效率问题还
处于研究阶段，已经报道具有生产甘露醇能力的微
生物种类有霉菌、酵母和细菌［４－５］。 Ｓｍｉｌｅｙ 等［６］报
道了亮白曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｃａｎｄｉｄｕｓ）利用葡萄糖产
甘露醇的单位容积产率为 ０􀆰 １５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），甘露醇的
转化率是 ３１％。 Ｓｏｎｇ 等［７］筛选出 １ 株木兰假丝酵
母 （ Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｇｎｏｌｉａ），利用 １５０ ｇ ／ Ｌ 果糖发酵
１６８ ｈ，产生甘露醇 ６７ ｇ ／ Ｌ，发酵过程中进行补料，使
果糖浓度维持在 ３％～１２％时，甘露醇的产量在发酵
２００ ｈ 后高达 ２０９ ｇ ／ Ｌ，相应的转化率为 ８３％，容积
产率为 １􀆰 ０３ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 Ｓａｈａ 等［８］报道了 ９ 株异型
发酵 乳 酸 菌 能 利 用 果 糖 产 生 甘 露 醇， 其 中
Ｌ􀆰 ｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ ＮＲＲＬ Ｂ ３６９３ 以 ３００ ｇ ／ Ｌ 果糖为底
物，ｐＨ ５􀆰 ０、３７ ℃条件下，发酵 １３６ ｈ 后甘露醇可达
１９８ ｇ ／ Ｌ，容积产率是 １􀆰 ４６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 与国外研究相
比，国内甘露醇的研究相对较晚，且报道的产量也
较低，高产高效菌株的筛选有利于微生物产甘露醇
的规模化生产。 朱豫等［９］筛选出了 １ 株能以糖化
菊芋汁为原料，发酵产甘露醇的乳酸菌，甘露醇的
产量达到了 ８０ ｇ ／ Ｌ。 侯建革等［１０］采用布氏乳杆菌
（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ），培养基总糖质量浓度为 １５０
ｇ ／ Ｌ，其中果糖与葡萄糖质量比为 ２ ∶ １ ，发酵 ４８ ｈ，
产生甘露醇 ６８􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ。 魏文婷等［１１］筛选出 １ 株近
平滑假丝酵母（Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ），利用 ２００ ｇ ／ Ｌ
葡萄糖，摇瓶培养产生甘露醇 ６１􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ，并进行３０ Ｌ
发酵罐扩大培养，发酵 ７２ ｈ，甘露醇最大产量为
８０􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ。
保存于笔者所在实验室的 １ 株拟布氏乳杆菌
Ｋ１（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｋ１）是典型的异型乳
酸发酵菌株，厌氧条件下，采用 １５％接种量缩短发
酵时间，能够利用果糖高产甘露醇。 对拟布氏乳
杆菌 Ｋ１ 的前期研究发现：培养基中果糖质量浓度
低于 ２４０ ｇ ／ Ｌ时，Ｋ１ 菌株的甘露醇产率较高，果糖
被完全利用；超过 ２４０ ｇ ／ Ｌ 时，甘露醇产率明显下
降。 延长发酵周期，果糖残留较多。 由于甘露醇
产生与菌体生长属于正耦联相关，在高渗条件下，
甘露醇产率下降主要原因是 Ｋ１ 菌株生长受到了
抑制。 因此，筛选在高渗条件下能够快速生长的
突变菌株，理论上可以提高甘露醇产生速率，缩短
发酵周期，降低果糖残留。
本研究中，笔者采用 １０ Ｌ 发酵罐，果糖质量浓
度 ２７０～３００ ｇ ／ Ｌ，４％接种量，延长罐内菌体增殖时
间，增加突变概率，并通过长时间的连续转接培养，
使得菌株分裂繁殖过程中的自然突变株得到定向
富集，以期筛选得到在高渗条件下生长速度快的高
产甘露醇突变菌株，并通过 ２ Ｌ发酵罐，验证菌株发
酵的能力。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
拟布氏乳杆菌 Ｋ１ （ Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ
Ｋ１），保藏于笔者所在实验室。
１􀆰 ２　 培养基及培养方法
为了检测方便，实验中的单糖均为果糖。 因
此，理论上甘露醇的最大摩尔产率应为耗用果糖物
质的量的 ６６􀆰 ７％。
１􀆰 ２􀆰 １　 培养基
一级种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：果糖 ５０、玉米浆 １０、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２、ＫＨ２ＰＯ４ ２、ＭｇＳＯ４ １、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２。
二级种子培养基（ ｇ ／ Ｌ）：果糖 １５０、玉米浆 １０、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２、ＫＨ２ＰＯ４ ２、ＭｇＳＯ４ １、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２。
初始驯化培养基（ ｇ ／ Ｌ）：果糖 ２７０、玉米浆 ２０、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２、ＫＨ２ＰＯ４ ２、ＭｇＳＯ４ １、ＣａＣｌ２ ０􀆰 ２。
发酵培养基 （ ｇ ／ Ｌ ）：果糖 ３００、玉米浆 ２０、
（ＮＨ４） ２ＳＯ４ ２、ＫＨ２ＰＯ４ ２、ＭｇＳＯ４ １、ＣａＣｌ２０􀆰 ２。
以上培养基都需调 ｐＨ 至 ６􀆰 ５。 补糖液分别为
５４０、５６０、５８０ 和 ６００ ｇ ／ Ｌ 果糖。 发酵过程中利用
ＮａＯＨ做酸中和剂，且质量浓度大于 ４００ ｇ ／ Ｌ。
１􀆰 ２􀆰 ２　 富集培养的方法
取 １ ｍＬ在－７０ ℃保藏的 ２５％甘油保菌液，接种
到 ２００ ｍＬ（２５０ ｍＬ 三角瓶）的一级种子培养基中，
３０ ℃厌氧培养 ４８ ｈ，转接到 ８００ ｍＬ（１ ０００ ｍＬ蓝口
瓶）二级种子培养基中，继续 ３０ ℃厌氧培养 ４８ ｈ，
离心收集 ４００ ｍＬ二级种子液菌体（接种量 ４％），接
入 １０ Ｌ Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃ发酵罐，初始装液量 ８ Ｌ，初始
果糖质量浓度为 ２７０ ｇ ／ Ｌ，温度 ３０ ℃，自控 ｐＨ ６􀆰 ３，
搅拌转速 ２００ ｒ ／ ｍｉｎ。 过程中检测果糖及甘露醇含
量，当果糖质量浓度降到 ４０ ｇ ／ Ｌ 以下时，停止发酵，
无菌取样 ５００ ｍＬ，其中 １００ ｍＬ 用于菌种保藏，４００
ｍＬ菌液离心收集菌体，作为转接下一批富集培养
的种子。 每两批富集培养后，果糖浓度提高 １％，即
８批的果糖质量浓度分别为 ２７０、２７０、２８０、２８０、２９０、
２９０、３００和 ３００ ｇ ／ Ｌ。 由于发酵过程中大量产酸，每
一批富集培养过程，都必须补加高浓度 ＮａＯＨ 溶液
来稳定 ｐＨ，发酵开始前，计算出理论需要补碱的总
质量，配制总体积为 １ Ｌ，为了防止补碱过程引发体
积变化带来的果糖质量浓度变化，采用补碱与补糖
体积比为 １ ∶ １联动，每补加 １ 份体积的 ＮａＯＨ溶液，
就同时补加等体积的两倍初始质量浓度的果糖，补
糖总体积也为 １ Ｌ，发酵罐终体积为 １０ Ｌ，８ 批富集
培养，周而复始，通过检测过程数据，判断出正向突
变的累计趋势，一定时间后，分离突变株，本研究共
耗时 ５５ ｄ。
２３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
１􀆰 ２􀆰 ３　 筛选方法
将第 ８ 批次的培养液适当稀释，涂布于果糖质
量浓度为 ３００ ｇ ／ Ｌ的筛选平板，厌氧条件下 ３０ ℃培
养 ４８ ｈ。 选择生长迅速、直径厚大的菌落，分别等量
接种到 ２００ ｍＬ含 ３００ ｇ ／ Ｌ 果糖的液体培养基中静
置培养，４８ ｈ后比较培养液菌体密度（ＯＤ）大小，筛
选出生长速度最快的菌株。
１􀆰 ２􀆰 ４　 菌株发酵性能比较及发酵稳定性的测定
Ｋ１、Ｋ２ 菌株采用 ２ Ｌ 发酵罐发酵，果糖质量浓
度为 ３００ ｇ ／ Ｌ ，接种量为 １５％，用 ＮａＯＨ 自动调节
ｐＨ为 ６􀆰 ３，控制温度为 ３０ ℃。 通过检测果糖质量
浓度、菌体密度（ＯＤ）和产物的变化，对 Ｋ１、Ｋ２ 菌株
的性能进行比较。
Ｋ２菌株采用 ２ Ｌ 发酵罐发酵，连续发酵 ３ 批
次，果糖质量浓度为 ３００ ｇ ／ Ｌ ，接种量为 １５％，用
ＮａＯＨ自动调节 ｐＨ 为 ６􀆰 ３，控制温度为 ３０ ℃。 通
过检测产物的质量浓度，衡量 Ｋ２株菌发酵稳定性。
１􀆰 ３　 分析方法
１􀆰 ３􀆰 １　 菌体密度的测定
稀释发酵液 Ｎ倍，取 １􀆰 ５ ｍＬ，加入 ３ ｍＬ 的 ２􀆰 ５
ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４酸化发酵液，蒸馏水为空白样，用 ７２１
分光光度计测定 ６００ ｎｍ波长下的吸光值 Ａ６００，ＯＤ＝
３Ａ６００Ｎ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 果糖质量浓度的测定及果糖利用速率
果糖质量浓度的测定采用 ３，５ 二硝基水杨酸
（ＤＮＳ）比色法，参照文献［１２］进行。
精确配制 １、２、３、４ 和 ５ ｇ ／ Ｌ 果糖溶液，通过
３，５ 二硝基水杨酸比色法分别测得吸光度为
０􀆰 ０７９、０􀆰 １６９、０􀆰 ２３３、０􀆰 ２８３ 和 ０􀆰 ３５６，根据所测结果
得到标准曲线 ｙ ＝ ０􀆰 ７０３ ４ｘ＋０􀆰 ００５ ８，Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９９８ ９。
果糖利用率速率计算见式（１）。
果糖利用速率 ＝ ｍ１ ／ Ｖｔ （１）
式中：ｍ１ 为果糖质量，ｇ；Ｖ 为发酵液体积，Ｌ；ｔ 为发
酵时间，ｈ。
１􀆰 ３􀆰 ３　 甘露醇含量的测定、甘露醇摩尔得率及甘露
醇产率
用 Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ 高效液相色谱仪（美国安捷
伦公司）检测甘露醇含量。 检测器为示差检测
器，色谱柱为 ＸｔｉｍａｔｅＴＭ Ｓｕｇａｒ Ｃａ 型树脂柱，流
动相为 ５ 级蒸馏水，流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ，检测波
长为 ２１０ ｎｍ，柱温为 ７０ ℃ ，进样量为 ２０ μＬ。 甘
露醇摩尔得率计算见式（２） 。 甘露醇生产速率计
算见式（３） 。
甘露醇摩尔得率 ＝ ｎ（实际产甘露醇）
ｎ（理论产甘露醇）
× １００％
（２）
甘露醇产生速率 ＝ ｍ２ ／ Ｖｔ （３）
式中：ｍ２ 为甘露醇质量，ｇ。
１􀆰 ３􀆰 ４　 乙酸和乳酸含量的测定
用 Ａｇｉｌｅｎｔ １２００型高效液相色谱仪（美国安捷伦
公司）检测乙酸、乳酸含量［１３］。 检测器为紫外检测
器，色谱柱为Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ ８７Ｈ，７􀆰 ８ ｍｍ×３００ ｍｍ，流
动相为 ０􀆰 ００５ ｍｏｌ ／ Ｌ Ｈ２ＳＯ４，流速为 ０􀆰 ６ ｍＬ ／ ｍｉｎ。 检
测波长为 ２１０ ｎｍ，柱温为 ５０ ℃，进样量为 ２０ μＬ。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 Ｋ１菌株的特点及在不同果糖浓度中的培养
侯建革等［１０］和蒋华［１４］研究证明布氏乳杆菌
是典型的异型乳酸发酵。 当培养基中碳源为葡萄
糖时，厌氧条件下，代谢产物为乳酸、乙醇和 ＣＯ２；
当培养基中含有果糖时，代谢产物为乳酸、乙酸、
甘露醇和 ＣＯ２，果糖在培养基中既可以作为碳源，
又可以作为氢受体生成甘露醇。 理论上当培养基
中葡萄糖与果糖的质量比达到 １ ∶ ２时，果糖只充当
受氢体使用。 葡萄糖＋２ 果糖 →２ 甘露醇＋乳酸＋
乙酸＋ＣＯ２。 如果培养基中只含有果糖，理论上，只
有 ２ ／ ３ 的果糖转化为甘露醇，同时整个发酵过程
由于产生了较多的乳酸和乙酸，发酵液的渗透压
是一个逐步提高的过程。
Ｋ１菌株厌氧生长速度较慢，通常采用 １５％接种
量，３０ ℃培养，考察菌体生长与果糖消耗以及甘露醇
生成之间的关系，结果见图 １。 由图 １可知：果糖质量
浓度为 ２４０ ｇ ／ Ｌ 时，发酵周期为 ８５ ｈ，果糖残留 ４
ｇ ／ Ｌ，果糖利用速率为 ２􀆰 ８２ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），甘露醇产生速
率为 １􀆰 ７７ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）；果糖质量浓度为 ２７０ ｇ ／ Ｌ 时，发
酵周期为 １３０ ｈ，果糖残留 ７ ｇ ／ Ｌ，果糖利用速率为
２􀆰 ０８ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），甘露醇产生速率为 １􀆰 ３５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 该
结果说明，果糖利用速率降低 ２６％，甘露醇产生速率
降低 ２３􀆰 ７％，对应的 ＯＤ与果糖曲线、ＯＤ与甘露醇曲
线利用相一致，即低浓度果糖时，菌体生长速度较快，
甘露醇产生速度较快，该结果说明，高浓度果糖对 Ｋ１
菌株生长和甘露醇生成有明显的抑制作用。
３３　 第 ５期 冯晨龙等：耐高渗拟布氏乳杆菌的富集选育
图 １　 Ｋ１菌株在培养过程中菌体生长、果糖消耗及甘露醇生成的关系
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ，ｆｒｕｃｔｏｓｅ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｓｔｒａｉｎｓ Ｋ１ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
２􀆰 ２　 耐高浓度果糖突变菌株的定向富集培养
按照 １􀆰 ２􀆰 ２ 节方法，４％接种量，控温 ３０ ℃，
ＮａＯＨ溶液自动调节 ｐＨ ６􀆰 ３，连续 ８ 批富集培养实
验，每 ２ 批富集培养后，果糖质量浓度提高 １％，考
察 ８ 批富集培养中果糖和甘露醇质量浓度的变
化，结果见图 ２。 由图 ２ 可知：随着果糖质量浓度
的提高，由 ２７０ ｇ ／ Ｌ增加到 ３００ ｇ ／ Ｌ，发酵周期没有
明显延长，果糖残留相对降低，这表明富集过程
中，菌株的耐渗程度逐步增加，耐渗突变菌株逐步
被富集。
图 ２　 定向富集过程中果糖和甘露醇的变化
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ａｎｄ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｐｒｏｃｅｓｓ
２􀆰 ３　 稀释分离方法获得耐渗菌株
由于甘露醇的产量与菌体生长相耦联，因此筛
选生长迅速的菌株，有可能甘露醇的产量也相应提
高。 将富集培养 ５５ ｄ 后的第 ８ 批培养液，在含有
３００ ｇ ／ Ｌ果糖的固体培养基上稀释分离，厌氧条件
下，３０ ℃培养 ４８ ｈ，选择 ３０ 个生长迅速、直径厚大
的菌落，纯化后，分别接种到 ２００ ｍＬ 含 ３００ ｇ ／ Ｌ 果
糖的液体培养基中静置培养，４８ ｈ 后比较培养液菌
体密度 ＯＤ 大小，菌体密度 ＯＤ 越大，说明菌体生长
越旺盛，结果见表 １。 由表 １ 可知：２ 号菌株的 ＯＤ
最高，达到了 ４􀆰 ２，是一个很有前景的高产菌株，命
名为拟布氏乳杆菌 Ｋ２菌株。
４３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷　
表 １　 菌体密度 ＯＤ比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ
编号 ＯＤ 编号 ＯＤ
１ ３􀆰 ７ １６ ３􀆰 ５
２ ４􀆰 ２ １７ ３􀆰 ７
３ ３􀆰 ７ １８ ３􀆰 ２
４ ４􀆰 ０ １９ ３􀆰 ６
５ ３􀆰 ９ ２０ ３􀆰 ９
６ ３􀆰 ９ ２１ ３􀆰 ７
７ ３􀆰 ４ ２２ ３􀆰 ７
８ ３􀆰 ５ ２３ ３􀆰 ９
９ ４􀆰 ０ ２４ ３􀆰 ７
１０ ３􀆰 ８ ２５ ４􀆰 ０
１１ ３􀆰 ９ ２６ ３􀆰 ９
１２ ３􀆰 １ ２７ ３􀆰 １
１３ ３􀆰 １ ２８ ３􀆰 ３
１４ ３􀆰 ４ ２９ ３􀆰 ３
１５ ３􀆰 ６ ３０ ３􀆰 ２
２􀆰 ４　 Ｋ１、Ｋ２菌株的性能比较及 Ｋ２ 菌株发酵的稳
定性结果
　 　 采用发酵培养基，果糖质量浓度为 ３００ ｇ ／ Ｌ，２ Ｌ
发酵罐，接种量为 １５％，用 ＮａＯＨ 自动调节 ｐＨ 为
６􀆰 ３，控制温度为 ３０ ℃。
２􀆰 ４􀆰 １　 两菌株的生长曲线及果糖利用速率
图 ３　 Ｋ１、Ｋ２菌发酵过程中果糖及 ＯＤ的变化
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ ｆｒｕｃｔｏｓｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ Ｋ１，Ｋ２
图 ３是两菌株的生长曲线及果糖质量浓度变化
曲线。 由图 ３可知：菌体的生长与果糖的利用呈正
相关，在接种量均为 １５％的条件下，Ｋ２ 菌对果糖利
用迅速，７５ ｈ 时残留果糖为 ３􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ；发酵结束后，
果糖利用速率为 ３􀆰 ９５ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 Ｋ１菌 ７５ ｈ时发酵
残留果糖为 １７０ ｇ ／ Ｌ，１４０ ｈ 时 Ｋ１ 发酵液中仍残留
果糖 ２９ ｇ ／ Ｌ，Ｋ１菌株停止生长不再产酸，发酵结束，
果糖利用速率为 １􀆰 ９４ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。 由此可见，Ｋ２ 菌
株果糖利用速率比 Ｋ１菌株提高 １０３％，发酵周期缩
短 ４６􀆰 ４％；发酵过程中，两株菌的菌体密度（ＯＤ）变
化与果糖利用一致，即果糖利用快，菌体密度增加
也快，该结果表明，Ｋ２菌株具有明显的生长优势。
２􀆰 ４􀆰 ２　 两菌株的甘露醇产生速率
图 ４ 是 Ｋ１ 和 Ｋ２ 两菌株产甘露醇的时间变化
曲线。 由图 ４可知：Ｋ１菌株发酵 ７５ ｈ 时，甘露醇质
量浓度只有 ７８ ｇ ／ Ｌ，１４２ ｈ 时，甘露醇质量浓度达到
１７８ ｇ ／ Ｌ，整个发酵过程中甘露醇生产强度为 １􀆰 ２５
ｇ ／ （Ｌ·ｈ）；而 Ｋ２菌株 ７５ ｈ时，甘露醇质量浓度达到
１８９ ｇ ／ Ｌ，生产强度为 ２􀆰 ５６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），与 Ｋ１ 菌株相
比，Ｋ２菌株甘露醇产生速率提高了 １０４􀆰 ８％，摩尔转
化收率为 ９４％，发酵周期缩短了 ４６􀆰 ４％，该结果表
明，Ｋ２菌株有较高的甘露醇生产强度和较短的发酵
周期。
图 ４　 Ｋ１、Ｋ２菌发酵过程中甘露醇的变化
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ ｍａｎｎｉｔｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ Ｋ１，Ｋ２
２􀆰 ４􀆰 ３　 两菌株产生的乳酸和乙酸
发酵过程中，有大量的乳酸和乙酸产生，Ｋ１、Ｋ２
菌株发酵结束后，生成乳酸与乙酸的检测结果见表
２。 由表 ２ 可知：Ｋ１ 菌株生产的乳酸、乙酸分别为
５２􀆰 ２、３１􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ； Ｋ２ 菌株生产的乳酸、乙酸分别为
５６􀆰 ２、３４􀆰 ６ ｇ ／ Ｌ。 该结果表明，Ｋ２菌株较 Ｋ１ 菌株的
产酸量更多些，果糖利用更彻底，菌体生长更好，甘
露醇产量更高，但对于甘露醇来说，这些都将是发
酵液中生成甘露醇过程中的副产物。
表 ２　 Ｋ１、Ｋ２菌发酵产物中乳酸和乙酸的比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｂｙ ｌａｃｔｉｃ ａｃｉｄ ａｎｄ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ
ｓｔｒａｉｎ Ｋ１ ａｎｄ Ｋ２ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｒｏｔｈ
菌株 ρ（乳酸） ／ （ｇ·Ｌ－１） ρ（乙酸） ／ （ｇ·Ｌ－１）
Ｋ１ ５２􀆰 ２ ３１􀆰 ０
Ｋ２ ５６􀆰 ２ ３４􀆰 ６
５３　 第 ５期 冯晨龙等：耐高渗拟布氏乳杆菌的富集选育
２􀆰 ４􀆰 ４　 Ｋ２菌稳定性的测定
在 ２ Ｌ发酵罐中， Ｋ２ 菌独立发酵 ３ 个批次，果
糖质量浓度均为 ３００ ｇ ／ Ｌ，接种量 １５％，用 ＮａＯＨ 自
动调节 ｐＨ 为 ６􀆰 ３，控制温度为 ３０ ℃，发酵周期
７３～７８ ｈ，产物结果见表 ３。 由表 ３可知：３批次发酵
得到的甘露醇分别为 １８８、１９１和 １８８ ｇ ／ Ｌ，甘露醇摩
尔得率分别为 ９３􀆰 １％、９４􀆰 ５％和 ９３􀆰 １％，乳酸质量浓
度分别为 ５６􀆰 ０、５６􀆰 ４ 和 ５５􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ，乙酸质量浓度分
别为 ３４􀆰 ２、３４􀆰 ９和 ３３􀆰 ７ ｇ ／ Ｌ。 该结果表明，Ｋ２菌发
酵产物中甘露醇、乳酸和乙酸质量浓度波动很小，
发酵周期稳定，表明该菌株遗传学上传代稳定，是
一株很有生产潜力的菌株。
表 ３　 Ｋ２菌发酵的稳定性
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｔｒａｉｎ Ｋ２ ｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
批次 ρ（甘露醇） ／（ｇ·Ｌ－１）
甘露醇摩尔
得率 ／ ％
ρ（（乳酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（乙酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
１ １８８ ９３􀆰 １ ５６􀆰 ０ ３４􀆰 ２
２ １９１ ９４􀆰 ５ ５６􀆰 ４ ３４􀆰 ９
３ １８８ ９３􀆰 １ ５５􀆰 ３ ３３􀆰 ７
３　 结论
采用 １０ Ｌ发酵罐，补料维持高底物浓度的条
件下，定向富集拟布氏乳杆菌 Ｋ１ 的自然突变株，
历时 ５５ ｄ、８ 个批次的连续转接培养，获得了能够
在高渗透培养基中快速生长的突变菌株 Ｋ２，该菌
株在 ３００ ｇ ／ Ｌ果糖的培养基中，３０ ℃发酵 ７５ ｈ，甘
露醇产量达到 １８９ ｇ ／ Ｌ，摩尔转化产率为理论收率
的 ９４􀆰 ０％，与 Ｋ１ 菌株比较，Ｋ２ 菌株甘露醇生产强
度提高了 １０４􀆰 ８％，果糖利用速率提高 １０３％，发酵
周期缩短了 ４６􀆰 ４％，是一株很有工业化潜力的甘
露醇生产菌株。
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（责任编辑　 荀志金）
６３ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １３卷