全 文 ：双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶研究
汪海萍，魏荣卿，沈 斌，刘晓宁，韦 萍，周 华，欧阳平凯!
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 !"###$）
摘 要：提出“柔性固定化酶”的模型，即：用一亲水、柔性高分子链接枝于载体表面制得柔性固定化载体，再用其
以共价键合的方式进行酶的柔性固定化。其特点是：柔性固定可改善因直接固定化及手臂固定化使酶失活的缺
陷，并提高固定化酶的自由度；如选用粒径单分散微球可改善固定化反应及固定化酶催化反应的均一性。以双醛
淀粉（%&’）为柔性链对羧基化聚苯乙烯载体进行柔性化修饰后，固定木瓜蛋白酶，其活力回收率可达 (#)，相当于
用戊二醛进行手臂固定化的活力回收率的 !倍。
关键词：柔性固定化；固定化酶；双醛淀粉；羧基化聚苯乙烯；固定化木瓜蛋白酶
中图分类号：*((+,- 文献标识码：& 文章编号："+.! / -+.0（!##1）#" / ##!( / #(
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L7]MP 96967:
在反应中使用游离酶导致产品易污染且酶难以
重复使用，因而发展了固定化酶（7SS?\7L7]MP M:]TSM）
技术［"］。共价结合法是一种酶以共价键结合于载体
的固定化方法，也是目前研究最活跃的固定化方法
之一。它的优点在于酶与载体结合牢固，不易脱落，
可以连续使用较长时间。但也存在以下缺陷：（"）在
固定化过程中酶分子与载体分子之间发生直接（刚
性）碰撞，此碰撞力易使酶的构象改变，使酶失活。
（!）载体一般是疏水性物质，当酶直接被固定在疏水
载体上时会改变酶的微环境，使酶蛋白构象发生折
! 收稿日期：!##-8"!8-#
基金项目：国家自然科学基金（3?,!##.+#!"），省十五攻关课题（A作者简介：汪海萍（"$.$8），女，江西景德镇人，硕士生，研究方向：生物工程。
联系人：刘晓宁，博士生导师，<8S67L：[76?:7:;L7H_"!+, O?S
第 !卷第 "期
!##1年 !月
生 物 加 工 过 程
KQ7:MWM ‘?HR:6L ?N A7?9R?OMWW <:;7:MMR7:;
ZM\a !##1
·!(·
万方数据
叠、失活。（!）传统共价结合法得到的固定酶自由度
低，酶分子和底物之间存在较大空间位阻，不利于保
留酶游离态的均相催化活性。故称之为“刚性固定
化”。
为此，有人想到了在载体表面接上短链（手臂分
子）进行酶的“手臂固定化”［"］。但由于这种手臂链
是分子量较小的短链，而且有些是碳链构成的疏水
链，所以在固定化过程中，酶分子仍会受到较大的冲
击力，使构象改变而失活。
为此，本文提出“柔性固定化酶［!］”模型，即：在
固定化载体上，接上一些有足够长度的且是亲水的
分子链，即所谓的“柔性链”，而后再将酶结合到柔性
链上。首先，柔性链改善了载体表面刚性及疏水性，
使其具有柔顺，亲水的性质。这样的柔性载体在固
定化过程中与酶分子相碰反应时能产生足够的缓冲
作用，可以保持酶的构象不变而维持酶的活性。其
次，当对发生折叠、失活处于亚稳态的酶蛋白施加反
折叠措施使其构象回复正常时，因载体的柔性而位
垒更低，更易于恢复，即增加了酶的自恢复能力，从
而解决酶蛋白的不稳定性问题。另外，柔性固定化
的酶具有自由度损失较少，可以最大地保留酶游离
态的均相催化活性。由此可见，酶的”柔性固定化”
模型不仅可以保留共价结合法固定化酶结合牢固、
可反复使用的优点，又可改善其固定化过程中酶活
损失较大的问题，还可最大可能地保留酶游离态的
均相催化活性，具有较好的研究价值和应用前景。
本文拟采用以下步骤实现木瓜蛋白酶的柔性固
定化（见图 #）。
图 # 柔性固定化木瓜蛋白酶合成路线
$%&’# ()*+,-.%. /012.- 03 34-5%64- %7706%4%8-9 :;:;%*
! 实验材料与仪器设备
#’# 仪器设备
红外光谱仪（<%/04-+ !=>），紫外分光光度计（?@
#A>#），酸度计（BC(D!E）
#’" 实验试剂
粒径单分散 B( 微球、胺基载体（担载量 F #’"
7704D公司），木瓜蛋白酶（南京生兴生物技术有限公司），
H4E4!（$41I;），JKHJ（J%%.0:20:)4 H809%/;2605)4;+- 二异
丙基偶氮二甲酸酯，$%.,-2）
二氯甲烷（JEL），邻苯二甲酸酐（BH），淀粉，
<;KMN，三苯基磷，四氢呋喃（?C$），甲醇，盐酸，丙
酮，二甲基甲酰胺（JL$），H&分析纯或生化试剂）
" 实验方法
"’# 羧基化 B(的制备
在反应瓶中加入 BH粉末 "’OP &及 JEL P> 7Q，
然后加入 P &的 B(微球，在搅拌下加入 H4E4!，室温
下反应 #> ,。反应结束后，过滤，用冷盐酸（!R）充
分洗滤微球后，再用蒸馏水洗至 H&无氯离子，最后用 ?C$洗至滤液中 BH的紫外吸收
值不变，甲醇洗滤 N次，真空干燥至恒重，并做红外
光谱分析。
"’" JH(的制备
称取 P & 的淀粉，加入蒸馏水，A> S水浴保持
"P 7%*，再迅速冷却至室温，得乳白色均匀粘稠状拟
均相体系淀粉。按一定投料比称取 <;KMN，加蒸馏
水溶解，加入到上述拟均相体系淀粉之中，调节初始
:C，通 <"，> S下反应一定时间。在反应过程中，用
酸度计监测体系 :C，并维持 :C不变。反应结束后，
·"=· 生物加工过程 第 "卷第 #期
万方数据
将反应液倒入 !倍体积的丙酮中，过滤沉淀，再以蒸
馏水和丙酮交替洗涤沉淀数遍，至 "#$%&检测滤液
无浑浊后，再以丙酮洗涤一遍，真空干燥至恒重，并
做红外光谱分析。该 ’"(的醛基含量（氧化度）的
测定按文献［)］方法进行。
!*& 醛基糖柔性固定化载体的制备
称取 +*, #羧基化 -(（见 !*. 节）在 ! /0 ’12
中溶胀。另取 .*3 # ’"(（见 !*! 节），置于 ., /0
’12中 4+ 5下溶解后，加入至已溶胀的羧基化 -(
中。在该体系中加入 ) /0 三苯基磷的 ’12 溶液
（3,6），再加入 ! /0 ’7"’。于 4+ 5下反应 !) 8。
反应结束后，用 ’12将反应物全部转移到砂芯漏斗
中，分别用热水、冷水、甲醇充分洗涤后，真空干燥至
恒重，得醛基糖柔性固定化载体，并做红外光谱分
析。
!*) 戊二醛手臂固定化载体的制备
在圆底烧瓶中加入 +*, #胺基载体，用一定量的
蒸馏水浸泡。磁力搅拌下，向其中加入过量的 !,6戊
二醛，在 4+ 5反应 .) 8后过滤，用蒸馏水洗去过量的
戊二醛。甲醇洗涤数遍后，真空干燥至恒重。
!*, 固定化酶的制备
+*+, /9:;0的 <=>?@AB:缓冲液（CA D）的配制参
照文献［,］。
酶液（+*!, /#;/0）的配制：以 <=>?@AB: 缓冲液
配制木瓜蛋白酶液。
固定化酶的制备：在锥形瓶中加入 +*, # 醛基
糖柔性固定化载体（或戊二醛手臂固定化载体），加
入 , /0上述酶液，在 !! 5下固定反应 !) 8。固定
化结束后，过滤，用大量蒸馏水洗涤至固定化载体表
面无残留游离酶，再用 <=>?@AB:缓冲液洗涤，抽滤后
测固定化酶活力。
!*3 酶活力测定
木瓜蛋白酶的一个活力单位（E）相当于释放
.!#的酪氨酸，酶活力测定按文献［3］方法进行。
!*4 红外分析
用 FG=压片法，将干燥至恒重的待测样品 . H
! /#加入 .++ H .!+ /#的 FG=中，碾磨混合均匀，压
片后用红外光谱仪扫描得样品红外谱图。
! 结果与讨论
&*. 羧基化 -(
羧基高分子载体的合成方法很多：如水解聚丙
烯酸酯，或水解聚甲基丙烯酸酯与二乙烯苯（’IG）
的共聚物等［4，D］，这些方法的缺陷是在载体内部残留
有大量的未反应羧基。也有人用酸酐对线性的聚苯
乙烯进行羧基化［J］，但尚未见到交联聚苯乙烯羧基
化的报道。本文采用粒径单分散的交联聚苯乙烯微
球，在傅@克酰基化反应条件下使聚苯乙烯微球接上
羧基基团，该法经条件优化后可以定量地制备不同
羧基担载量的载体，且羧基基团位于载体表面，有利
于下步与柔性链的接枝反应。本文按 !*. 节方法，
制得了担载量为 !*! //9:;#的羧基化 -(载体。
&*! 在拟均相体系中制备 ’"(
文献报道制备 ’"( 的方法大多为非均相体
系［.+ H .&］。在该体系下，酸性高，反应速度慢，氧化剂
用量多，且产物水溶性差。本文采用一种新的体系
———拟均相体系制备 ’"(，该体系中淀粉分子链经
溶胀、溶解，使糖链分子间的缠绕部分被解开，糖环
上的羟基之间形成的氢键被水羟基与糖羟基形成的
氢键所取代，即水分子进入了淀粉分子链之间，这样
淀粉分子链之间的作用力减弱，间隙增大，呈疏松状
态。因此使 $K7%)分子易于进入淀粉分子之间，加
快了氧化反应速度，大大缩短了反应时间；同时使最
佳 CA由 .*! 升至 )*)，反应条件温和，避免了副反
应；且产品的氧化度均一，水溶性提高。这样所制备
的 ’"(更适合于作为酶固定化的柔性链。
按 !*!节方法，本文分别获得了不同氧化度的
’"(（见表 .），由表 . 可知，在拟均相体系中，随着
$K7%)和淀粉的投料比的提高，或反应时间的延长，
’"(的氧化度增加。
表 . 制备不同氧化度的 ’"(
9O 9P ’"( Q>N8 R>PPM=MON RM#=MM 9P 9S>RKON
$K7%)和淀粉的投料比
;（/9:;/9:）
反应
CA
反应时间
;8
’"(氧化度
;6
’"(!+ +*!;. .*! . .D*D
’"(,+ .;. .*! . ,!*)
’"(4+ .;. )*) . 3D*.
’"(J+ .;. )*) ) J!*&
&*& 醛基糖柔性固定化载体的制备
用按 !*.节方法制得的羧基载体和按 !*!节方
法制得的 ’"(柔性链，在脱水剂的存在下脱去水分
子，使柔性链偶联在羧基载体上。反应后，产品经充
分水洗，以除去未接枝的 ’"(柔性链。该柔性链上
!++)年 !月 汪海萍等：双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶研究 ·!4·
万方数据
含有大量的醛基基团可与酶偶联。本文按 !"#节的
方法制备了不同醛基含量的醛基糖柔性固定化载体。
$"# 羧基化 %&，’(& 及醛基糖柔性固定化载体的
红外光谱分析［)#］
由表 !中可见：)）经 &*+,-. )和 &*+,-. ! 的比
较可知，由于 %&上引入了羧基后，&*+,-. !在 $ #/0
1 $ #00 2+3 )处出现了羧羟基的中强度!45吸收峰，
在 ) 6)0 1 ) 600 2+3 )处出现了羧羰基的中强度!78 4
吸收峰，在 ) 99/ 1 ) 9#0 2+3 )处出现了因邻苯二甲
酸酐的酰基化造成的芳酮!78 4强吸收峰，在 ) !:)
2+3 )处出现了羧羰基的!7;4强吸收峰，另外在 ! 000
1 ) :00 2+3 )处苯环的单取代四峰也变成了双取代
二峰；!）由于 &*+,-. $ 被氧化后，在淀粉糖环上的
7!、7$处形成了双醛，分子中的羟基减少，所以
&*+,-. #中 ) 6)0 1 ) 600 2+3 )处出现了醛羰基的中
强度!78 4吸收峰，而在 ) )/9 2+3 )和 ) 0:$ 2+3 )处的
!7;4吸收峰有所减弱；$）比较 &*+,-. !、&*+,-. # 及
&*+,-. /，则可说明：由于在 &*+,-. ! 上接枝了含有
大量羟基及醛基的 ’(&柔性链，使得 &*+,-. / 在 $
#$/ 2+3 )处的!45吸收峰 明显增强；由于羧基载体与
’(&是以酯键的形式相结合，所以 &*+,-. /在 ) 6!!
2+3 )处出现了新的酯羰基的!78 4吸收峰，而在 ) 06$
2+3 )和 ) 0!< 2+3 )处则出现 &*+,-. !没有、但 &*+,-.
#具有的 ’(&柔性链的羟基!7;4吸收峰。由以上讨
论可以证明，该醛基糖柔性固定化载体具有醛基多
糖酯的结构。
表 ! 羧基化 %&，’(&及柔性固定化载体红外光谱的特征吸收波数
=*>-. ! ?@ A*B* CD 2*E>CFG-HI.A ,C-GJBGE.K.，’(& *KA D-.FH>-. 2*EEH.E
L*M.N2+3 ) $ #/0 1 $ #00 ! 000 1 ) :00 ) 6!! ) 6)0 1 ) 600 ) 99/ 1 ) 9#0 ) !:) ) )/9 ) 0:/ 1 ) 060 ) 0$0 1 ) 0!/
&*+,-. ) 3 # ,.*OJ 3 3 3 3 3 3 3
&*+,-. ! + ! ,.*OJ 3 + J J 3 3 3
&*+,-. $ J 3 3 3 J 3 J J J
&*+,-. # J 3 3 + + 3 + + J
&*+,-. / J 3 P P + J 3 + +
&*+,-. )：%&，&*+,-. !：%&;7445，&*+,-. $：JB*E2Q，&*+,-. #：/0R ’(&，&*+,-. /：%&;7445;’(&
&：JBECKS；+：+HAA-.；P：P.*O
$"/ 酶的固定化
按 !"/节方法，选用醛基糖柔性固定化载体对
酶进行柔性固定化，其结果与用戊二醛手臂载体对
酶进行手臂固定化的结果进行比较；同时，还选用不
同醛基含量的 ’(&柔性载体，给以柔性固定化条件
的优化，结果见表 $。
表 $ 固定化酶结果比较
=*>-. $ 7C+,*EHJCK CD H++C>H-HI.A .KIG+.
羧基载体!) 氨基载体!!
柔性链或手臂链 ’(& 戊二醛
’(&氧化度NR !0 /0 60 <0 3
固定化酶活力回收率NR $9 #9 /! /# !9
!)：其中羧基载体担载量 8 !"! ++C-NS；
!!：氨基载体担载量 8 )"! ++C-NS。
由表 $可知，用接有 ’(&柔性链的柔性载体进
行酶的柔性固定化，其所得到的酶活力回收率相当
于用戊二醛进行手臂固定化的活力回收率的 !倍。
这是因为，’(&本是一多糖高分子链，具有一定的分
子量，在水环境中可充分舒展，在酶与载体的碰撞过
程中能产生较好的缓冲作用，有效地减少酶因与载
体的刚性碰撞而造成的构象改变，最终达到酶在固
定化过程中保持较高的酶活性。而戊二醛分子是碳
链构成的疏水链，且分子链较短，当这种手臂链与酶
分子相碰时，不能起到足够的缓冲作用，因此易使酶
的构象改变而使酶失活。另外 ’(& 具有良好的亲
水性及生物相容性，接枝于载体的表面上后，不仅可
以覆盖屏蔽载体的疏水表面，减少对生物分子的非
特异性吸附，而且可以增加载体与生物分子的生物
相容性。因此，在“柔性固定化酶”模型的基础上，选
择适当的柔性链进行酶的柔性固定化，可使酶活力
回收率有显著的提高。
此外，从表 $ 中还可知，’(& 氧化度在 !0R 1
60R的范围内，随着氧化度的提高，固定化酶活力回
收率上升；当 ’(&氧化度大于 60R时，所得到的固
定化酶活力回收率基本不变。’(&的氧化度越高含
有的醛基量越多，理论上所能担载的酶量就更高，而
酶活力回收率也应有相应的提高；但酶作为一种大
·!:· 生物加工过程 第 !卷第 )期
万方数据
分子蛋白，当载体表面所担载的酶分子数量多到一
定程度后，即使再增加载体表面的结合位点，也会因
为空间位阻的限制而使酶分子无法结合到载体上。
这与小分子戊二醛不同，戊二醛量增加，会使酶蛋白
变性［!"］
! 结 论
提出“柔性固定化酶”的模型，其特点是：柔性
固定可改善因直接固定化及手臂固定化使酶失活的
缺陷，并提高固定化酶的自由度；本文选用粒径单分
散 #$微球，通过傅%克酰基化反应对其表面羧基化，
并将淀粉氧化得到含有醛基的 &’$作为柔性链，再
使柔性链偶联在羧基载体上得到柔性固定化载体，
以此载体进行柔性固定化所得到的酶活回收率相当
于传统戊二醛手臂固定化的两倍；另外酶活回收率
随着 &’$柔性链上醛基含量增加而提高，但醛基含
量多到一定程度后，由于酶分子空间位阻的影响，酶
活回收率基本不变。
参考文献：
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,NNK年 ,月 汪海萍等：双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶研究 ·,*·
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