全 文 ：! 第 " 卷第 # 期
#$$% 年 % 月
生 物 加 工 过 程
&’()*+* ,-./)01 -2 3(-4/-5*++ 6)7()**/()7
809 #$$%
· #"! ·
化学法合成 :;<三肽的研究
宋明媚，鞠培培，曹建军，沈树宝!
（南京工业大学! 制药与生命科学学院，南京 #=$$$>）
摘! 要：采用二环己基碳二亚胺法（<&&）合成了二肽 ;19?@+4（A3B1）#，然后利用混合酸酐法得到全保护 :;<三肽：
3-5?@/7（CA#）?;19?@+4（A3B1）#三肽；最后在 DE F &的催化加氢下，将保护基一起脱掉而得到 :;<三肽的粗品。具体
研究了合成二肽及三肽的主要影响因素及其优化条件。在优化条件下，获得三肽的结晶干品，总得率为 %GH #I。
关键词：:;<；二环己基碳二亚胺；混合酸酐法
中图分类号：AJ#>H G#! ! ! ! 文献标识码：@! ! ! ! 文章编号：=JG# K "JGL（#$$%）$# K $$#" K $M
!"#$% &’ "() *%’"()*+* &, -./ "0+12)2"+$) 3% "() 4()5+467 5)"(&$
NAC; 8()7?O*(，,P D*(?4*(，&@A ,(0)?Q.)，NR6C N’.?S0-
（&-11*7* -2 T(2* N5(*)5* 0)E D’0/O059，C0)Q()7 P)(U*/+(V9 -2 W*5’)-1-79，C0)Q()7 #=$$$>，&’()0）
83*"064"：;19?@+4（A3B1）# E(4*4V(E* X0+ +9)V’*+(B*E S9 <&& O*V’-E，V’*) 3-5?@/7（CA#）?;19?@+4
（A3B1）# X0+ +9)V’*+(B*E S9 V’* O*V’-E -2 O(Y*E 0)’9E/(E*+Z <*?4/-V*5V*E :;< V/(?4*4V(E* X0+ -SV0()*E
S9 ’9E/-7*)0V()7 X(V’ DE F & 50V019+V .)E*/ 0 O(1E 5-)E(V(-)Z W’* ()21.*)5()7 205V-/+ -2 +*U*/01 5-)E*)+0?
V(-) /*05V(-)+ 0)E -4V(O.O 5-)E(V(-)+ () :;< +9)V’*+(+ X*/* /*+4*5V(U*19 ()U*+V(70V*EZ P)E*/ V’* -4V(?
O.O 5-)E(V(-)+，V’* V-V01 9(*1E -2 :;< 5/9+V01 X0+ %GH #I Z
9)% :&0$*：:;<；E(?5951-’*Y9150/S-E(O(E*（<&&）；O(Y*E 0)’9E/(E*+ O*V’-E
! ! :;<是由精氨酸（@/7）、甘氨酸（;19）、天冬氨
酸（@+4）" 个氨基酸组成的序列肽，是近几年来发现
的具有高生物活性的短肽序列之一。:;< 序列肽
能够竞争性抑制包括 [(S在内的各种粘附蛋白与血
小板的结合，从而抑制了 [(S 与血小板的结合［=?#］，
因此在未来的临床应用中，具有较好的前景。研究
还发现 :;< 序列肽在内皮细胞的识别、抗血栓、抗
血凝、抑制肿瘤、眼科诊治、治疗烧伤和皮肤溃疡等
方面具有重要的作用［#?"］。
本文研究化学法（<&& 法、混合酸酐法）制备全
保护 :;<三肽的合成工艺，探索反应时间、试剂、底
物配比等因素对合成全保护 :;<三肽的影响和尝试
在 DE F &的催化加氢下常温常压脱保护基的工艺。
;< 实验部分
=H =! 仪器及药品
@D=#$$$ T& F 8N F 8N N9+V*O 液质联用仪（ D6
N&\6]），D-10/V/-)(5 < 型旋光仪（N5’O(EV ^ ’0*)+5’
公司），WT&用硅胶 ;[#%M（青岛海洋化工厂），C*Y?
.+JG$ 型富氏变换红外 F拉曼光谱仪（C(5-1*V 公司），
]WM@型显微熔点仪（北京泰克仪器公司），#$$"?=#
! 收稿日期：#$$%?$M?#%
基金项目：国家自然科学基金（ C-H #$=GJ$=L，C-H #$"GJ$"M），江苏省自然科学基金（ C-H 3_
#$$"$LM），江苏省社会发展项目（C-H 3N#$$"$"$），国家 LJ" 项目（C-H #$$"@@#=>$M$）
作者简介：宋明媚（=>L$?），女，硕士研究生，研究方向：生物有机合成。
联系人：沈树宝，教授，博士生导师，W*1：$#%?L"%LG"M>万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 " 期
恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司），%&’()
*+)",, - ",. 旋转蒸发仪（瑞士 %&’(* 公司）。/0)
123/345673)"$, 冻干机（美国 89:2;3公司）。
二环己基碳二亚胺（<’’）和 =)羟基苯并三氮
唑（(>%?）均购自西安美联生物公司，天冬氨酸二苄
酯对甲苯磺酸盐（@AB（>%C6）"·83A）自制
［#］，D!)硝
基)D")叔丁氧羰酰精氨酸（%31)@2E（D>"）)>(）和
D")叔丁氧羰酰甘氨酸 %31)F67 为成都三高生物科
技有限公司生化试剂，全保护 F< 二肽标样（%31)
F67)@AB（>%C6）"）购自四川天三志生物公司，G4 - ’
催化剂（ =,H）购自上海化学试剂集团，氢气
（IIJ IIH）来自南京三乐电器总公司；其它试剂均
为分析纯。
=J "! 分析方法
中间体纯度以 8K’确认；产物纯度及得率分析
通过高效毛细管电泳（(G’L）测定，检测波长 ".#
M;，缓冲液磷酸盐缓冲液（,J $ H 8N@），样品溶于水
-乙睛，毛细管 #O . $; P .O 1;。产物定性分析采
用红外光谱 *+、核磁共振 =$ ’ D/+ 及质谱对 +F<
结构进行鉴定。
=J $! <’’法合成 F67)@AB（>%C6）"
=J $J =! %31)F67)@AB（>%C6）"的合成
取 %31)F67 ,J $O" E 溶于适量四氢呋喃，加入
(>%8 ,J "QO E，冷却，再加入 <’’ ,J #$Q E，冰浴搅
拌；称取 @AB（>%C6）"·83A =J ,$ E 溶于四氢呋喃并
滴加等摩尔三乙胺，一并加入上述溶液中搅拌 =, 9。
8K’显示原料点消失。停止反应，过滤，滤液减压浓
缩后得无色油状物，溶于乙酸乙酯，依次用 OJ . H碳
酸氢钠、饱和氯化钠和 .H柠檬酸溶液洗涤。取有
机相，无水硫酸钠干燥。减压蒸馏，石油醚结晶，得
固体。;B QQ R QI S，红外 *+ 与标样图谱一致：$
$=" 1; T=，)D( 伸缩振动；" IQ= 1; T=，’)( 伸缩振
动；= O.= 1; T=，’>)>+ 的 ’ U > 伸缩振动；= VQ"
1; T=，’>)D( 的 ’ U > 伸缩振动；= .$V 1; T=，’>)
D(的 D(弯曲振动；= =OV 1; T=，’)>)’伸缩振动；=
$QO 1; T=，= $VQ 1; T=，= $#, 1; T=，’（’($）$弯曲振
动。
=J $J "! 脱除 D)端保护基
取 ,J Q E %31)F67)@AB（>%C6）"溶于乙酸乙酯，加
入适量的 (’6 -乙酸乙酯溶液，冷却静置，得到羧基
保护二肽 F67)@AB（>%C6）" ,J VIQ E，;B =V# R =V.
S，/W $VIJ V，红外 *+ 表征如下：$ ",. 1; T=，)’>)
D(的 D(伸缩振动；= .OV 1; T=，)’>)D(的 D(弯
曲振动；= O$I 1; T=，)’>)D( 的)’>)伸缩振动。质
谱分析：［/ X=］U $O=，理论分子量 $O,。
=J #! +F<三肽的合成
=J #J =! 混合酸酐法制备 %31)@2E（D>"）)F67)@AB
（>%C6）"
将 " ;;36 %31)@2E（D>"）)>( 溶于适量的四氢
呋喃，T =, S搅拌，加入 " ;;36 D)甲基吗啡啉及 "
;;36氯甲酸异丁酯。$, ;0M后，加入 " ;;36 (’6·
F67)@AB（>%C6）"和 " ;;36 D)甲基吗啡啉的 Q ;K
8(N溶液。 T =, S继续搅拌 $, ;0M，室温反应 =J .
9。减压浓缩去溶剂。所得油状物溶于乙酸乙酯，用
. HDY(’>$、水、= ;36 - K (’6 和水依次洗涤，无水
硫酸钠干燥，减压浓缩去溶剂，石油醚结晶得固体产
物 %31)@2E（D>"）)F67 )@AB（>%C6）"，;B IQ R II S，，
红外 *+表征如下：$ $$,J =I 1; T=，)’>)D(的 D(伸
缩振动；= .#=J VQ 1; T=，)’>)D( 的 D( 弯曲振动；=
O$.J $I 1; T=，)’>)D(的)’>)伸缩振动。质谱分析：
［/ X=］U Q=V，理论分子量 Q=.。
=J #J "! 脱除 D)端保护基
取 =J ,, E %31)@2E（D>"）)F67)@AB（>%C6）"溶于
=, ;K 8N@ - <’/（=Z =）的混合溶剂，室温磁力搅拌
# 9，旋转蒸发蒸去 8N@ 和 <’/，得到黄色油状物，
加入冰乙醚析出白色粉末状固体。冰箱静置，离心
取出固形物后冻干保存，称重 ,J QV" E，得率 Q#J .H
（以 %31)@2E（D>"）)F67)@AB（>%C6）"计算）。;B IV
S。质谱分析：［/ X=］ U .O"，主要碎片解释如下：
."VZ 三肽丢失胍基保护基团)D>"；.=,Z 三肽 D 端
氨基)D("丢失；$=# Z )@AB)（>%C6）"，甘氨酸与天冬
氨酸形成酰胺键处断裂；"," Z )@2E（D>"），精氨酸
与甘氨酸形成酰胺键处断裂；=OOZ )@AB)（>%C6）"丢
失一苄酯保护基团。
=J #J $! +F<三肽
称取 =J , E 8N@·@2E（D>"）)F67)@AB（>%C6）"放
在 =,, ;K的三口圆底烧瓶中，加入 ., ;K甲醇和 .
;K冰醋酸，再加入 ,J = E =,H G4 - ’，常温常压下通
氢气 "# 9，磁力搅拌。反应结束后，过滤去除催化
剂，得到澄清液体，减压蒸馏除去甲醇，加入冰乙醚
析出白色沉淀，离心后冻干保存，称重 ,J #V. E，得率
是 I=J #H（按 8N@·@2E（D>"）)F67)@AB（>%C6）"计
算），;B ="Q S。红外 *+ 表征如下：$ $.I 1; T=，)
D( 伸缩振动；= VVQ 1; T=为 ’>)D(的 ’>双键伸缩
振动。质谱：［/ X=］ U $#O，理论分子量 $#V。万方数据
! "##$ 年 $ 月 宋明媚等：化学法合成 %&’三肽的研究 · "$! ·
!" 结果与讨论
"( )! &*+,-./（012*）" 的合成
将两底物摩尔比（134,&*+：-./（012*）"·53.）
分别控制为 "( $6 )，" 6 )，)( $ 6 )，) 6 )，) 6 )( $，)
6 " 和 )6 "( $，反应溶剂为 578，反应 )# 9；以产物
&*+,-./（012*）"计算得率，结果如图 ) 所示，发现
&*+,-./（012*）"得率在 )( $6 ) 达到最高 ::( : ;。
图 )! 两底物配比对 &’合成的影响
8<=( )! >??@4A. 3? AB3 C@D4ADEA. DF3GEA. 3E &’ +<@*H.
"( "! 134,-C=（I0"）,&*+,-./（012*）" 的混合酸酐
法合成
"( "( )! 底物浓度的影响
反应底物的浓度对成酐反应有很大的影响，本
实验分别用 #( #$、#( )$、#( "$、#( J$、#( K$、#( $$ F3* L
M 134,-C=（I0"）,07的混合酸酐和 &*+,-./（012*）"
反应，I,甲基吗啡啉与底物等摩尔加入（如图 "）。
实验表明，随着 134,-C=（I0"）,07 浓度的提高，反
应产率显著提高，到达 #( J$ F3* L M 后达到峰值
:K( );。可见，为了使混合酸酐能够很快与氨基组
分反应，采用高的反应浓度是有利的；但浓度如果过
高，沉淀出来的大量叔胺盐酸盐会影响有效的搅拌
和散热，这对反应的控制也是不利的。
图 "! 底物浓度的影响
8<=( "! >??@4A. 3? C@D4ADEA 43E4@EACDA<3E.
"( "( "! 叔胺加入量的影响
在形成混合酸酐时，叔胺不是简单的作氯化氢
（7N*）的受体，而是先与氯甲酸酯生成烷氧羰氨基
离子复合物，再与氨基酸羧基成酐。本实验在相同
底物配比条件下通过加入不同 I,甲基吗啡啉量研
究碱加入量对成酐反应的影响。（如图 J）。
图 J! 产物得率随 IOO加入量的变化
8<=( J! >??@4A. 3? IOO DF3GEA 3E +<@*H.
叔胺加入量过少则不能充分生成中间离子复合
物从而影响成酐反应的充分进行，而叔胺加入过量
会导致消旋，从而使得产率和产物纯度降低。实验
发现，当 I,甲基吗啡啉与氨基组分等摩尔加入时，,
&*+,-./（012*）"得率达 :K( ) ;（按 134,-C=（I0"）,
07计算）。
"( "( J! 反应溶剂的影响
分别采用乙酸乙酯、四氢呋喃（578）和乙睛作
为酸酐形成阶段溶剂都得到了较好的结果，三肽收
率分 别 为 PQ( Q;，:J( );，P:( ";，而 用 氯 仿
（N7N*J）和二氯甲烷（N7"N*"）作为溶剂，结果产率
较低（K#( " ;，$J( P ;）且产物不纯（如图 K）。
—%—>A9+*D4@ADA@；—&—578；—#—-4@A3E—’—N7N*J；—(—N7"N*"
图 K! 溶剂对得率的影响
8<=( K! >??@4A 3? .3*R@EA. 3E +<@*H.
万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 " 期
"% $! &’()*+,)&-.的合成
"% $% /! 脱 0端保护的时间
采用 /1 23 415 67& 8 9:;试剂脱除 / 22<+全
保护三肽的 =<> 基团，分别按 1% ?、/% 1、"% 1、$% 1 @
进行实验，实验序号分别为 /、"、$、A。具体实验结
果见表 /。
表 /! 不同脱保护时间对得率的影响
6BC+D /! EFFD>G GI序号
反应时间
8 @
9;7剂量
8 23
产物质量
8 (
得率
8 5
/ 1% ? /? 1% /// /#% "
" /% 1 /A 1% "#? $K% L
$ "% 1 /$ 1% A$? #$% ?
A $% 1 K 1% ?LA K$% K
从上表可以看出，随着脱保护基时间的延长，得
率相应的也在提高。一般脱除 $@ 后达到最大得率
KA% ?5。若按初始底物 =<>)&’(（0M"）)MN 计算，
则得率是 #"% #5。
"% $% "! 催化加氢
O+BP-等［?］人脱除硝基加氢时间为 /1 @，考虑
到使用的 QH 8 : 催化剂为国产试剂，为此延长加氢
时间至 "A @。同时，为防止在甲醇溶液中发生转酯
反应，而加入冰醋酸。得率为 4/% A5。若按 =<>)
&’(（0M"）)MN计算，则得率为 ?L% "5。
!" 结" 论
$% /! 本文采用 9)*)R 合成路线，先合成羧基保
护 *9二肽，再合成全保护 R*9 三肽，合成相对简
单，提纯较容易，对 * 氨基的保护也可以在较温和
方便的条件下脱落，减少副反应的发生。
$% "! 9:: 法合成 *+,)&-.（M=S+）"二肽，反应时间
/1 @，=<>)*+,：&-.（M=S+）"·6<-的摩尔比为 /% ?T /
时达到最大得率 LL% L 5；=<>)&’(（0M"）为 1% $?
2<+ 8 3，0)甲基吗啡啉与氨基组分等摩尔加入，溶剂
为四氢呋喃时，混合酸酐法合成 =<>)&’(（0M"）)*+,)
&-.（M=S+）"达到最大得率为 LA% / 5。上述两种化
学法相结合制备全保护 R*9 肽取得了较为理想的
结果。
$% $! R*9三肽粗品是由 67&·&’(（0M"）)*+, )&-.
（M=S+）" 催化加氢 "K U $1 @ 得到的，总得率为
?L% "5（按 =<>)&’(（0M"）)MN计算）。
$% A! 相比较 9:: 法，混合酸酐法的优点就是反应
速度快，不易引起消旋，用于成酐的氯甲酸试剂便
宜，可以说混合酸酐法是大规模制备多肽的一条理
想工艺路线。
参考文献：
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2IJD HD’IYBGIYD-［W］X W M’( :@D2，/4#"（"L）：A 11#)A 11KX
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万方数据