全 文 ：书! 第 " 卷第 # 期
#$$% 年 % 月
生 物 加 工 过 程
&’()*+* ,-./)01 -2 3(-4/-5*++ 6)7()**/()7
809 #$$%
· :! ·
辅因子再生研究进展
蔡! 谨:，杨! 晟#!，许建和"，袁中一;
（:<浙江大学 材料与化学工程学院，杭州 ":$$#=；
#<中国科学院上海生命科学研究院 植物生理生态研究所分子微生物学开放实验室，上海 #$$$"#；
"<华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 #$$#"=；
;<中国科学院上海生命科学研究院 生物化学与细胞生物学研究所，上海 #$$$":）
摘! 要：许多有价值的酶催化反应都需要辅因子的参与。因为辅因子价格昂贵，所以，在酶催化工业应用中，需要
实现辅因子原位再生。经过几十年研究，出现了酶法、化学法、电化学法、光化学法和基因工程法等手段实现烟酰
胺类辅因子（>?@（A）B）、?CA、糖核苷酸等辅因子再生。对辅因子再生研究中取得的进展以及存在的问题进行讨
论。
关键词：辅因子再生；>?@（A）B；?CA
中图分类号：D%%#! ! ! ! 文献标识码：?! ! ! ! 文章编号：:E=# F "E=G（#$$%）$# F $$$: F $G
!"#$"%&&%& #’ (#)*(+#" "%$%’%"*+,#’
&?H ,():，I?>J K’*)7#，LM ,(0)N’*"，IM?> O’-)7N9(;
（:< &-11*7* -2 80P*/(01 Q &’*R(501 6)7()**/()7，O’*S(0)7 M)(T*/+(P9，B0)7U’-. ":$$#=，&’()0；
#< V0W-/0P-/9 -2 8-1*5.10/ 8(5/-W(-1-79，H)+P(P.P* -2 A10)P A’9+(-1-79 0)X 65-1-79，K’0)7’0( H)+P(P.P*+ 2-/ 3(-1-7(501 K5(*)5*+，
&’()*+* ?50X*R9 -2 K5(*)5*+，K’0)7’0( #$$$"#，&’()0；
"< KP0P* Y*9 V0W-/0P-/9 -2 3(-/*05P-/ 6)7()**/()7，60+P &’()0 M)(T*/+(P9 -2 K5(*)5* 0)X C*5’)-1-79，K’0)7’0( #$$#"=，&’()0；
;< H)+P(P.P* -2 3(-5’*R(+P/9 0)X &*11 3(-1-79，K’0)7’0( H)+P(P.P*+ 2-/ 3(-1-7(501 K5(*)5*+，&’()*+* ?50X*R9 -2 K5(*)5*+，K’0)7’0( #$$$":，&’()0）
-.&+"*(+：&-205P-/NX*4*)X*)P *)U9R*+ 50P019U* R0)9 .+*2.1 /*05P(-)+< @.* P- P’* ’(7’ 5-+P -2 P’* 5-205N
P-/+，() +(P. 5-205P-/ /*7*)*/0P(-) (+ /*Z.(/*X 2-/ 4/*40/0P(T* 0441(50P(-)+< ?2P*/ P[- X*50X*+ -2 /*+*0/5’，
T0/(-.+ 5-205P-/+，+.5’ 0+ >?@（A）B，?CA，+.70/ ).51*-P(X*+ 50) )-[ W* /*7*)*/0P*X .+()7 *)U9R0P(5，
5’*R(501，*1*5P/-5’*R(501，4’-P-5’*R(501 -/ 7*)*P(5 *)7()**/()7 W0+*X R*P’-X+< C’* /*5*)P 0XT0)5*+ ()
5-205P-/+ /*7*)*/0P(-) 0/* /*T(*[*X () P’(+ 404*/<
/%0 1#"2&：5-205P-/ /*7*)*/0P(-)；>?@（A）B；?CA
! ! 因具有高效、专一、反应条件温和及活性容易控
制等优良特性，生物催化剂———酶在工业生产上获
得了越来越广泛的应用。酶可用于催化水解、合成、
氧化、还原、能量或基团转移等反应。除了水解酶类
外，很多酶促反应必需有辅基或辅酶等有机辅因子
的参与。辅因子价格昂贵，工业生产中不断添加辅
因子显然是不可行的。辅因子的保留和循环再生是
降低生产成本的重要环节。此外，辅因子再生还具
有促进反应、简化产物分离、减少辅因子的产物抑制
等作用［:］。
目前，辅因子再生的研究和应用主要集中在烟
酰胺类辅因子（>?@（A）B）、?CA、糖核苷酸和 "\N磷
! 收稿日期：#$$%N$;N$"
作者简介：蔡! 谨，男，副教授，研究方向：生物化工。万方数据
! · "! · 生物加工过程 第 # 卷第 " 期
酸腺苷$%&$磷酸硫酸（’(’)）等。*(+（’）, 和 (-’
是两个最重要的辅因子。尤其是前者，它所参与的
反应约占待开发酶促反应工艺的 ./0。辅因子再
生手段主要有化学法、酶法、电化学法、光化学法和
基因工程法。化学法是利用一些化学试剂（如吩嗪
甲基硫酸盐、黄素衍生物）与辅因子的氧化还原反
应来实现辅因子再生。酶法是被研究和应用最多的
再生手段，利用耦合酶催化氧化还原反应，实现辅因
子由氧化态（或还原态）到还原态（或氧化态）的再
生。电化学法是通过电极的电子传递直接实现辅因
子再生，不需要引入其它酶和底物，避免了副产物。
光化学法是含有光敏剂、电子载体、电子供体和酶等
要素的反应系统。基因工程法是通过 +*( 操作技
术构建含有偶联酶系的工程菌，在完整细胞内完成
辅因子的再生和目的产物的生产。
辅因子的种类和数量很多，常见的辅因子及其
代表性再生方法如表 1 所示［"］。
表 1! 生物转化中常见辅因子及其原位再生方法
-2345 1 ! 678879 :7;2:<7=> =5?@A=5B ;7= 3A7<=29>;7=8259<2A<@ =5F595=2
辅因子 反应类型 代表性再生方法
*(+ G 脱氢 谷氨酸脱氢酶和 !酮戊二酸
*(+, 加氢 甲酸脱氢酶和甲酸
*(+’ G 脱氢 谷氨酸脱氢酶和 !酮戊二酸
*(+’, 加氢 葡萄糖脱氢酶和葡萄糖
(-’ 磷酰基转移 乙酸激酶和乙酰磷酸
糖核苷酸 糖基转移 细菌偶联
辅酶 ( 酰基转移 磷酸酰基转移酶和酰基磷酸酯
’(’) 磺酰基转移 芳基磺基转移酶"和 #$硝基苯硫酸盐
)腺苷甲硫氨酸 甲基转移 尚无实例
黄素 氧化 自我再生
磷酸吡哆醛 氨基转移 自我再生
生物素 羧化 自我再生
金属卟啉复合物 过氧化，氧化 自我再生
辅因子再生系统的效率通常用辅因子的转换数
!"（ <@=97E5= 9@835=）和总转换数 !!"（ <7<24 <@=97E5=
9@835=）衡量。通常认为 !!"达到 1/# H 1/%的生物
转化工艺在经济上可行。
!" 辅因子固定化
目前的辅因子再生大多是原位再生（ A9 >A<@
=5F595=2过氧化还原等反应实现辅因子再生。
1I 1! 辅因子固定在载体上
一般可通过吸附、共价结合和包埋等方式将酶
固定在载体上。酶与辅因子共固定化的结果使它们
处于相对接近的区域，反应活性较好。例如，以对氨
基苯甲酰乙基（(J)K）$交联琼脂糖作载体，通过戊
二醛共价交联将乳酸脱氢酶（ L+,）、醇脱氢酶
（(+,）和 *(+ G共价固定［#］。也可以只将辅因子
共价结合到载体上，而将酶分子包埋到凝胶空隙中。
有报道将偶联酶系溶液以小液滴形式分散封入凝胶
颗粒中。因减少了对酶分子的剪切影响及 *(+ G外
泄，故其反应活性保持时间长。
1I "! 膜反应系统
利用膜反应系统可高效率实现酶促反应与辅因
子再生反应的耦合。
中空纤维超滤膜酶反应器可提供较大膜面积，
膜将酶隔离在管内，而底物与辅因子连续通过并扩
散进入管内参与反应，产物则逆向扩散后被带出。
当酶浓度较高时，由于生物亲和作用，结合在酶分子
上的辅因子比例增高。酶起到“吸附剂”作用而使
辅因子“固定”。
M2=><59则使用纳滤膜将 *(+, 和酶保留在一
起，这样，酶膜反应器中辅因子用量可减少 N/0，
!!"增加 #I . 倍［.］。
负电荷膜常用来截留反应器中的辅因子。截留
作用通过带有负电荷的辅因子与膜之间的静电斥
力。OP58A等人采用 *-Q$N.1/ 膜构建带电膜反应
器，膜对 *(+’（,）的截留率达 RN0，辅因子的循环
次数达 1/S /// 次［%］。
1T #! 辅因子大分子化
为了使膜更有效地截留辅因子，可以将小分子
*(+ G、*(+’ G或 (-’共价结合到聚乙二醇（’KU）、
葡聚糖或聚乙烯亚胺等水溶性高分子上，再与酶一起
封在膜反应器中连续反应。’KU的聚合链上只有两
个连接末端，空间位阻较小，且水溶性高。M@42 等人
将 *(+,共价结合到相对分子质量为 1/ /// 或 "/
/// 的 ’KU 分子上，形成 ’KU$1/ ///$*(+（,）或
’KU$"/ ///$*(+（,）。大分子化 *(+, 和亮氨酸脱
氢酶（L5@+,）一起被截留在膜反应器中，进行连续酶
反应［S］；他们还比较了在几种水溶性聚合物固定 (-’
的效果。’KU$*S$氨乙基$(-’ 是合适的大分子衍生
物，可参与需 (-’的酶反应或 (-’再生反应［N］。
#" 烟酰胺类辅因子的再生
烟酰胺类辅因子以两种形式存在：还原态的万方数据
! "##$ 年 $ 月 蔡! 谨等：辅因子再生研究进展 · %! ·
&’(（)）*和氧化态的 &’(（)）+。依赖 &’() +的
酶促反应要比依赖 &’( +的酶促反应少，前者大约
是后者的 , - .［/］。它们都很贵，还原型的价格比氧
化型更高，且更不稳定。
"0 ,! 化学法
早期，人们曾用化学法进行 &’( +和 &’(* 的
再生。如利用酚嗪甲基硫酸盐（)12）、亚甲基蓝和
黄素衍生物等化学试剂从还原型辅因子接受电子，
将 &’(*氧化成 &’( +。以连二亚硫酸盐作为还原
剂使 &’( +还原成 &’(*。但是，化学法缺乏特异
性、辅因子容易钝化，且化学试剂会污染产物，所以，
现在基本不提倡用这类方法。
"0 "! 酶! 法
烟酰胺类辅因子再生研究和应用最多的是酶
法。这种酶促反应与辅因子再生耦合的方式有两
种：偶联酶再生和单酶再生。偶联酶再生是用一种
酶使 &’(（)）+还原成 &’(（)）*，而另一种酶使
&’(（)）*氧化成 &’(（)）+。常利用醇脱氢酶、乳
酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶等脱氢酶类为催化剂作用
于醇、乳酸或葡萄糖等廉价底物来实现辅因子的再
生。
偶联酶再生中，甲酸 -甲酸脱氢酶（3(*）体系
是最成功的再生系统，并已实现工业生产应用。其
优势在于反应不可逆，只产生 45"一种副产物。
甲酸 - 3(*再生系统耦合亮氨酸脱氢酶 -丙酮
酸系统的产 67亮氨酸膜反应器中，实现了 &’(* 再
生（图 ,），转化率高达 8#9 : 880 ;9，并可维持 "$
<［=］。
图 ,! 伴甲酸脱氢酶（3(*）催化 &’(* 再生的亮氨酸合成
示意图
3>?0 ,! 2@ABCB DE FAB BGHICJF>@ KIGFABK>K DE 67LBM@>GB N>FA FAB
OB?BGBOJF>DG DE &’(* PI EDOCJFB （3(*）
3(*的缺点是特异性差，对有机溶剂敏感，产
品的成本较高。
葡萄糖 -葡萄糖脱氢酶系统对于 &’(* 的再生
有很好的效果［8］。来自蜡状芽孢杆菌（QJ@>LLMK @B7
OBMK）的葡萄糖脱氢酶可以像 3(* 一样接受 &’( +
或 &’() +，但酶的费用较高。
乙醇 -醇脱氢酶系统具有很大的吸引力，因为它
们都很便宜。然而系统产生的乙醛对醇脱氢酶有抑
制作用。于是有人设计了去除乙醛的方法，如氮气
清除法［,#］、亚硫酸氢钠法［,,］或添加乙醛脱氢酶［,"］
等方法。
亚磷酸盐脱氢酶（)FR(）催化亚磷酸盐成磷酸
盐的氧化反应，同时把 &’( +还原成 &’(*。这种
酶也能还原 &’() +，但再生效率低。SOF>K 等构建
了基于 )FR( 的 &’(* 再生系统（图 "）。这个系统
在热力学上有利，产品也容易分离［,%］。
图 "! 利用亚磷酸脱氢酶（)FR(）的 &’(*再生系统
3>?0 "! 2@ABCJF>@ OBTOBKBGFJF>DG DE FAB MKB DE TADKTA>FB DG BGHICB
*>OJUJNJ等在羟基类固醇脱氢酶催化雄（甾）
烯二酮（ JGDGB）转化成雄甾酮（ JGDGB）的反应中，利用反胶束系统偶联酵母醇脱氢酶
（V’(*）催化 &’(* 再生。与水系统相比较，反胶
束中酶的稳定性提高了，&’(* 的 !!" 也增加了 ;
倍。该系统对有机相酶反应十分有利［,.］。
微生物体内的氢化酶能够活化双原子氢。激烈
热球菌（#$%&’&’’() *(%+&()）氢化酶!可利用廉价的
分子氢为原料再生 &’()*。氢化酶能在较宽温度
范围（"# : /# W）保持高度稳定性［,$］。
某些酶的底物专一性不高，这样，就可以用同种
酶催化另一种底物来完成辅因子再生，即单酶再生。
例如，醇脱氢酶既可以在 &’() +存在下氧化甾族化
合物，又可将第二种底物———异丙醇的消耗来实现
&’() +的再生。
为了提高单酶再生的热力学推动力，一般是增
加辅底物浓度，但这容易抑制酶的生产活性。采取
交联酶结晶技术（46X4K）可以在较高辅底物浓度下
保持脱氢酶生产活性。在结晶时把辅因子一起放进
去。在马肝醇脱氢酶（*6’(*）再生 &’(* 的实验
中，交联酶结晶制品达到可溶性酶的 8#9活性，在 %
个月后仍保持全部活性［,=］。
对于从还原态的 &’(（)）* 到氧化态的 &’(万方数据
! · "! · 生物加工过程 第 # 卷第 $ 期
（%）&的再生研究和应用较少。一个比较有前景的
方法是利用 ’()*氧化酶催化的 ’()* 氧化反应，
生成 ’() &和 *$+或 *$+$
［,-］。
$. #! 电化学法
电化学法再生 ’()（%）的研究较广泛。它是通
过电极的电子传递直接再生辅因子。其反应原理
为：’() & & * & & $! / ’()*。早期多采用直接电
解还原法，但再生效率低。后来出现了间接电解还
原法，即需要有甲基紫精（012345 6785891:）等电子介
体参与（图 #）［,;］。
图 #! 电化学直接法（(）和间接法（<）实现辅酶!再生示意图
0=)+>，和 0=)?=)分别代表氧化态和还原态电子介体
@79. # ! AB31CD27B E1FE1G1:2D278: 8H 1:I4C1JBD2D54I1K 151B2E8J
B31C7BD5 G4:231G7G 67D K7E1B2（(）8E 7:K7E1B2（<）E191:J
1ED278: 8H ’()*
电化学法面临的问题较多，如缺乏特异性，反应
速度低，需要高电压才能直接氧化或还原辅因子，而
且电极易沉积污垢，辅因子聚合以及电极远处的酶
无法发挥催化活性等等。
近年发展的方法是采用电极表面改性［,L，$M］和
新电子介体来解决这些问题。?NFF1E2 等用铑化合
物［OF（01）P ?3（Q7F4）O5］作为电子介体，铑化合物
能在较宽 F* 和温度范围保持稳定和活性，介体和
’() &的反应不需要酶催化［$,］；AB3E8K1E 用 (（$，$SJDI7:8Q7G（#J12345Q1:I8237DI857:1J TJGN5H8:D21））
作电子介体再生 ’()*，这个电化学反应成功用于
马肝醇脱氢酶催化内消旋二醇到手性内酯的反
应［$$］；UD91:V:1B32等人开发了基于钌（"）和铑
（#）有机金属化合物的系统，直接将氢气和烟碱类
辅因子偶联再生［$#］。
$. "! 光化学法
光敏剂、电子载体、电子供体和酶构成了光化学
还原再生辅因子系统。例如，光照射光敏剂
?N（QF4）$ &# 形成激发态!?N（QF4）
$ &
# ，后者向人工电
子受体甲基紫精（0W$ &）转移电子形成还原态
0W &，0W & 在铁氧化还原蛋白J’()% & 还原酶
（@)?）作用下还原 ’()% &，被氧化的光敏剂再被牺
牲性电子供体（’*"）# =)R( 还原成有活性的还原
态（图 "）［$"］。
图 "! @)?、人工电子受体（0W$ &）和光敏剂（?N（QF4）$ &# ）参与的 ’()（%）*光化学还原再生示意图
@79. "! %3828G1:G727I1K E191:1ED278: 8H ’()（ %）* B8HDB28E 7:68567:9 1:I4C1G（ @)?）D:K 231 DE27H7B7D5 151B2E8:J2ED:GH1E C1K7D28E
0W$ &，D:K NG7:9 ?N（QF4）$ &# DG D F3828G1:G727I1E
! ! 光化学再生的一个形式是利用一个整合半导体
光催化剂的生物材料。光激活半导体产生一个电子
空穴对，导电带成为还原 ’() &的电子源，而价电子
带孔穴能氧化可溶性电子供体。在电子供体（如巯
基乙醇，甲酸盐）存在下，半导体上光致还原可溶性
电子载体 0W$ &，然后用硫辛酰胺脱氢酶（X7F)*）再
生 ’()*［$P］。若将依赖 ’() &的酶直接固定在半
导体上，则没有任何电子载体也能实现 ’()* 再
生。如图 P，将依赖 ’() &的氢化酶固定到硫化镉
（OKA）半导体颗粒上，构成一个 ’() &、OKAJ氢化酶
和甲酸盐的光化学再生系统。从半导体到酶实现直
接电子转移，其中甲酸盐为牺牲性电子供体［$T］。
光化学再生法是一种有潜力的辅因子再生途
径，但是，光化学反应系统比较复杂，实际应用比较
困难，可用的光催化剂也很有限。
$. P! 基因工程法
现代基因工程技术可以通过导入特定外源酶基
因，构建适合再生辅因子的新菌株。将所需的几种万方数据
! "##$ 年 $ 月 蔡! 谨等：辅因子再生研究进展 · $! ·
图 $! %&’(氢化酶和牺牲性电子供体（)*+&）构成了 ,-).光
化学再生系统
/012 $! 3+1+4+*56074 78 ,-). 9: 5 ;<767=<+>0=5? @:@6+> =74(
@0@6041 78 %&’(<:&*71+45@+ 54& A@041 87*>56+ 5@ 5 @5=*0(
80=05? +?+=6*74 &747*
酶基因以适当比例重组，所得工程菌对酶反应和辅
因子再生的操作更加简捷。活细胞还可利用细胞原
有酶系从廉价葡萄糖再生 ,-)（B）.［"C，"D］。采用固
定化重组基因工程菌株细胞或其粗提物将会使辅因
子再生变得更加简便、有效。
!" -EB F ,EB再生
磷酰基转移的酶促反应一般都需三磷酸核苷酸
（,EB@）参与，-EB 最为常用。,EB@ 价格昂贵，所以
发展经济有效的 -EB F ,EB再生系统对于许多生物活
性化合物的合成必不可少。现有的方法都是利用偶
联酶反应。常用的酶有 G 种：醋酸激酶、丙酮酸激酶
和多磷酸激酶（BBH）。
用酵母菌、产氨棒杆菌或产氨短杆菌进行全细胞
-EB再生已有报道（图 I）［"D，"J］。
图 I! 酵母菌（-）和产氨棒杆菌（K）全细胞 -EB再生示意图
/012 I! L<7?+(=+?? ;*7=+@@+@ M06< -EB *+1+4+*56074 9: A@041（-）:+5@6 54&（K）!2 "##$%&"’(%() =+??@ *+@;+=60N+?:
! ! -EB再生的另一个途径是利用多聚磷酸盐（;7(
?:（B）），由 -OB再生 -EB。多聚磷酸盐是正磷酸盐
的线性聚合体，含有高能磷酸键，稳定性高和价格
低。3+@40=P和 Q+<4&+* 设计的 -EB 再生系统包括
;7?:（B）、-OB 磷酸转移酶（ B-B）和腺苷酸激酶
（-&H）［G#］。它已成功用于己糖激酶合成葡糖(I(磷
酸；’<095 等则同时使用黄色粘球菌（*+,$-$--.)
,"%/0.)）的 B-B 和大肠杆菌重组 BBH，从 -OB 和
;7?:（B）再生 -EB。通过与乙酰辅酶 -合成酶偶合，
已成功用于乙酰辅酶 - 合成，系统添加无机焦磷酸
酶（B;5@+）可减轻 BB0的抑制作用，并提供额外的推
动力，如图 C［GR］。
#" 糖核苷酸再生
具有高度区域和立体选择性的糖基转移酶在大
规模制备寡糖中具有重要价值。然而糖基转移酶需
要糖核苷酸作为辅因子，也需要原位再生。寡糖生
物合成中涉及多种糖基转移酶，但糖核苷酸在哺乳
动物中只涉及 J 种：S)B(T?=、S)B(T5?、S)B(T?=S-、
%OB(,+A-=、 T)B(O54、 T)B(/A=、 S)B(T?=,-=、
-)B(U:?和 S)B(T5?,-=［G"，GG］。
图 C! B-B(BBH -EB再生系统与乙酰 %7- 合成酶及无机焦
磷酸酶催化反应偶联
/012 C! E<+ B-B(BBH -EB *+1+4+*56074 @:@6+> 8*7> -OB =7A(
;?+& M06< 6<+ 5=+6:?(%7- @:46<+60= *+5=6074
糖核苷酸再生方法中最引人注目的是细菌偶联
法（95=6+*05? =7A;?041）。例如，从乳清酸生成 SEB的万方数据
! · "! · 生物加工过程 第 # 卷第 $ 期
产氨棒杆菌与表达糖核苷酸合成酶的重组大肠杆菌
之间的细菌偶联（图 %）。这种方法已成功应用于糖
核苷酸生产，包括 &’()*+,-.（/0 1 2 3），4()56.)
*-.（07 8 1 2 3）和 54()9,.（/%7 8 1 2 3）［#8，#:］；通过
联合产氨棒杆菌和两种重组大肠杆菌可以得到
&’()*+,-.。这两种重组菌株分别表达 &;( 合酶
（转化 <;( 到 &;(）和 &’()*+,-. 合酶（转化
*+,-. 和 &;( 到 &’()*+,-.）［#8］。&’()*+,-. 或
54()9,.再生系统与糖基转移酶重组大肠杆菌相偶
联，就可以大规模生产唾液酸三糖、球形三糖和
3+=>? @等重要寡糖。同样的方法也可以用来生产
*+,-.［#"］。
图 %! 能将乳清酸转化为 <;(的产氨棒杆菌，及分别表达 &;( 合成酶（ABC5）基因和 &’()*+,-. 合成酶基因的两个重组 !)
7 "#$%菌株的菌体偶联构成了 &’()*+,-.再生系统。系统进一步与重组唾液酸转移酶 !7 "#$% 表达菌株偶联后，可利用
*+,-.，乳清酸和乳酸为原料大规模生产 #D唾液酸
9>17 % ! ;E+ &’()*+,-. C+1+F+CGH>IF ?B?H+J ,?>F1 KG.H+C>G6 .I,A6>F1L ;E+ ?B?H+J .IF?>?H IM &’ ())#*%(+,*,-，=E>.E .IFN+CH? ICIH>.
G.>O >FHI <;(，GFO H=I C+.IJK>FGFH !7 "#$% ?HCG>F? +PAC+??>F1 HE+ &;( ?BFHE+HG?+ 1+F+（ABC5）GFO HE+ &’()*+,-. ?BFHE+HG?+
1+F+（F+,-），C+?A+.H>N+6BL 9,CHE+C .I,A6>F1 IM G C+.IJK>FGFH !7 "#$% ?HCG>F IN+C+PAC+??>F1 HE+ !（$)#）?>G6B6HCGF?M+CG?+ 1+F+
6+O HI HE+ 6GC1+)?.G6+ ACIO,.H>IF IM #D?>G6B66G.HI?+ ,?>F1 *+,-.，ICIH>. G.>O GFO 6G.HI?+（3G.）G? ?,K?HCGH+?
! ! 细菌偶联法是一种较经济的糖核苷酸再生方
法。但由于过程中同时使用多种菌株，菌株间中间
产物的运输和同时维持不同菌株生长都可能给实际
应用带来问题。最近有人提出了一种新方法，只采
用一种同时含有糖核苷酸再生和寡糖合成所需的全
部酶的超级重组菌（?,A+CK,1）。Q>J将其用于 &’()
*+,-. 再生［#0］。重组大肠杆菌中同时表达 &’( 激
酶、唾液酸缩醛酶和 &’()*+,-. 合成酶；类似地，分
别将编码半乳糖转移酶、<4()半乳糖)8)异构酶和蔗
糖合酶的基因重组到同一大肠杆菌［#%］。通过选择
不同的半乳糖转移酶，这些重组菌就被用于大规模
生产生物医药重要三糖———5G6!/，83G.（ 16IKIHC>)
I?+）和 5G6!/，#3G.（!)5G6 +A>HIA+），同时伴有 <4()
5G6的再生。
!" (-(R再生
辅因子 #D)磷酸腺苷):D)磷酸硫酸（(-(R）是生
物系统内通用的硫酸盐供体。在磺基转移酶催化合
成一些重要糖和糖肽硫酸盐反应中都需要 (-(R 参
与。价格昂贵、不稳定以及产物抑制等问题使得相
关生产应用中需要 (-(R的原位再生。
最早的 (-(R 酶法再生是一个复杂多酶体系。
它由 -;( 硫酸化酶、-(R 激酶、#D)核苷酸酶、肌激酶
和丙酮酸激酶组成［#S］。它模仿天然的代谢循环过
程，硫酸盐先转移形成 -;(，-;( 再被 -;( 硫酸化酶
和 -(R激酶转化为 (-(R。最近出现了一种 (-(R 的
单酶再生系统［8T］，如图 S。这种方法使用重组的鼠肝
芳基磺基转移酶"，并用 #)硝基苯酚硫酸酯盐（#)F>)
HCIAE+FB6 ?,6MGH+）作为硫酸盐供体。它被认为是目前
制备硫酸糖（.GCKIEBOCGH+ ?,6MGH+?）的最有效方法。
#" 结论和展望
辅因子再生的种类和手段很多，每种方法都有
自己的优势和不足。确立再生策略的主要依据在于万方数据
! "##$ 年 $ 月 蔡! 谨等：辅因子再生研究进展 · %! ·
酶的稳定性、细胞中酶活力水平、底物和产物对酶活
力和细胞存活的影响等等。在生产实践中，更要考
虑酶、试剂和反应系统的费用等因素。
虽然，近 "# 多年来辅因子再生的研究取得了很
大的进展，但真正在工业上成功应用的实例还不多。
然而，伴有辅因子参与的酶反应在许多工业应用中
却显得越来越重要，辅因子再生技术相对落后的状
态已成为制药生物酶在大规模工业生产应用中的一
个瓶颈。
选择更适宜的反应器和运用酶法，减少酶和辅
因子用量，开发性能更优、更经济的新型原位辅因子
再生系统，尤其是结合蛋白质工程和基因工程的手
段是解决问题的关键。可以预料，随着各种经济有
效的辅因子再生技术的发展，生物催化在医药和化
工等领域的应用将会越来越广泛。
图 &! 重组的鼠肝芳基磺基转移酶和 !’硝基苯酚硫酸酯盐构成的 ()(*单酶再生系统
+,-. &! ) ()(* /0-010/23,41 503647 8459/,:,1- 2 /0845;,1213 2/<= :>=?43/21:?0/2:0 217 !’1,3/49601<= :>=?230
参考文献：
［@］! A21 70/ B41C D)，E624 FG. H08013 70A0=495013: ,1 9’
8=043,70 /0-010/23,41［ I］. J>// K9,1 L,4308614=，"##M，@N：N"@’
N"O.
［"］! E624 FG，A21 70/ B41C< D). H0-010/23,41 4? 84?2834/: ?4/ >:0 ,1
;,48232=<:,:［I］. J>// K9,1 L,4308614=，"##M，@N：$PM’$P&.
［M］! 徐! 俊，楼一心.三元全酶系统的共固定化和辅酶再生［ I］.华
东化工学院学报，@&P&，@$（N）：NM#’NM$.
［N］! *00=;286 Q，Q/2-= R. S214?,=3/23,41 505;/210: ?4/ 84?2834/ /0301’
3,41 ,1 8413,1>4>: 01T<523,8 :<1360:,:［I］. U1T<50 G,8/4; V0861’
4=，@&&%，"#：MP&’M&".
［$］! WC05, G，Q4,T>5, S. W:6,523:> X. *4/;,34= 9/47>83,41 ,1 862/-07
505;/210 ;,4/02834/ Y,36 8401T<50 /0-010/23,41 :<:305 " :0=08’
3,A0 /032,15013 4? S)B(F ,1 2 8413,1>4>: /0283,41［I］. L,4308614=
L,401-，@&&#，MO（"）：@N&’@$N.
［O］! D,865211 H，D217/0< J，L>8C5211 )+，03 2=. J413,1>4>: 01T<’
523,8 3/21:?4/523,41 ,1 21 01T<50 505;/210 /2834/ Y,36 :,5>=3210’
4>: S)B（ F） /0-010/23,41［ I］. L,4308614= L,401-，@&P@，"M
（@"）：" %P&’" P#".
［%］! L0/C0 D，*86ZT FI，D217/0< J，03 2=. J413,1>4>: /0-010/23,41 4?
)V( ,1 01T<50 505;/210 /02834/ ?4/ 01T<523,8 :<1360:0:［ I］.
L,4308614= L,401-，"##N，M"（"）：@M#’@M&.
［P］! +2;0/ Q. L,43/21:?4/523,41: ,1 K/-21,8 J605,:3/<，N36 07［G］.
L0/=,1：*9/,1-0/’[0/=2-，"###.
［&］! D41- JF，B/>08C62550/ B\，*Y00/: FG. U1T<523,8 A:. ?0/501’
323,A0 :<1360:,:：360/54:32;=0 -=>84:0 706<7/4-012:0 8232=-010/23,41 4? S)B（(）F ?4/ >:0 ,1 01T<523,8 :<1360:,:［I］. I )5
J605 *48，@&P$，@#%：N #"P’N #M@.
［@#］G211::41 B，]2/::41 (K，G4:;286 Q. J4A2=013 01T<50’8401T<50
8459=0^0: 4? =,A0/ 2=8464= 706<7/4-012:0 217 S)B［ I］. G03647:
U1T<54=，@&P"，P&：N$%’NOP.
［@@］[217082:300=0 I(，]052= I. H07>83,A0 01T<5,8 :<1360:,: 4? ]’82/1,’
3,10 Y,36 /0-010/23,41 4? S)BF >:07［ I］. L>== *48 J6,5 +/ #，
@&P#（@’"，9/. "）：@#@’@#M.
［@"］ D41- JF，D6,30:,70: \G. U1T<50’8232=S)B（ (）F 84?2834/ /0-010/23,41 >:,1- 036214= _ 2=8464= 706<7/4’
-012:0 _ 2=706<70 706<7/4-012:0 217 5036214 _ 2=8464= 706<7/4-01’
2:0 _ 2=706<70 706<7/4-012:0 _ ?4/5230 706<7/4-012:0［ I］. I K/-
J605，@&P"，N%：" P@O’" P@P.
［@M］ I011,?0/ G[，)17/02 QD，D,==,25 D，03 2=. (64:96,30 706<7/4-01’
2:0：) A0/:23,=0 84?2834/’/0-010/23,41 01T<50［ I］. )1-0Y J605，万方数据
! · "! · 生物加工过程 第 # 卷第 $ 期
$%%$，&&’，&(：##)&*##)#+
［&’］,-./0/1/ ,，2/3-4/ 5，6/7/ 8，97 /:+ ;9<-=>9:9?7-@9 .9AB?7-=C =D /
>79.=-A -C / .9@9.>9A 3-?9::/. >4>793 1-7E 9CF43/7-? 5GH,*.9<9C*
9./7-=C［I］+ J-=?E93 KC< I，$%%#，&L：#M*’%+
［&M］N9.79C> ;，O.9-C9. P，@/C A9C J/C KQH，97 /:+ R./?7-?/: /SS:-?/*
7-=C> =D E4A.=<9C/>9 T D.=3 R4.=?=??B> DB.-=>B> D=. 5GHR, <9C9./*
7-=C /CA .9<9C9./7-=C［ I］+ I N=: Q/7 J：KCF43/7-?，$%%#，$’*$M：
#)*M$+
［&L］ U7 Q5，V/C< 6W，N/.<=:-C GP+ Q=D/?7=.*X=BCA ?.=>>*:-C09A 9C*
F439 ?.4>7/:>（QPKQ）=D /:?=E=: A9E4A.=<9C/>9［I］+ GC<91 QE93
TC7 KA KC<:，$%%%，#)：#"%*#"#+
［&(］R/.0 ,I，;9->9. QY，2=CA.B19-7 U，97 /:+ RB.-D-?/7-=C /CA ?E/./?*
79.-F/7-=C =D / 5GH, =Z-A/>9 D.=3 7E9 7E9.3=SE-:9 8E9.3B> 7E9.*
3=SE-:B> ,J"［I］+ KB. I J-=?E93，&))$，$%M，""&*""M+
［&"］H-Q=>-3= ;，V=C< Q,，H/C-9:> P，97 /:+ KCF439*?/7/:4>9A =.>4C7E9>->：9:9?7.=?E93-?/: .9<9C9./7-=C =D 5GH（ R）, D.=3 5GH
（R）B>-C< 397E4: @-=:=<9C /CA D:/@=9CF439>［ I］+ I Y.< QE93，
&)"& ’L：’ L$$*’ L$#+
［&)］H9[ :9[ ?=B:>*U9.@/7 2，J9.<9: G，J/>>9[ 9:9?7.=A9> D=. 5GH, =Z-A/7-=C -C =Z-A=.9AB?7/>9*?/7/:4>9A >4C7E9*
>->［I］+ I GSS: K:9?7.=?E93，$%%&，#&：& %)M*& &%&+
［$%］ 2/.4/0-C GG，J=X.=@/ YG，2/.4/0-C/ KK+ K:9?7.=.9AB?7-=C =D
5GH \ 7= 9CF43/7-?/::4 G?7-@9 5GH, /7 S=:4（59B7./:;9A）3=A-*
D-9A 9:9?7.=A9>［I］+ I K:9?7.=/C/: QE93，&))M，#))：&()*&"’+
［$&］ ;BSS9.7 ;，,9..3/CC U，U79?0E/C K+ KDD-?-9C7 -CA-.9?7 9:9?7.=*
?E93-?/: -C*>-7B .9<9C9./7-=C =D 5GH,：9:9?7.=?E93-?/::4 A.-@9C
9CF43/7-? .9AB?7-=C =D S4.B@/79 ?/7/:4>9A X4 H*PH,［ I］+ 897./*
E9A.=C P977，&)"(，$"：L M"#*L M"L+
［$$］U?E.=A9. T，U79?0E/C K，P-9>9 G+ TC >-7B 5GH .9<9C9./7-=C B>-C< $，
$[*/F-C=X->（ #*97E4:X9CF=7E-/F=:-C9*L*>B:D=C/79） /> /C 9:9?7.=C
7./C>D9. 39A-/7=.［I］+ I K:9?7.=/C/: QE93，$%%#，M’&：&%)*&&M+
［$#］V/<9C0C9?E7 RU，R9CC94 IN，,93X.9 ;8+ 8./C>-7-=C*397/:?/7/*
:4F9A .9<9C9./7-=C =D C-?=7-C/3-A9 ?=9CF439> 1-7E E4A.=<9C［ I］+
Y.，$%%#，$$：& &"%*& &"$+
［$’］N/CA:9. H，V-::C9. T+ U=:/. :-7/C=: -C /C 9CF439*?/7/:4F9A ?E93-?/: >4>793［ I］+ I G3 QE93
U=?，&)"’，&%L（&"）：M #M$*M #M#+
［$M］O=.9C ]，P/S-A=7 5，V-::C9. T+ RE=7=?/7/:4F9A .9<9C9./7-=C =D 5GH
（R）, X4 ?/A3-B3 >B:D-A9 /CA 7-7/C-B3 A-=Z-A9 >93-?=CAB?7=.>：
/SS:-?/7-=C> -C 9CF439 >4>7E9>->［ I］+ I N=: Q/7/:，&)""，’(（&）：
$&*#$+
［$L］ UEB3-:-C TG，5-0/CA.=@ ^^，R=S=@ ^Y，97 /:+ RE=7=<9C9./7-=C =D
5GH, BCA9. ?=BS:9A /?7-=C =D QAU >93-?=CAB?7=. /CA E4A.=<9*
C/>9 D.=3 G:?/:-<9C9> 9B7.=SEB> 1-7E=B7 9Z=<9C=B> 39A-/7=.>［ I］+
WKJU P977，&))$，#%L（$*#）：&$M*&$"+
［$(］U791/.7 IH+ H9E4A.=<9C/>9> /CA 7./C>/3-C/>9> -C />43397.-? >4C*
7E9>->［I］+ QB.. YS-C QE93 J-=:，$%%&，M：&$%*&$)+
［$"］KCA= 8，2=-FB3- U+ N-?.=X-/: Q=C@9.>-=C 1-7E Q=D/?7=. ;9<9C9./*
7-=C B>-C< O9C97-?/::4 KC<-C99.9A J/?79.-/［ I］+ GA@ U4C7E Q/7/:，
$%%&，#’#，M$&*M$L+
［$)］WB_-= 8，WB.B4/ G+ R.=AB?7-=C =D G8R D.=3 /A9C-C9 X4 J.9@-X/?79*
.-B3/33=C-/<9C9>［I］+ I W9.39C7 89?EC=:，&)"#，L&：$L&*$L(+
［#%］;9>C-?0 UN，]9ECA9. GIJ+ TC @-7.= G8R .9<9C9./7-=C D.=3 S=:4SE=*
>SE/79 /CA GNR X4 S=:4SE=>SE/79：GNR SE=>SE=7./C>D9./>9 /CA
/A9C4:/79 0-C/>9 D.=3 G?-C97=X/?79. _=EC>=C-- $&%G［I］+ GSS: KC*
@-.=C N-?.=X-=:，$%%%，LL：$ %’M*$ %M&+
［#&］2/39A/ G，UE-X/ 8，2/1/F=9 6，97 /:+ 5=<9C9./7-=C >4>793 B>-C< S=:4SE=>SE/79*GNR SE=>SE=7./C>D9./>9
/CA S=:4SE=>SE/79 0-C/>9［I］+ I J-=>?- J-=9C<，$%%&，)&：MM(*ML#+
［#$］ T?E-0/1/ 6，V/C< ;，V=C< Q,+ ;9<9C9./7-=C =D >BD=. 9CF43/7-? =:-<=>/??E/.-A9 >4C7E9>->［ I］+ N97E=A> KCF43=:，
&))’，$’(：&%(*&$(+
［##］JB:79. 8，K::-C< P+ KCF43/7-? >4C7E9>-> =D CB?:9=7-A9 >B［ I］+
O:4?=?=C_ I，&)))，&L：&’(*&M)+
［#’］ KCA= 8，2=-FB3- U，8/X/7/ 2，97 /:+ P/.<9*>?/:9 S.=AB?7-=C =D
QNR*59BG? /CA >-/:4:/79A =:-<=>/??E/.-A9> 7E.=BS:-C<［I］+ GSS: N-?.=X-=: J-=79?EC=:，$%%%，M#：$M(*$L&+
［#M］8/X/7/ 2，2=-FB3- U，KCA= 8，97 /:+ R.=AB?7-=C =D ‘HR*5/?974:<:B*
?=>/3-C9 X4 ?=BS:-C< 397/X=:-?/::4 9C<-C99.9A X/?79.-/［ I］+ J-=*
79?EC=: P977，$%%%，$$：’()*’"#+
［#L］ 8/X/7/ 2，2=-FB3- U，KCA= 8，97 /:+ R.=AB?7-=C =D 5*/?974:*H*
C9B./3-C-? /?-A X4 ?=BS:-C< X/?79.-/ 9ZS.9>>-C< 5*/?974:* H*<:B*
?=>/3-C9 $*9S-39./>9 /CA 5*/?974:*H*C9B./3-C-? /?-A >4C7E97/>9
［I］+ KCF439 N-?.=X 89?EC=: ，$%%$，#%：#$(*###+
［#(］P99 UO，P99 IY，6- I2，97 /:+ R.=AB?7-=C =D ?47-A-C9 M（ *3=C=SE=>*
SE/79 5*/?974:C9B./3-C-? /?-A B>-C< .9?=3X-C/C7 K>?E9.-?E-/ ?=:-
/> / X-=?/7/:4>7［I］+ J-=79?EC=: J-=9C<，$%%$，"%：M&L*M$’+
［#"］QE9C a，]E/C< IJ，2=1/: R，97 /:+ 8./C>D9..-C< / X-=>4C7E97-? ?4?:9
-C7= / S.=AB?7-@9 K>?E9.-?E-/ ?=:- >7./-C：:/.<9*>?/:9 >4C7E9>-> =D
-A9>［I］+ I G3 QE93 U=?，$%%&，&$#：" "LL*" "L(+
［#)］P-C Q,，UE9C OI，O/.?-/_BC?9A/ K，97 /:+ KCF43/7-? >4C7E9>-> /CA
.9<9C9./7-=C =D #!*SE=>SE=/A9C=>-C9 M!*SE=>SE=>B:D/79（ RGRU）
D=. .9<-=>9:9?7-@9 >B:D/7-=C =D =:-<=>/??E/.-A9>［ I］+ I G3 QE93
U=?，&))M，&&(：" %#&*" %#$+
［’%］ JB.0/.7 NH，TFB3- N，V=C< Q,+ KCF43/7-? .9<9C9./7-=C =D #*
SE=>SE=/A9C=>-C9*M*SE=>SE=>B:D/79 B>-C< /.4: >B:D=7./C>D9./>9 D=.
7E9 S.9S/./7-@9 9CF43/7-? >4C7E9>-> =D >B:D/79A ?/.X=E4A./79>［ I］+
GC<91 QE93 TC7 KA KC<:，&)))，#"：$ (’(*$ (M%+
万方数据