全 文 ：乳糖诱导耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达
朱孝霖，孙 雷，李 环，韦 萍!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：考察乳糖代替 %&’(诱导耐热木聚糖酶基因在重组大肠杆菌 )*!" 中表达的可行性。分别以 %&’(和乳糖作
为诱导剂，对诱导时机、诱导剂浓度、诱导持续时间等主要因素进行了分析比较。结果表明，当菌体生长至发酵液
吸光值 !"+##达 " ,- 时加入乳糖其终浓度达 !$ ,! ../0 1 *，-2 3，持续诱导 $ ,4 5，木聚糖酶活力达到最高，为 - 462 ,4
7，是 %&’(优化条件下持续诱导 2 5达到的最高酶活的 ! ,#2 倍，而成本只有 %&’(的 " 1 !#8。
关键词：耐热木聚糖酶；乳糖；诱导表达；9:9;&<(=
中图分类号：’>$!# ?" 文献标识码：< 文章编号："+2! @ -+26（!##4）#8 @ ##48 @ #8
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（L/00HKH /M *DMH 9NDHFNH EFO &5EP.ENQ，GEFRDFK 7FDSHPTDUQ /M ’HN5F/0/KQ，GEFRDFK !"###$，L5DFE）
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3，U5H WQ0EFETH ENUDSDUQ /M U5H NH00T 5EPSHTUHO PHEN5HO U5H .EWD.I. SE0IH ET - 462 ,4 7，Y5DN5 YET ! ,#2 UD.HT
ET .IN5 ET U5EU KDSHF XQ U5H PHN/.XDFEFU TUPEDF DFOINHO XQ %&’( M/P 2 5，XIU U5H N/TU /M 0ENU/TH ITHO OHNPHETHO
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8+4 9(-5.：U5HP./;TUEX0H WQ0EFETH；0ENU/TH；DFOINUD/F EFO HWVPHTTD/F；9:9;&<(=
木聚糖酶（!;:;"，8;WQ0EF/5QOP/0ETH，=L - ,! ," ,6）
是可将木聚糖降解成低聚木糖和木糖的水解酶，它
在饲料、造纸、食品、能源工业和环境科学上有着广
阔的应用前景。大多数木聚糖酶作用的最适温度在
4# Z +# 3之间，只有 !# 余种细菌和不足 "# 种真菌
能产耐热木聚糖酶，其中 )’&*+,-’’./0123*./ 产生的
木聚 糖 酶 最 适 温 度 为 6# 3，而 海 栖 热 孢 菌
4,*1/&0&52 /21(0(/2 产生的木聚糖酶的最适温度高
达 "## 3以上［"］，这种耐热木聚糖酶在造纸等领域
具有应用价值。但由于栖热袍菌难以培养，本文将
海栖热袍菌的耐热木聚糖酶基因导入大肠杆菌
)*!"（:=-）得到基因工程菌 "#!#，试图大量表达耐
热木聚糖酶。
该工程菌表达耐热木聚糖酶需开启 ’20EN 启动
! 收稿日期：!##4;"#;#$
基金项目：国家 $2- 计划项目（编号 !##-L)2"+###8）资助
作者简介：朱孝霖（"$6";），女，江苏徐州人，在读硕士，研究方向：酶工程。
联系人：韦 萍（"$+#;），女，教授，’H0：#!4;6-462-8"。
G/S ? !##4
·48·
生 物 加 工 过 程
L5DFHTH [/IPFE0 /M )D/VP/NHTT =FKDFHHPDFK
第 - 卷第 8 期
!##4 年 "" 月
万方数据
子，!"#$能够对启动子产生持久的诱导作用，是一种
常用的有效诱导剂，但价格昂贵，难以在发酵工业中
应用。乳糖是一种二糖，没有毒性，且价格低廉，也可
以作为诱导剂启动 #%&’(启动子，因此有报道［)、*］利用
乳糖替代 !"#$诱导。本研究试图采用乳糖代替 !"#$
诱导耐热木聚糖酶表达基因，通过酶的表达及其功能
的基本参数的考察对比，研究是否可行。
! 材料与方法
+ ,+ 菌 种
供试菌种：重组基因工程菌 +-)-，目的基因为
海栖热孢菌（ !"#$%&’&() %)$*’*%)）./01，表达载体为
23# )4’（ 5），宿主菌为大肠杆菌 16)+（73*），具有
卡那霉素抗性，由南京工业大学制药与生命科学学
院菌种保藏室冻存。
冻存管中的菌株提取质粒，用氯化钙转导法［8］
筛选阳性克隆菌株，挑取酶活力高且质粒稳定的菌
株作为本实验的出发菌株。
+ ,) 培养基及培养方法
+ ,) ,+ 保藏及发酵基础培养基
含 9-!: ; <6卡那霉素（=’0）的 61培养基。
+ ,) ,) 优化发酵培养基（: ; 6）
蛋白胨 +>、甘油 +-、（?@8）) AB8 4、?’C& 9、D:AB8
-,9、D0AB8 -,-)9、?EC&)·>@)B -,+、F0AB8·%@)B -,--9、
CGAB8·9@) B -,-+、@* 1B* -,-*、?’)DHB8·)@) B -,-9、
-,9 - <6，2@ %,-。
+ ,) ,* 培养方法
新鲜活化菌种接种于发酵基础培养基，装液量
为 4- <6 ; 9-- <6，*% I，+>- J ; 按照接种量 8K转接入优化发酵培养基中，一定温
度下 +>- J ; 定时间，取样在 %- I下测其木聚糖酶活力及蛋白表
达量。每个样做两个平行，同样发酵条件重复 * 次，
数值稳定无异常后取平均值作为实验数据。
+ ,* 分析方法
+ ,* ,+ 菌体浓度测定
+ <6 发酵培养液，稀释适当倍数后，测其 >--
0<的吸光度，以 +,>--表示。
+ ,* ,) 木聚糖酶活力的测定
采用改进的 7?A法［9］。
+,4 <6质量分数 -,9K的木聚糖中加入 )--!6
适当稀释的酶液，%- I下反应 )- 终止反应，沸水中显色 +- 酶活力单位（L）的定义：在该反应条件下，每
+ ,* ,* 目的蛋白表达量
十二烷基磺酸钠M聚丙烯酰胺（A7AM"N$3）凝胶
电泳［>］。
" 结果与讨论
) ,+ !"#$诱导效果
) ,+ ,+ 在 61培养基中培养的菌株用 !"#$诱导
本实验组已对基因工程菌 +-)- 在 61培养基中
生长，加入 !"#$对耐热木聚糖酶的诱导作用的研究
结果作了报道［%］。研究结果表明，在接种时直接加
入终浓度为 - ,) <果，收获时工程菌的酶活力可达到 )8% ,9- L。
!"#$对 61培养基中生长的工程菌 +-)-诱导，虽
经条件优化，最终菌株表达酶活力仍没有明显提高。
因此试图用优化发酵培养基，提高 !"#$的诱导效果。
) ,+ ,) !"#$对优化发酵培养基中的菌株诱导
) ,+ ,) ,+ !"#$诱导时机和诱导温度的影响
种子液接种至优化发酵培养基，分别在菌株生
长至 +,>--值为 - ,8、- ,%、+ ,*、) ,*、* ,) 时，加入终浓
度为 + <导 9 O，测定木聚糖酶活力。
由图 + 可见在工程菌株 +,>--值为 - ,% 时加
!"#$最适宜，最适诱导温度为 *% I。以后实验都
在此条件下进行。
—!—*- I；—"—*% I
图 + !"#$诱导时机的影响
PE: ,+ 3QQR(S HQ TGJ’SEH0 HQ !"#$ H0 U/&’0’VR ’(SEWES/
) ,+ ,) ,) !"#$浓度的影响
在以上优化的条件下，加入不同终浓度的
!"#$，诱导 9 O 后测定酶活力。结果如表 + 所示。
)--9 年 ++ 月 朱孝霖等：乳糖诱导耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达 ·99·
万方数据
表 ! 发酵液中 "#$%浓度对木聚糖酶活力的影响
$&’() ! *++),- .+ /0++)1)2- "#$% ,.2,)2-1&-0.2 .2 34(&2&5) &,-060-4
!（"#$%）7（88.( 7 9） : ;:< : ;! : ;< ! ;: ! ;< = ;: > ;: ? ;:
酶活力 7 @ >>! ;AB ?CD ;B< ! ? ! B<: ;> = :?C ;: ! >?B ;A
由表 ! 可见，发酵液中 "#$%浓度为 > ;: 88.( 7 9
时酶活力最高，但当 "#$% 的浓度由 : ;< E > ;: 88.( 7
9大幅增加，酶活增量却不大，考虑成本，"#$% 的添
加浓度以 ! ;: 88.( 7 9为宜。
= ;! ;= ;C "#$%诱导过程的考察
在上述优化条件下，加入 ! ;: 88.( 7 9 的 "#$%，
酶活表达过程如图 = 所示。由图 = 可见酶活力在诱
导后 ? E A F 趋于稳定，酶收获的最佳时间为 D F。
此时最高酶活力可达到 ! D=B ;A @。
= ;= 乳糖诱导效果
= ;= ;! 乳糖浓度的影响
种子液接种至优化发酵培养基，参照以上 "#$%
诱导的优化条件，在菌株生长至 "#?::值为 : ;D 时加
入乳糖至终浓度分别达到 ! ;>?、= ;B=、!> ;?、=B ;=、
>C ;A、、!!? ;A、!D< ;= 88.( 7 9，CD G持续诱导 < F，
取样测定木聚糖酶活力，同样留样进行电泳分析。
结果如表 = 所示。
图 = 诱导时间对木聚糖酶活力的影响
H0I J= *++),- .+ -08) .2 34(&2&5) &,-060-4
表 = 当菌体 "#?::为 : ;D 加入乳糖，糖浓度对木聚糖酶活力的影响
$&’() = KF)2 "#?:: .+ ’0.8&55 &5 : ;D &//02I (&,-.5)，)++),- .+ (&,-.5) ,.2,)2-1&-0.25 .2 34(&2&5) &,-060-4
!（乳糖诱导）7（88.( 7 9） ! ;>? = ;B= !> ;? =B ;= >C ;A !!? ;A !D< ;=
收获酶活力 7 @ C?! ;CA AA? ;=B ! >D< ;D ! D=B ;! ! B!= ;> ! B>= ;D = :?B ;A ! CC< ;?
比较表 ! 和表 = 可见，使用乳糖作为诱导剂用
量大大多于 "#$%，这是可能因为部分乳糖被作为碳
源消耗于细胞代谢。由表 = 还可见，木聚糖酶活力
随着乳糖浓度的增大显著增加，当乳糖浓度达
!!? ;A 88.( 7 9时，酶活最高为 = :?B ;A @，但当乳糖
浓度大于 !!? ;A 88.( 7 9 后酶活开始下降，可见，乳
糖浓度过高反将抑制目的蛋白的表达。因为乳糖浓
度由 =B ;= 到 !!? ;A 88.( 7 9，酶活增幅不大，考虑成
本，乳糖的添加浓度为 =B ;= 88.( 7 9为宜。
= ;= ;= 诱导时机和诱导温度的影响
种子液接种至优化发酵培养基，分别在工程菌
株 !:=: 生长至 "#?::值为 : ;!、: ;>、: ;D、! ;C、= ;C、C ;=
时，加入终浓度为 =B ;= 88.( 7 9 的乳糖，分别在 C:
G和 CD G诱导 < F，取样测定木聚糖酶活力。
由图 C 可见，CD G条件下工程菌株 !:=: 表达的
木聚糖酶活力比 C: G时高得多；尤其当菌体 "#?::
增至 ! ;C 时，加入乳糖的诱导效果最明显。实验结
果表明，乳糖诱导最适温度为 CD G，当菌体 "#?::增
为 ! ;C 时加入乳糖效果最佳，以下实验均在此条件
下进行。
—!—C: G；—"—CD G
图 C 诱导时机的影响
H0I ;C *++),- .+ /L1&-0.2 .2 34(&2&5) &,-060-4
由于加入乳糖起始诱导的菌体生物量增大
（"#?::从 : ;D 增至 ! ;C），收获时所表达的木聚糖酶
量可能有所增加，因此进一步实验考察乳糖诱导效
果，结果如表 C 所示。当添加的乳糖终浓度为 !!? ;A
88.( 7 9，酶活力仍然最高，增至 = 浓度为 =B ;= 88.( 7 9，酶活力增至 = =!D ;> @。乳糖
浓度由 =B ;= 到 !!? ;A 88.( 7 9，收获酶活增幅不大，
考虑成本，乳糖的添加浓度仍以 =B ;= 88.( 7 9 为宜。
· 期
万方数据
根据国内市场价格计算，乳糖 !" 元 # $%，&’()** 元 #
%，以添加的乳糖终浓度为 +, -+ ../0 # 1 计，所表达
的木聚糖酶活与 &’()浓度为 ! ../0 # 1 所表达的酶
活相当略强，而乳糖的添加成本约 " -! 元 # 1，只有
&’()成本的 2 # +"!。可见乳糖有很大的工业应用潜
力。
表 3 当菌体 !"4""为 2 -3 时加入乳糖，糖浓度对木聚糖酶活力的影响
(5607 3 897: !"4"" /; 6><:% 05?@/=7，7;;7?@ /; 05?@/=7 ?/:?7:@A5@#（乳糖诱导）#（../0 # 1） 2 -!4 + -,+ 2! -4 +, -+ !3 -* E* -! 224 -* 2FE -+
收获酶活力 # G EE+ -3F F,F -!3 + "F2 -F + +2F -! + !22 -* + !3F -, + EF* -* 2 *3F -+
+ -+ -3 乳糖诱导酶收获时间考察
控制发酵培养液 !"4""为 2 -3 时，一次性加入终
浓度为 +, -+ ../0 # 1的乳糖，3F H继续诱导 2+ -E 9。
定时取样，测定木聚糖酶活力，留样进行电泳分析。
考察结果如图 ! 的诱导方式!所示，木聚糖酶
活力在 * I 22 -E 9 趋于稳定，, -E 9 时最高，为
3 E*F -E G。实验结果表明木聚糖酶持续诱导，最佳
收获时间为 , -E 9。
—!—诱导方式!；—"—诱导方式"
图 ! 终浓度为 +, -+ ../0 # 1 乳糖不同方式诱导的产酶曲线
J<% -! K;;7?@ /: BC05:5=7 LA/>M?<:% <:>M?<:% <: ><;;7A7:@ =@C07= /;
+, -+ ../0 # 1 05?@/=7
+ -+ -! 乳糖添加方式对木聚糖酶表达量的影响
有文献报道乳糖以低浓度流加方式的诱导比一
次加入较高浓度的乳糖诱导效果更好［*］。因此，本
研究在菌体 !"4""达到 2 -3 时，采用间断补加的方
式，每隔 2 9 添加等量乳糖，使其终浓度达到 +, -+
../0# 1（诱导方式"）。与一次性加入终浓度为
+, -+ ../0 # 1（诱导方式!）的诱导效果对应比较。
考察结果如图 ! 的诱导方式"所示，间断补加乳糖
方式持续诱导 , -E 9 后，木聚糖酶活力继续增加，22
9最高可达到 3 FF4 -E G，效果略好于一次性加糖诱
导效果。但综合考虑实验的简便易操作性，仍可采
用一次性加糖诱导方式。
+ -3 木聚糖酶蛋白表达分析
本文还将 &’() 和乳糖诱导最佳条件下所收获
到的菌体与不加诱导剂生长 F 9 所收获到的菌体平
行作（NONP’Q)K）凝胶电泳分析对比，结果如图 E 所
示。由图可见在相对分子质量 ! -+ R 2"! 处，不加诱
导剂时耐热木聚糖酶的表达量很小，肉眼难辩，加入
&’()和乳糖后，目的蛋白表达量明显增加，条带粗
深。通过软件分析目的蛋白占菌体总蛋白含量，
&’()诱导的目的蛋白含量为 24 -3S，而乳糖诱导的
目的蛋白含量稍低，为 2E -,S；比较 3 条带：条带 2
颜色较深，表明几乎没有外源蛋白抑制菌体生长；条
带 + 比条带 2 颜色浅，可能是因为外源蛋白耐热木
聚糖酶的表达抑制了菌体本身的生长；而条带 3 明
显比条带 + 颜色深，是因为乳糖作为碳源促进了菌
体生长，弥补了外源蛋白对菌体生长的抑制作用。
因此单位体积菌液中目的蛋白含量比 &’() 诱导时
高得多。研究结果表明，乳糖代替 &’()诱导耐热木
聚糖酶的表达是可行的。
T—’A/@7<: ./07?M05A U7<%9@ .5A$7A；2—:/@ <:>M?7>；+— <:>M?7>
U<@9 2 -" ../0 # 1 &’() U97: !"4"" /; 6M?7>
U<@9 +, -+ ../0 # 1 05?@/=7 U97: !"4"" /; 6图 E NONP’Q)K
J<% -E NONP’Q)K
! 结 论
研究结果表明当菌体 !"4""为 2 -3 时加入乳糖
其终浓度达 +, -+ ../0 # 1，3F H，持续诱导 , -E 9，木
（下转第 4E 页）
+""E 年 22 月 朱孝霖等：乳糖诱导耐热木聚糖酶基因在大肠杆菌中表达 ·EF·
万方数据
—!— ! ! "；—"— ! ! " "#；—#— ! ! " "$；—$— ! ! % &"
图 ’ 末端液相产物回流比对产氢能力影响
()* +’ ,--./0 1- 2.-345 260)1 1- 3)74)8 .98 :2184/0)19
19 ;)1<=821*.9 :2184/0)19
> +# 厌氧发酵产氢类型分析
表 ? 表明稀释率具有影响系统微生物生长增殖
的特性。当 # ! > +@ 8 A %（ ! ! " +$）时，乙酸、丁酸的
质量分数分别为 ?% +’B和 ’C +%B，占 D(E 总量的
C" +#B，此属于典型的丁酸型发酵。根据以上数据
分析，可以认为本厌氧发酵系统以丁酸型发酵为主。
表 ? 不同回流比流出液 D(E含量变化
F6;3. ? D62)60)19 1- D(E 60 8)--.2.90 ! G634.H
稀释率 I 8 A %
液相末端产物质量分数 I B
乙醇 乙酸 丙酸 丁酸 戊酸
> +@（! ! "） ’ +# >C +# ’ +@ ’$ +’ " +C
> +@（! ! " +#） C +@ ?? +> ? +J ’? +> " +’
> +@（! ! " +$） @ +$ ?% +’ @ +> ’C +% " +@
> +@（! ! % +"） # +J ?" +C ’ +J ’’ +@ % +?
! 结 论
（%）利用餐厨垃圾厌氧发酵制备氢气，数据结果
表明：在半连续发酵时，稀释率 # ! > +@ 8 A %（! ! "），
温度 $ ! ?J K，:L 维持在 # +" 左右时，氢气的最大
产生速率可达 ’ +@C M? I（M?·8），氢气的含量达到
#"B。
（>）将厌氧发酵末端产物作为稀释液返回加入
到反应器中进行连续发酵，反应器的产氢能力约提
高了 %?"B，最大产氢速率可达 %" +C M? I（M?·8），氢
气的含量为 #’B。
本文研究循环式厌氧发酵餐厨垃圾产氢的运行
参数，为扩大规模利用餐厨垃圾产氢的研究提供了
有价值的基础数据。
参考文献：
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-118 Y6H0.［ N］& V90.2960)1963 N142963 1- L=821*.9 ,9.2*=，>""@，>C：
%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
’#CR’JJ &
（上接第 ’J 页）
聚糖酶活力达到最高，为 ? ’$J +’ S，是 VPFZ 优化条
件下持续诱导 J < 达到的最高酶活的 > +"J 倍，而成
本只有 VPFZ的 % I >"@，乳糖代替 VPFZ诱导基因工程
菌 %">" 表达耐热木聚糖酶具有很大的工业应用潜
力。
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万方数据