全 文 ：第７卷第２期
２００９年３月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．２
Ｍａｒ．２００９
收稿日期：２００８－０９－２２
基金项目：国家自然科学基金项目资助（３０３７００２８）；福建省科技厅重大项目资助（２００３Ｆ００５，２００５Ｑ００７）；福建省发改委重大项目（［２００４］４７７）
作者简介：于爱群（１９８３—），男，山东烟台人，硕士研究生，研究方向：分子生物学；黄建忠（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｈｊｚ＠ｆｊｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
γ 亚麻酸产生菌 ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０的
筛选及分子鉴定
于爱群，江贤章，夏晓峰，吴松刚，黄建忠
（福建师范大学 工业微生物教育部工程研究中心，生命科学学院，福建省现代发酵技术工程研究中心，福州 ３５０１０８）
摘 要：为了获得高产γ 亚麻酸（γ ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ，ＧＬＡ）的菌株，利用苏丹黑染色法筛选获得１株 ＧＬＡ产生菌
ＥＩＭ １０，通过摇瓶培养，其生物量可达１１８８２ｇ／Ｌ，菌丝体油脂含量可达１８８６％。气相色谱 质谱（ＧＣ ＭＳ）分析
表明其γ 亚麻酸质量分数（占总脂肪酸）高达２７６８％。为进一步鉴定该菌株，克隆测定了该菌１８ＳｒＲＮＡ基因序
列，并对其进行系统进化树分析，结果表明该菌属于毛霉属，与 Ｍｕｃｏｒｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｍｕｃｏｒｐｌｕｍｂｅｕｓ、Ｍｕｃｏｒｒａｍｏｓｉｓｉｍｕｓ
与Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｏｉｄｅｓ同属一个分支。
关键词：分析；γ 亚麻酸；Ｍｕｃｏｒｓｐ；进化树；１８ＳｒＲＮＡ
中图分类号：Ｑ５２２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０２－００７４－０５
ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ１０ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇＧＬＡ
ＹＵＡｉｑｕｎ，ＪＩＡＮＧＸｉａｎｚｈａｎｇ，ＸＩＡＸｉａｏｆｅｎｇ，ＷＵＳｏｎｇｇａｎｇ，ＨＵＡＮＧＪｉａｎｚｈｏｎｇ
（ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，
ＦｕｊｉａｎＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒｏｆＦｕｊｉａｎＭｏｄｅｒｎＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０１０８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｏｂｔａｉｎｈｉｇｈｙｉｅｌｄｓｔｒａｉｎｏｆγｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ（ＧＬＡ）ＥＩＭ１０ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇＧＬＡｗａｓ
ｉｓｏｌａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇＳｕｄａｎｂｌａｃｋｓｔａｉｎｉｎｇ．Ａｆｔｅｒｓｈａｋｉｎｇｆｌａｓｋｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｂｉｏｍａｓｓｒｅａｃｈｅｄ１１８８２ｇ／Ｌ，ｔｈｅ
ｏｉｌｃｏｎｔｅｎｔｏｆｔｈｅｍｙｃｅｌｉａｗａｓ１８．８６％．ＴｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＧＬＡｗａｓｕｐ２７６８％ ｏｆｔｈｅｔｏｔａｌｆａｔｙａｃｉｄｓｂｙ
ｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＧＣＭＳ）．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｆｕｒｔｈｅｒｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｔｔｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｅｖｅｌ．
Ｔｈｅ１８ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｏｆＥＩＭ１０ｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｅｄ．Ｔｈｅｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆｔｈｅ１８ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ
ｏｆＥＩＭ１０ｉｓａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅ１８ＳｒＲＮＡｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＭｕｃｏｒｓｐ．，ａｎｄｈａｓｔｈｅｓａｍｅ
ｂｒａｎｃｈｗｉｔｈＭｕｃｏｒｒａｃｅｍｏｓｕｓ，Ｍｕｃｏｒｐｌｕｍｂｅｕｓ，Ｍｕｃｏｒｒａｍｏｓｉｓｉｍｕｓ，ａｎｄＭｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｏｉｄｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ；γｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ；Ｍｕｃｏｒｓｐ．；ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅ；１８ＳｒＲＮＡ
γ 亚麻酸（γ ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ，ＧＬＡ）是一种人体
必需的多不饱和脂肪酸，具有抗肿瘤、抗动脉粥样
硬化、抗 ＨＩＶ感染以及降血脂和治疗高血压等疗
效［１－７］，被评价为“二十一世纪功能性食品主
角”［８］。月见草是ＧＬＡ的传统来源［９］，但月见草中
的ＧＬＡ满足不了日益扩大的市场需求［１０］。寻找新
的ＧＬＡ的资源是近年来ＧＬＡ研究热点之一［１１］。微
生物具有适应性强、生长迅速、生产周期短、菌体容
易收集，而且产量不受原料、产地和季节限制以及
连续大规模生产等优点，所以微生物发酵法生产
ＧＬＡ已成为发展趋势［１２］。被孢霉（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌａ）、毛
霉（Ｍｕｃｏｒ）和藻类是已知的 ＧＬＡ优良产生菌，它们
的ＧＬＡ质量分数一般在７％ ～１２％之间，寻找更优
良的ＧＬＡ产生菌，仍是当前的研究热点之一。
本文利用苏丹黑染色法筛选极具开发前景的
ＧＬＡ高产菌。同时利用基因工程方法，在分子水平
进行菌株鉴定。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１．１．１ 菌株和质粒
ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０为本课题组利用苏丹黑染色
法筛选获得，并保存于福建师范大学工业微生物教
育部工程研究中心；克隆宿主菌（ＥｃｏｌｉＤＨ５α）由本
实验室保存菌种；载体 ｐＭＤ１８ ＴＶｅｃｔｏｒ试剂盒购
自ＴＡＫＡＲＡ公司。
１．１．２ 主要试剂
ＤＮＡＬａｄｄｅｒＭａｒｋｅｒ、ｒＴａｑＤＮＡ聚合酶、ＥｘＴａｑ
ＤＮＡ聚合酶和 ＰＣＲ试剂均购自 ＴＡＫＡＲＡ公司；琼
脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒购自天根生化科技有限
公司；其余试剂均为进口生化纯或国产分析纯产品。
１．１．３ 培养基
ＰＤＡ培养基［１３］用于 ＳｔｒａｉｎＥＩＭ １０菌种保藏
及活化；
液体发酵培养基见文献［１３］；
ＬＢ培养基［１３］用于ＥｃｏｌｉＤＨ５α的培养，加氨苄
青霉素（Ａｍｐ）筛选转化子。
１．２ 菌株的初筛
对ＰＤＡ培养基上培养的霉菌进行苏丹黑染色
并在显微镜下观察，选出颜色较深的菌株，说明该
菌株为潜在的ＧＬＡ高产菌株。
１．３ 菌种培养
１．３．１ 菌种活化
将菌种接到ＰＤＡ斜面培养基上，３０℃培养２～３ｄ。
１．３．２ 种子液的制备
活化菌种用少量无菌水洗入装有５０ｍＬ种子液培
养基的２５０ｍＬ三角瓶中，３０℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养２～３ｄ。
１．３．３ 摇床培养
２５０ｍＬ的三角瓶内装５０ｍＬ的液体发酵培养基，
接入种子液１～２ｍＬ，３０℃，１６０ｒ／ｍｉｎ培养３～５ｄ。
１．４ 干菌体收集
用的确良布过滤收集湿菌体，适量的蒸馏水洗
涤，６０℃真空干燥。每升发酵液所获菌体的干质量
即为菌体收率（ｍｇ／Ｌ）。
１．５ 油脂提取
准确称取干菌体０５ｇ，加入蒸馏水４ｍＬ，混匀
后加入浓盐酸５ｍＬ，于７０℃水浴中加热４０ｍｉｎ，至
菌体完全消化。冷却后加入１５ｍＬ乙醇，再加入４
ｍＬ乙醚，充分摇匀后，静置分层，取上清，重复２～３
次，洗至上层有机相基本无色，将有机相合并，再用
旋转蒸发仪除去乙醚，称质量，计算油脂产率。每
１００ｇ干菌体所含油脂的质量即为菌体油脂质量分
数（％）；油脂产率（ｍｇ／Ｌ）＝菌体油脂含量（％）×
菌体收率（ｍｇ／Ｌ）。
１．６ 产物的ＧＣ ＭＳ测定
１６１ 脂肪酸的甲酯化
取粗油脂０１ｇ，２ｍＬ正己烷溶解，加入 ２ｍＬ
１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ／ＣＨ３ＯＨ于具塞试管中，剧烈振荡 ２
ｍｉｎ，６２℃酯化３ｈ。冷却后，加入２ｍＬ正己烷，充
分振荡后，静置分层，取正己烷相做ＧＣ ＭＳ分析。
１６２ 气相色谱条件
安捷伦ＨＰ６８９０气相色谱仪，ＨＰ ＩＮＮＯＷａｘｐｏ
ｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ极性柱（３００ｍｍ×０３２ｍｍ×
０５０μｍ），柱温升温程序：１５０℃保持 １ｍｉｎ，
１５０℃升温至 ２００℃（１０℃／ｍｉｎ），２００℃保持 ６
ｍｉｎ，２００℃升温至２５０℃（２℃／ｍｉｎ），２５０℃保持５
ｍｉｎ。进样口温度：２５０℃；检测器温度：２８０℃；进样
量：１μＬ；分流比：１０∶１；溶剂延迟时间：３ｍｉｎ。
１６３ 质谱条件
检测器离子源温度２３０℃，四极杆温度１５０℃；
电离能量７０ｅＶ；电离方式ＥＩ；测定方式：全扫描；扫
描范围：ｍ／ｚ３０～５００；扫描速率：１６１ｓｃａｎｓ／ｓ；溶剂
切除时间：３ｍｉｎ。
１６４ 脂肪酸含量计算
面积归一化法。
１．７ 菌株基因组ＤＮＡ的提取
采用ＳＤＳ裂解法提取ＥＩＭ １０基因组ＤＮＡ，具
体步骤见参考文献［１４－１５］。
１．８ １８ＳｒＲＮＡ基因的克隆
根据真菌的１８ＳｒＲＮＡ基因的保守序列，设计
一对引物（引物由 ＴＡＫＡＲＡ合成），其中正向引物
１８Ｆ：５’ＣＣＡＡＣＣＴＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＧＣＣＡＧＴＡ３’，
反向引物 １８Ｒ：５’ＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴＣＡＣＣＴＴ
ＣＣＴＣＴ３’。ＰＣＲ反应体系：１０×ＰＣＲ缓冲液（５
μＬ）、ｄＮＴＰ（４μＬ）、正向引物（１μＬ）、反向引物（１
μＬ）、ＴａＫａＲａＴａｑ（０２５μＬ，１２５Ｕ）、模板 ＤＮＡ
（２～５μＬ，０６～１５μｇ），蒸馏水补足至５０μＬ；ＰＣＲ
５７ 第２期 于爱群等：γ 亚麻酸产生菌ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０的筛选及分子鉴定
条件为：９５℃，５ｍｉｎ（９５℃：３０ｓ，５５℃：３０ｓ，７２℃：
１ｍｉｎ，共３０个循环）、７２℃：１０ｍｉｎ。
１．９ １８ＳｒＲＮＡ基因的连接与转化
取ＰＣＲ扩增、纯化后的１８ＳｒＲＮＡ基因，连接到
ｐＭＤ１８ ＴＶｅｃｔｏｒ上，转化感受态细胞ＥｃｏｌｉＤＨ５α，
涂布于含氨苄青霉素（Ａｍｐ）的ＬＢ重组子平板。
１．１０ 重组子的菌落ＰＣＲ
重组子在ＬＢ平板上３７℃培养１６～２０ｈ后，挑
取白色单菌落于２ｍＬ含Ａｍｐ的ＬＢ液体培养基中，
３７℃培养过夜。用 ｐＭＤ１８ Ｔ载体上的 Ｍ１３引物
进行菌落ＰＣＲ验证。ＰＣＲ反应体系组成及反应条
件同１８ＳｒＲＮＡ基因 ＰＣＲ，筛选阳性克隆子送上海
生工公司测序。
１．１１ １８ＳｒＲＮＡ进化树分析
用ＣｌｕｓｔａｌＸ１８软件将获得的 ＥＩＭ １０１８Ｓ
ｒＲＮＡ基因序列与已知的部分１８ＳｒＲＮＡ基因序列
进行多重比对，建立比对模型。用 Ｍｅｇａ４（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＥｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙＧｅｎｅｔｉｃｓＡｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｅｒｓｉｏｎ３０）程序
包生成１０００个自展数据集，采用邻位相连（Ｎｅｉｇｈ
ｂｏｒＪｏｉｎｉｎｇ）的距离算法［１６］，经 Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ计算多数
一致树，构建进化树。
２ 结果与分析
２．１ ＥＩＭ １０产生的脂肪酸组成
利用苏丹黑染色法，分离纯化到１００多株脂肪
酸产生菌，培养后提取油脂、ＧＣ ＭＳ测定其脂肪酸
组成，其中１株菌（ＥＩＭ １０）产脂肪酸（ＧＣ ＭＳ检
测结果）见图１，ＧＬＡ质谱鉴定见图２。结果表明：
ＥＩＭ １０油脂产率可达２２４０５０ｍｇ／Ｌ，十六烷酸
（Ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ，Ｃ１６：０）占总脂肪酸０９４％，棕
榈油酸（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１６：１ｎ ９）占总脂肪酸
４４６％，硬脂酸（ｓｔｅａｒｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：０）占总脂肪酸
１８４０％，油酸（ｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：１ｎ ９）占总脂肪酸
３７７８％，亚油酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：２ｎ ６）占总脂
肪酸 １０７３％，ＧＬＡ（Ｃ１８：３ｎ ６）占总脂肪酸
２７６８％。其中 ＧＬＡ占高度不饱和脂肪酸总量的
７２０８％，ＧＬＡ产量为６２００３ｍｇ／Ｌ。表明所筛选的
ＥＩＭ １０是ＧＬＡ优良生产菌株。
２．２ １８ＳｒＲＮＡ基因的获得
用１８Ｆ、１８Ｒ引物，以ＳｔｒａｉｎＥＩＭ １０基因组ＤＮＡ
为模板进行ＰＣＲ，ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳检测的
条带约１８００ｂｐ，与预计条带大小相符（图３）。
图１ ＳｔｒａｉｎＥＩＭ １０脂肪酸甲酯的总离子流图
Ｆｉｇ．１ ＴＩＣｏｆｆａｔｙａｃｉｄｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒｏｆＳｔｒａｉｎＥＩＭ１０
图２ ＥＩＭ １０ＧＬＡ的质谱图
Ｆｉｇ．２ ＭＳｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＬＡｏｆＳｔｒａｉｎＥＩＭ１０
２．３ 阳性克隆子的筛选与验证
用ｐＭＤ１８ Ｔ载体上的Ｍ１３±引物进行菌落
ＰＣＲ验证筛选阳性克隆子，琼脂糖凝胶电泳检测
ＰＣＲ产物（图４）。由图４可知，阳性克隆子出现大
６７ 生 物 加 工 过 程 第７卷
Ｍ—２００ｂｐＤＮＡ标准；１、２、３、４— １８ＳｒＲＮＡＰＣＲ产物
图３ １８ＳｒＲＮＡ基因的ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．３ ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ１８ＳｒＲＮＡｇｅｎｅ
小约１９００ｂｐ的条带，其大小为１８ＳｒＲＮＡ基因加用
ｐＭＤ１８ Ｔ载体上的Ｍ１３引物（约１００ｂｐ）的长度。
注：图中数值代表在１０００次取样中，各分类单元在该位置出现的概率
图５ ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０的１８ＳｒＲＮＡ基因进化树
Ｆｉｇ．５ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１８ＳｒＲＮＡ
２．４ １８ＳｒＲＮＡ基因系统进化树分析
阳性克隆子经测序得到 ＥＩＭ １０的１８ＳｒＲＮＡ
基因序列，并登陆 ＧｅｎＢａｎｋ（登录号：ＥＵ７９３９９９），
利用ＮＪ距离法构建的１８ＳｒＲＮＡ基因系统进化树
见图５。整个进化树分为三大类型：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ
Ｍ—２００ｂｐＤＮＡ标准；１—ＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｓａｍｐｌｉｆｉｅｄＭ１３±
图４ 阳性克隆子的菌落ＰＣＲ电泳图
Ｆｉｇ．４ ＣｏｌｏｎｙＰＣＲｏｆｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓ
型。Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型同属Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ目，其中Ⅰ型中
大多属于Ｐｉｌｏｂｏｌａｃｅａｅ科和Ｔｈａｍｎｉｄｉａｃｅａｓｅ科；Ⅱ型、
Ⅲ型均属于 Ｍｕｃｏｒａｃｅａｅ科；Ⅲ型存在 Ａｃｔｉｎｏｍｕｃｏｒ、
Ｈｙｐｈｏｍｕｃｏｒ和 Ｍｕｃｏｒ属；ＥＩＭ １０与 Ｍｕｃｏｒｒａｃｅｍｏ
ｓｕｓ、Ｍｕｃｏｒｐｌｕｍｂｅｕｓ、Ｍｕｃｏｒｒａｍｏｓｉｓｉｍｕｓ、Ｍｕｃｏｒｃｉｒ
ｃｉｎｅｌｏｉｄｅｓ同属Ⅱ型的一个分支，属于 Ｍｕｃｏｒ属，故
将其命名为ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０。
７７ 第２期 于爱群等：γ 亚麻酸产生菌ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０的筛选及分子鉴定
３ 结 论
１）利用苏丹黑染色法筛选获得的高产 ＧＬＡ的
ＥＩＭ １０进行了液体发酵培养，其菌体细胞收率为
１１８８ｇ／Ｌ，油脂质量分数为 １８８６％，油脂产率为
２２４０５０ｍｇ／Ｌ，ＧＬＡ量占菌体总脂肪酸量的
２７６８％，占高度不饱和脂肪酸总量的７２０８％，ＧＬＡ
产率为６２００３ｍｇ／Ｌ。
２）对 ＥＩＭ １０进一步克隆、测定其１８ＳｒＲＮＡ
基因序列，并构建其系统进化树。ＥＩＭ １０菌株与
Ｍｕｃｏｒｒａｃｅｍｏｓｕｓ、Ｍｕｃｏｒｐｌｕｍｂｅｕｓ、Ｍｕｃｏｒｒａｍｏｓｉｓｉｍｕｓ、
Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｏｉｄｅｓ同属一个分支，属于 Ｍｕｃｏｒ属，将
其命名为ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０。ＭｕｃｏｒｓｐＥＩＭ １０所
产油脂中，主要含有十六烷酸（ｈｅｘａｄｅｃａｎｏｉｃａｃｉｄ，
Ｃ１６：０）、棕榈油酸（ｐａｌｍｉｔｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１６：１ｎ９）、硬
脂酸（ｓｔｅａｒｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：０）、油酸（ｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：
１ｎ９）、亚油酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：２ｎ６）、ＧＬＡ（γ
ｌｉｎｏｌｅｎｉｃａｃｉｄ，Ｃ１８：３ｎ６），可以推测 ＧＬＡ是经过延
长酶和脱饱和酶的共同作用形成的。以上结果为
进一步获得ＧＬＡ产生相关酶的基因奠定了基础。
参考文献：
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ｂｏｒａｇｅａｎｄｌｉｎｓｅｅｄｏｉｌｆａｔｙａｃｉｄｓ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆｔｈｅＡｍｅｒｉｃａｎＯｉｌ
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［１０］ＳａｙａｎｏｖａＯ，ＳｍｉｔｈＭＡ，ＬａｐｉｎｓｋａｓＰ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｂｏｒａｇｅ
ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｃＤＮＡｃｏｎｔａｉｎｉｎｇａｎＮｔｅｒｍｉｎａｌｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｂ５ｄｏｍａｉｎ
ｒｅｓｕｌｔｓｉｎｔｈｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｆｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｄｅｌｔａ６ｄｅｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔ
ｔｙａｃｉｄｓｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ，１９９７，
９４（８）：４２１１４２１６．
［１１］ＣｅｒｔｉｋＭ，ＳａｋｕｒａｄａｎｉＥ，ＳｈｉｍｉｚｕＳ．Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅｄｅｆｅｃｔｉｖｅｆｕｎｇａｌ
ｍｕｔａｎｔｓ：ｕｓｅｆｕｌｔｏｏｌｓｆｏｒｔｈｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎａｎｄｏｖｅｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙ
ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄｆａｔｙａｃｉｄｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６
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８７ 生 物 加 工 过 程 第７卷