全 文 ：第 １１ 卷第 ４ 期
２０１３ 年 ７ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ４
Ｊｕｌ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０４． ００１
收稿日期：２０１２ － ０７ － ２０
基金项目：国家自然科学基金（２０９７６０７２）；国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划）（２００７ＣＢ７１４３０３）
作者简介：李　 乐（１９８６—），女，河南安阳人，硕士研究生，研究方向：发酵工学；史仲平（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｐｓｈｉ＠ ｊｉａｎｇｎａｎ． ｅｄｕ． ｃｎ
木薯和玉米原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比的图论
理论计算及其验证
李　 乐，李志刚，李　 鑫，史仲平
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：在丁醇发酵产溶剂阶段，乙酸和丁酸的生成途径、消耗途径同时存在，各自形成一个闭环路径。 本研究利
用图论对丁醇发酵中丁醇丙酮质量比进行了理论计算，并对以木薯和玉米为原料的丁醇发酵进行了模拟计算，结
果表明：丁酸闭环路径（Ｌ２环）的代谢强度是影响丁醇丙酮质量比的主要因素，并且 Ｌ２环的代谢强度越弱，丁醇丙酮
质量比越高；与玉米原料丁醇发酵相比，木薯原料发酵的 ｍ（丁醇） ／ ｍ（丙酮）提高了 １６􀆰 ７％ 。 实验结果证实了以上
计算结果：在传统发酵、油醇萃取发酵和生物柴油萃取发酵中，以木薯 （适时添加酵母浸粉） 为原料的发酵批次与
以玉米为原料的发酵批次相比，由于其丁酸闭环路径代谢强度较弱，相应发酵方式下丁醇丙酮质量比分别提高了
１２􀆰 ９％ 、６１􀆰 ４％和 ６􀆰 ７％ ，而且两种原料相应发酵方式的丁醇总产量和生产效率基本持平。 另外，高丁醇丙酮质量
比的木薯发酵所得改良型生物柴油中丁醇浓度与玉米发酵的相比提高了 １６％ ，性能得到进一步提高。
关键词：丁醇丙酮质量比；木薯；图论；代谢分析
中图分类号：ＴＱ２３３􀆰 １２ ＋ ４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０４ － ０００１ － ０７
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｂｙ ｇｒａｐｈ
ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃａｓｓａｖａ ａｎｄ ｃｏｒｎ
ｍｅｄｉａ ｂａｓｅｄ ｂｕｔａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ
ＬＩ Ｌｅ，ＬＩ Ｚｈｉｇａｎｇ，ＬＩ Ｘｉｎ，ＳＨＩ Ｚｈｏｎｇｐｉｎｇ
（Ｔｈｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４１２２， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＡＢＥ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｗｉｔｈ ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｅ⁃ａｓｓｉｍｉｌａｔｉｏｎ ｉｎ
ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｃｌｏｓｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｌｏｏｐｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｏｌｖｅｎｔｏｇｅｎｅｓｉｓ ｐｈａｓｅ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｗｅ ｅｓｔｉｍａｔｅｄ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ
ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ｕｓｉｎｇ ｇｒａｐｈ ｔｈｅｏｒｙ ｆｏｒ ｂｉｏ⁃ｂｕｔａｎｏｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ ｃａｓｓａｖａ ａｎｄ ｃｏｒｎ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉａ．
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｏｆ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｌｏｏｐ （Ｌ２） ｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ
ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｌｏｗｅｒ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｌｏｏｐ ｌｅｄ ｔｏ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ
ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ， ａｎｄ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １６􀆰 ７％ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｃａｓｓａｖａ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｓ： ｗｅａｋｅｎｅｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ ｉｎ ｂｕｔｙｒａｔｅ ｌｏｏｐ ｕｓｉｎｇ ｃａｓｓａｖａ
ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ ｌｅｄ ｔｏ ｈｉｇｈｅｒ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏｓ ｉｎ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｏｌｅｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ ａｎｄ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ａｓ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔａｎｔｓ， ａｎｄ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏｓ
ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １２􀆰 ９％ ， ６１􀆰 ４％ ａｎｄ ６􀆰 ７％ ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ， ｗｈｉｌｅ ｂｕｔａｎｏｌ ｙｉｅｌｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｓｔａｙｅｄ ａｔ
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ｃｏｍｐａｒａｂｌｙ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ａｓ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｏｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｃｏｒｎ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ． Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ
ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏｓ ａｌｓｏ ｇｒｅａｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｕｔａｎｏｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｆｏｒ １６％ ， ｗｈｉｃｈ ｗｏｕｌｄ
ｌａｒｇｅｌｙ ｉｍｐｒｏｖｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ｉｎ ｔｕｒｎ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｍａｓｓ ｒａｔｉｏ；ｃａｓｓａｖａ；ｇｒａｐｈ ｔｈｅｏｒｙ；ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ
　 　 丁醇发酵一般是利用丙酮丁醇梭菌在严格厌氧
条件下进行的，发酵产物除正丁醇外，还有一定量的
丙酮和乙醇，质量比约为 ６∶ ３∶ １（ｍ（丁醇） ／ ｍ（丙酮）
约为 ２） ［１］。 提高目标产物丁醇的比例，能够降低丁
醇提取精制的难度和成本，是目前丁醇发酵方面一个
重要的研究课题。 该方面的研究内容主要包括调控
发酵体系氧化还原电位（ＯＲＰ） ［２］，使用含有强还原性
糖类的混合原料［３］，筛选高丁醇比菌株［４］，以及添加
中性红等电子载体［５ － ６］等；但上述方法均是以牺牲溶
剂产量或增加后处理难度为代价的。
利用图论 （信号传递线图和梅森定理） 对复杂
的微生物代谢网络进行简化和计算，可以得到该微生
物代谢网络中输入节点和各个输出节点之间的函数
表达式；从而将生物过程的输入输出关系与细胞内部
的代谢信号传递函数有机地结合起来［７］。 根据实际
过程的输入输出数据，可以推断特定代谢途径的反应
状态。 在该理论中，微生物代谢途径被视为节点之间
的信号传递过程 （由物质 Ａ到物质 Ｂ的酶促反应可
视为由节点 Ａ到节点 Ｂ 的信号传递过程）。 目前该
方法已经被广泛应用于微生物的代谢网络分析［８ － ９］，
然而在计算产物比例方面还没有相关报道。
丁醇发酵是典型的终产物抑制发酵。 原位萃
取可以有效地将代谢产物从发酵液中移除，缓解甚
至可以消除产物的抑制作用。 油醇具有对丁醇分
配系数高，对菌体没有毒性等优点，常被用作丁醇
萃取发酵的萃取剂［１０］。 Ｄｅｍｉｒｂａｓ［１１］研究表明，向生
物柴油中添加丁醇可以有效改善其燃烧性能。 将
生物柴油用作丁醇发酵的萃取剂［１２］，发酵结束后其
中含有一定量的丁醇 （约 １０ ｇ ／ Ｌ），燃烧性能将大幅
提升，可作为“高品质”柴油直接使用，同时免去了
下游回收精制等工序。 这两种萃取剂在本研究中
均被使用。
郑钧屏等［１３］发现，以木薯为原料的丁醇发酵存
在严重的相转型延迟现象。 当相转型延迟现象出
现时向培养基中添加酵母浸粉，可以促进相转型的
顺利完成和有机酸的快速利用，使发酵性能得到很
大改善；进一步研究发现［１４］，酵母浸粉大幅提高了
ＣｏＡ 转移酶编码基因 ｃｔｆＡＢ 的转录水平，这是导致
发酵性能好转的重要原因。
本文中笔者利用图论简化丁醇代谢网络，分析
丁醇发酵中丁醇丙酮质量比的变化规律，并将计算
结果与丁醇发酵 （玉米和木薯为原料） 结果进行比
较；此外还对木薯原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比
提高的机理进行讨论和分析，以期为如何提高丁醇
丙酮质量比提供一定的理论基础。
１　 材料和方法
１． １　 菌种
笔者所在实验室保藏的丙酮丁醇梭状芽胞杆
菌 （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ ＡＴＣＣ８２４），在 ５０ ｇ ／ Ｌ
玉米醪培养基中培养成孢子液，于 ４ ℃保存。
１． ２　 培养基和萃取剂的前处理
１）活化和保藏菌种的培养基与发酵培养基的
配制　 活化和保藏菌种的培养基与发酵培养基的
配制方法参照文献［１３］。
２）萃取剂的前处理 　 生物柴油 （大豆生物柴
油） 和油醇均在 １１５ ℃条件下灭菌 １５ ｍｉｎ（或不灭
菌），经过 １５ ｍｉｎ的 Ｎ２脱氧处理后泵入发酵罐。
１． ３　 培养方法
１）菌种活化方法　 在厌氧培养箱中将孢子液
按 １０％ （体积分数）接种到装有 ４０ ｍＬ 活化培养
基的厌氧瓶中，抽真空处理 ２ ｍｉｎ 后，沸水热处理
１ ｍｉｎ，冰水冷处理 １ ｍｉｎ，最后置于 ３７ ℃水浴锅中
培养。 ２４ ｈ后作为发酵种子液。
２）发酵方法　 玉米粉和木薯粉发酵方法相同。
为了保证发酵罐内的厌氧环境，接种前向装有培养
基的发酵罐持续通 ５ ～ ３０ ｍｉｎ 的 Ｎ２。 恒温循环水
浴槽与罐内的螺旋蛇管，可以保证在静态条件下将
罐内温度控制在 ３７ ℃。 调节培养基初始 ｐＨ 为
６􀆰 ０，种子液接入量为 １０％ 。 在油醇和生物柴油萃
取发酵时，油水体积比为 １ ∶ １。 发酵罐内的初始压
力维持在 ２􀆰 ０ × １０４ Ｐａ，由于发酵的过程中有气体生
成，罐内压力会进一步的提高，整个发酵过程的罐
内压力维持在 ３􀆰 ０ × １０４ ～ ５􀆰 ５ × １０４ Ｐａ。 酵母浸粉
配成溶液（终质量浓度为 ２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ）１１５ ℃灭菌 １５
ｍｉｎ后根据需要通过蠕动泵打入发酵罐内。
２ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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１． ４　 分析方法
１）发酵过程中的 ｐＨ、ＯＲＰ、总产气量、总糖、还
原糖和溶剂等参数的测定　 参照文献［１３］进行。
２）Ｖ（Ｈ２） ／ Ｖ（ＣＯ２）的计算方法　 假设发酵产气
只有 Ｈ２和 ＣＯ２。
Ｖ（Ｈ２） ／ Ｖ（ＣＯ２） ＝
Ａ（Ｈ２） × ４
Ａｇ × １􀆰 ３３ － Ａ（Ｈ２） × ４
（１）
式中：Ａ（Ｈ２）和 Ａｇ分别表示同一个小时内前 １５ ｍｉｎ
的 Ｈ２产量和后 ４５ ｍｉｎ的总产气量，Ｌ。
总产气测量方法　 参照文献［１４］进行。
Ｈ２ 测量方法［１４］ 　 将发酵产气通过装有 ６ ｍｏｌ ／ Ｌ
ＮａＯＨ溶液的气体洗瓶，使气体中的 ＣＯ２被充分吸
收掉，再用量筒排水置换法测量剩余气体的体积（主
　 　 　
要为 Ｈ２）。
１． ５　 丁醇发酵产溶剂阶段的代谢网络
图 １ 中是丁醇发酵的代谢流程图 （ ａ） 和丁醇
发酵产溶剂阶段的代谢信号传递线图 （ ｂ）。 图 １
（ｂ） 中 α１、α２和 α３分别表示由乙酰 ＣｏＡ 节点到乙
酸闭环途径、乙醇生成途径和中心代谢途径的碳流
分配系数；β１和 β２分别代表由乙酰乙酰 ＣｏＡ 节点
到丙酮生成途径和丁酰 ＣｏＡ 节点的碳流分配系
数；γ１和 γ２分别代表由丁酰 ＣｏＡ 节点到丁酸闭环
途径和产丁醇途径的碳流分配系数。 图中 ２ 和 ０． ５
分别表示葡萄糖→丙酮酸和乙酰 ＣｏＡ→乙酰乙酰
ＣｏＡ ２ 个反应的碳化学计量数；其余各反应的碳化
学计量数全定义为 １。
图 １　 丙酮和丁醇合成的代谢流程图（ａ）与信号传递线图（ｂ）
Ｆｉｇ． １　 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ （ａ） ａｎｄ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｓｉｇｎａｌ ｆｌｏｗ ｄｉａｇｒａｍ （ｂ） ｏｆ ａｃｅｔｏｎｅ ａｎｄ ｂｕｔａｎｏｌ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
１． ６　 信号传递线图和图论在丁醇丙酮质量比计算
中的应用
　 　 在信号传递线图理论中，节点之间的信号传递
方式包括串联，并联和闭环路径 ３ 种基本形式，相应
传递函数的计算方法如图 ２ 所示 （其中 ｇ１和 ｇ２表示
相邻节点间的传递函数，ｇ３表示闭环路径的传递函
数） ［７］。 根据图 ２ 归纳总结的处理方法，可以将复
杂的信号传递线图加以简化和计算，从而得到从起
始节点到终端节点之间的传递函数。
如果要计算具有多重闭环代谢网络的传递函
数，可先利用信号传递线图理论进行简化，再利用
梅森定理进行计算［７］。 由节点 Ａ 到节点 ｉ（代谢网
络中任意一点）的传递函数见式（２）。
ＴＡｉ ＝
∑
ｋ
ＰｋΔｋ
Δ
Δ ＝ １－∑
ｉ
Ｌｉ ＋∑
ｉ，ｍ
ＬｉＬｍ －∑
ｉ，ｍ，ｎ
ＬｉＬｍＬｎ ＋ …　 （２）
式中：Ｐｋ表示第 ｋ条向前支路的传递函数，Δ被称为
线图行列式，Ｌｉ为第 ｉ 个闭环路径的传递函数，ＬｉＬｍ
表示两个完全不接触的闭路径 （ ｉ 和 ｍ） 的传递函
数之积。 同样，Ｌｉ ＬｍＬｎ表示 ３ 个完全不接触的闭路
径 （ ｉ、ｍ和 ｎ） 的传递函数之积。 Δｋ是从 Δ中减去
与第 ｋ条向前支路相接触的所有闭环路径的传递函
数所剩下的部分。
３　 第 ４ 期 李　 乐等：木薯和玉米原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比的图论理论计算及其验证
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图 ２　 信号传递线图的 ３ 种基本传递形式［７］
Ｆｉｇ． ２　 Ｔｈｒｅｅ ｂａｓｉｃ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ
ｓｉｇｎａｌｓ ｆｌｏｗ ｄｉａｇｒａｍ
图 １（ｂ）为简化的丁醇与丙酮的信号传递线图。
假设丁酸和乙酸 ２ 个闭环路径 （ Ｌ１和 Ｌ２ ） 同时存
在，那么从葡萄糖这一起始节点到丁醇这一终端节
点的传递函数可由式（３）计算。
ＴＧＢ ＝
２ × ０􀆰 ５ × （１ － α１ － α２）β２γ２
１ － （Ｌ１ ＋ Ｌ２） ＋ Ｌ１Ｌ２
（３）
　 　 因为闭环路径 Ｌ１和 Ｌ２互不接触，所以 Δ ＝ １ －
（Ｌ１ ＋ Ｌ２） ＋ Ｌ１ Ｌ２。 由代谢信号传递线图可知，由葡
萄糖到丁醇只有 １ 条向前支路（传递函数记为 Ｐ１），
并且 Ｐ１与 Ｌ１环和 Ｌ２环均接触，所以 Δ１ ＝ １。
由葡萄糖节点到丙酮节点传递函数的计算方
法与丁醇传递函数的方法稍有不同。 因为乙酰乙
酰 ＣｏＡ→乙酰乙酸反应是与乙酸→乙酰 ＣｏＡ 和
丁酸→丁酰 ＣｏＡ ２ 个反应是相耦联的 （如图 １（ａ）
所示），所以 Ｌ１环和 Ｌ２环均参与到从葡萄糖到丙酮
的代谢过程中。 因此，由葡萄糖节点到丙酮节点传
递函数 （ＴＧＡ） 的计算见式（４）。
ＴＧＡ ＝
２ × ０􀆰 ５ × （１ － α１ － α２）β１
１ － （Ｌ１ ＋ Ｌ２）
（４）
　 　 因为闭环路径 Ｌ１和 Ｌ２在乙酰乙酸节点彼此接
触 （图 １（ｂ）中虚线），所以 Δ ＝ １ － （Ｌ１ ＋ Ｌ２），并且
　 　 　 　 　
由于葡萄糖到丙酮的唯一向前支路 （Ｐ１） 与 Ｌ１环、
Ｌ２环所是均接触，所以 Δ１ ＝ １。
当丁醇和丙酮的传递函数分别得到计算，ｍ（丁
醇） ／ ｍ（丙酮）可由式（５）来计算：
Ｙｍ（丁醇） ／ ｍ（丙酮） ＝
ＴＧＢ
ＴＧＡ
（５）
２　 结果与讨论
２． １　 利用图论理论分析推算丁醇发酵的丁醇丙酮
质量比
　 　 在丁醇发酵的产溶剂阶段，丁醇、丙酮和乙醇大
量生成并开始积累，同时伴随着乙酸和丁酸的生成与
再利用，分别形成乙酸闭环路径和丁酸闭环路径。
本研究利用图论对丁醇发酵中 ｍ（丁醇） ／ ｍ（丙
酮）进行计算，模拟参数及相关理论计算结果见图
３。 由图 ３ 可知：丁酸闭环路径 （Ｌ２环） 的代谢强度
是影响丁醇丙酮质量比的主要因素，并且 Ｌ２环的代
谢强度越低，丁醇和丙酮质量比越高。 乙酸闭环路
径 （Ｌ１环） 的代谢强度对丁醇和丙酮质量比的影响
不大。 如图 ３（ａ）所示，将 Ｌ２环的代谢强度系数设为
０，当 Ｌ１环的代谢强度系数由 ０ 逐步升至 ０􀆰 ４ 时，丁
醇和丙酮质量比一直维持在 ２􀆰 ３３３ 不变；将 Ｌ２环的
代谢强度系数设为 ０􀆰 ２，当将 Ｌ１环的代谢强度系数
由 ０ 逐步升至 ０􀆰 ３５ 时，丁醇丙酮质量比由 １􀆰 ８６７ 缓
慢降至 １􀆰 ６１５。 理论最高丁醇丙酮质量比 ２􀆰 ３３３ 只
有当 Ｌ２环代谢强度为 ０ 时才能实现，但在实际发酵
过程中这种情况是不可能实现的。 如图 ３（ｂ）所示，
将 Ｌ１环的代谢强度系数设为 ０，当 Ｌ２环的代谢强度
系数由 ０ 逐步升至 ０􀆰 ４ 时，丁醇丙酮质量比由
２􀆰 ３３３ 快速降至 １􀆰 ４００；将 Ｌ１环的代谢强度系数设为
０􀆰 ２，当 Ｌ２环的代谢强度系数由 ０ 逐步升至 ０􀆰 ３５ 时，
丁醇丙酮质量比由 ２􀆰 ３３３ 快速降至 １􀆰 ３１３。
α３ ∶ α２ ＝ ０􀆰 ９３∶ ０􀆰 ０７；β２ ∶ β１ ＝ ０􀆰 ７∶ ０􀆰 ３；Ｌ１ ＝ α１， α２ ＋ α３ ＝ １ － α１ ＝ １ － Ｌ１；Ｌ２ ＝ γ１， γ２ ＝ １ － γ１ ＝ １ － Ｌ２，
丁醇和丙酮质量比为常数，单位用（－）表示
图 ３　 利用图论理论估算丁醇丙酮质量比的结果
Ｆｉｇ． ３　 Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｂｕｔａｎｏｌ ａｃｅｔｏｎｅ ｒａｔｉｏ ｕｓｉｎｇ ｇｒａｐｈ ｔｈｅｏｒｙ
４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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　 　 由以上计算结果可知，要获得较高的丁醇丙酮质
量比，可以采取以下措施：严格限制 Ｌ２环的代谢强度；
如果不能有效限制 Ｌ２环的代谢强度，可通过限制 Ｌ１
环的代谢强度稍加改善。 而调节丁酸环和乙酸环代
谢强度可以通过以下方法来实现：①筛选高丁醇产量
且高丁醇丙酮质量比的优良菌株；②添加微量电子载
体（如中性红、甲基紫等）；③寻求新的发酵原料。 方
法①难以实现，因为其常常伴随总溶剂或丁醇产量的
降低；方法②会增加下游产物回收精制的难度（电子
载体大多为染色剂，需要对发酵液进行褪色处理）；只
有方法③有可能在保持高产且不增加产物回收成本
的情况下实现高丁醇，低丙酮这一目标。
２． ２　 以木薯和玉米为原料的丁醇发酵性能比较
丁醇发酵一般分为 ２个阶段 （相），第一个阶段为
产酸期，该阶段乙酸和丁酸大量生成；第二个阶段为产
溶剂期，有机酸边合成边消耗，丁醇、丙酮和乙醇开始
生成积累。 郑钧屏等［１３］研究发现，以木薯为原料的丁
醇发酵，由产酸期向产溶剂期过渡时存在严重的相转
型延迟现象。 当相转型延迟出现时，向培养基中添加
酵母浸粉（终质量浓度为 ２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ），可以刺激相转型
顺利完成，使发酵性能得到大幅提高。 利用实时荧
光定量 ＰＣＲ测定丁醇合成代谢途径中关键酶编码
基因的转录水平，结果表明酵母浸粉的添加可以使
ＣｏＡ 转移酶的编码基因 ｃｔｆＡＢ 的转录水平提高近
１５ 倍［１４］，因此分别以木薯和玉米为原料，采用传
统、油醇萃取和生物柴油萃取这 ３ 种发酵方式，并对
相应发酵方式下不同原料发酵的性能进行了比较。
在丁醇发酵产溶剂阶段，乙酸和丁酸在生成的同
时也在消耗，此时它们的浓度变化可间接反映 Ｌ１和
Ｌ２环的代谢强度：酸的浓度越高，说明该闭环路径的
代谢强度越大。 图 ４（ａ）、４（ｂ） 分别是传统发酵和油
醇萃取发酵条件下，２ 种培养基中乙酸与丁酸浓度的
变化曲线。 由图 ４（ａ）、４（ｂ）可知，在传统发酵中，产
溶剂期的时间较短（３０ ｈ左右），２ 种培养基中乙酸与
丁酸浓度变化规律不明显；在油醇萃取发酵中，产溶
剂期被显著延长（达６０ ｈ），乙酸与丁酸浓度变化趋势
得到充分体现。 ２ 种培养基中的乙酸浓度虽存在一
定差异，但相对其绝对浓度来说，该差值可以忽略。
由此可见，木薯原料的使用对 Ｌ１环代谢强度的影响并
不明显。 对于丁酸而言，该影响却比较显著：在 ２ 种
发酵方式中，玉米培养基中丁酸浓度一直维持在较高
的水平，而木薯培养基中丁酸浓度约为玉米培养基的
５０％，即表明以木薯为原料丁醇发酵的 Ｌ２环代谢强度
较弱。 基于以上数据，对 ２ 种原料丁醇发酵的 ｍ（丁
醇） ／ ｍ（丙酮）进行了模拟和计算。 在标准模拟条件
（玉米：Ｌ１ ＝ ０􀆰 ２，Ｌ２ ＝ ０􀆰 ２；木薯：Ｌ１ ＝ ０􀆰 ２，Ｌ２ ＝ ０􀆰 １）
下，利用图论计算得出的丁醇丙酮质量比分别为
１􀆰 ７５０和 ２􀆰 ０４２（表 １），即以木薯为原料丁醇发酵的丁
醇丙酮质量比相对于以玉米为原料的提高了 １６􀆰 ７％。
在实际的实验中，以木薯为原料丁醇发酵的丁醇丙酮
质量比可达２􀆰 ２４，相对于以玉米为原料的 １􀆰 ９８ 提高
了 １２􀆰 ９％，木薯原料萃取发酵（油醇和生物柴油）的
丁醇丙酮质量比分别为 ２􀆰 ８４ 和 ２􀆰 ９１，相对于以玉米
为原料的 １􀆰 ７６ 和 ２􀆰 ０５ 提高了 ６１􀆰 ４％和 ６􀆰 ７％，而且
总丁醇产量和丁醇生产效率也和以玉米为原料的基
本持平（图 ４（ｃ）、４（ｄ），表 １）。 实验结果与理论计算
结果相一致，表明在提高丁醇丙酮质量比方面，木薯
原料优于玉米原料。
表 １　 在不同发酵条件下以木薯和玉米为原料的发酵性能比较
Ｔａｂｌｅ １　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉｏｕｓ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｓ ｗｉｔｈ ｃｏｒｎ ｏｒ ｃａｓｓａｖａ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉｕｍ
发酵批次 发酵时间 ／ｈ
ρ（水相丁醇） ／
（ｇ·Ｌ － １）
ρ（总溶剂） ／ （ｇ·Ｌ － １）
丁醇 丙酮
ｍ（丁醇） ／
ｍ（丙酮）
（－）
丁醇生产效率 ／
（ｇ·Ｌ － １·ｈ － １）
培养基
总产气量 ／ Ｌ
Ｔ１ ６５ １１． ６３ １１． ６３　 　 　 　 ５． ８６ １． ９８５ ０． １７９ ２３． ２６
Ｔ２ ５１ １３． ６１ １３． ６１ ６． ０７ ２． ２４２ ０． ２６７ ３９． ７１
Ｅ１ ＯＡ １０２ ８． １９ ３５． ８７（２７． ６８∗） ２０． ３７ １． ７６１ ０． ３５２ ８６． １３
Ｅ２ ＯＡ １０１ ７． ０７ ３４． ３７（２７． ３０∗） １２． １２ ２． ８３６ ０． ３４０ ７７． ７４
Ｅ１ ＢＤ ９０ ８． ８０ １８． ３７（９． ５７∗） ８． ９５ ２． ０５２ ０． ２０４ ３２． ８７
Ｅ２ ＢＤ ９０ ８． ３７ １９． ４７（１１． １０∗） ８． ８９ ２． １９０ ０． ２１６ ４８． １６
培养基 标准模拟条件
玉米培养基 Ｌ１ ＝ ０． ２，Ｌ２ ＝ ０． ２ １． ７５０
木薯培养基 Ｌ１ ＝ ０． ２，Ｌ２ ＝ ０． １ ２． ０４２
　 注：Ｔ１—玉米传统发酵；Ｅ１ ＯＡ—玉米油醇萃取发酵；Ｅ１ ＢＤ—玉米生物柴油萃取发酵；Ｔ２—木薯传统发酵，在 ２１ ｈ添加酵母浸粉；Ｅ２ ＯＡ
和 Ｅ２ ＢＤ—木薯油醇萃取发酵和木薯生物柴油萃取发酵，分别在 ２８ 和 ３９ ｈ添加酵母浸粉；∗括号中数据为萃取相中的丁醇质量浓度。
５　 第 ４ 期 李　 乐等：木薯和玉米原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比的图论理论计算及其验证
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（ａ）、（ｃ）—传统发酵；（ｂ）、（ｄ）—油醇萃取发酵；↓—添加酵母浸粉的时间节点
图 ４　 木薯和玉米原料丁醇发酵中有机酸与溶剂产量的比较
Ｆｉｇ． ４　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔｓ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｂｕｔａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ
ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｒｎ ａｎｄ ｃａｓｓａｖａ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉａ
ｒｂ ／ ｒａ—丁醇和丙酮生成速率之比；↓—添加酵母浸粉的时间节点
图 ５　 以玉米和木薯为原料油醇萃取发酵中 ｒｂ ／ ｒａ、产气量和 Ｖ（Ｈ２） ／ Ｖ（ＣＯ２）的比较
Ｆｉｇ． ５　 Ｂｕｔａｎｏｌ ／ ａｃｅｔｏｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ， ｇａｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｍｏｕｎｔｓ ａｎｄ Ｖ（Ｈ２） ／ Ｖ（ＣＯ２） ｒａｔｉｏ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｃｏｒｎ
ａｎｄ ｃａｓｓａｖａ ｂａｓｅｄ ｍｅｄｉａ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓ ｕｓｉｎｇ ｏｌｅｙｌ ａｌｃｏｈｏｌ
　 　 由丁醇代谢网络 （图 １（ａ）） 可知，Ｈ２主要由包
含铁氧还蛋白 （Ｆｄ 还原态 ／氧化态）、Ｆｄ⁃ＮＡＤ 还原
酶和 Ｆｄ⁃ＮＡＤＨ还原酶的电子往复穿梭传递系统以
及含铁氢化酶协同作用生成，ＣＯ２主要在丙酮酸→
乙酰 ＣｏＡ和乙酰乙酸→丙酮这两步反应中生成。
Ｈ２释放量在一定程度上反映了细胞内电子流的分
配情况，而 ＣＯ２生成量也可以间接的反映细胞内碳
代谢的情况；因而，Ｖ（Ｈ２） ／ Ｖ（ＣＯ２）是反映细胞内电
子流与碳流相互作用的重要参数。
图 ５ 是以木薯和玉米为原料油醇萃取发酵中，
二者丁醇丙酮生成速率比、总产气和 Ｖ （ Ｈ２ ） ／
Ｖ（ＣＯ２）的变化曲线。 由图 ５（ｂ） 可知，２ 种原料发
酵的总产气量相差不大，而玉米原料发酵的Ｖ（Ｈ２） ／
Ｖ（ＣＯ２）与木薯原料发酵的相比高出很多。 另外，由
图 ５（ａ）可知在产溶剂阶段，木薯原料发酵的丁醇和
丙酮生成速率比 （ ｒｂ ／ ｒａ） 维持在 ３． ２ ～ ３． ５，相对于
玉米原料的 ２． ０ ～ ２． ２ 提高了近 ６０％ 。 笔者推测在
产溶剂期，木薯原料丁醇发酵的电子往复穿梭传递
６ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
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系统更倾向于将电子转移给 Ｆｄ⁃ＮＡＤ 还原酶合成
ＮＡＤＨ，相应流向氢化酶合成 Ｈ２的电子则大幅减少，
使得 Ｖ （ Ｈ２ ） ／ Ｖ （ ＣＯ２ ） 处于较低的水平；充裕的
ＮＡＤＨ使丁醇合成速率大幅提高，从而使 ｒｂ ／ ｒａ与玉
米原料的相比提高显著。 此外，在生物柴油萃取发
酵中，高丁醇丙酮质量比的木薯发酵所得改良型生
物柴油中丁醇浓度与玉米发酵的相比提高了 １６％ ，
性能得到进一步提高。
２． ３　 木薯原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比提高的
机制讨论
　 　 在丁醇发酵产溶剂阶段，如果 Ｌ１和 Ｌ２环的代谢
强度均维持在较高水平，会有大量额外的 ＡＴＰ 产生
（图 １（ ａ）），非常有利于总溶剂产量的提高。 ＡＴＰ
的增加能够促进细胞的生长和细胞代谢活性的提
高，但不会提高丁醇丙酮质量比。 有研究表明，胞
内同时存在高水平的 ＡＴＰ和高浓度的丁酸 （Ｌ２环代
谢强度较高），可以刺激与丁醇和丙酮合成相关酶
的活性，同时会减弱电子穿梭传递系统合成 ＮＡＤＨ
的能力，进而造成胞内 ＮＡＤＨ 的匮乏［１５］。 如图 １
（ａ） 所示，丁醇合成需要大量的还原力 ＮＡＤＨ 和
Ｈ２，而丙酮合成则不需要。 因此，当 Ｌ１和 Ｌ２环的代
谢强度均较高时，丁醇丙酮质量比可能会因为
ＮＡＤＨ供应不足而降低。 在以木薯和玉米为原料的
发酵过程中，二者的 Ｌ１环代谢强度相当，而玉米发
酵中 Ｌ２环的代谢强度较高。 笔者认为还原力 ＮＡＤＨ
合成能力不足是导致玉米原料发酵中丁醇丙酮质
量比低下的一个重要原因。 而以木薯为原料的丁
醇发酵中，胞内 ＡＴＰ 和丁酸浓度均较低，丁醇丙酮
质量比则相对较高。
３　 结　 论
重点探讨了利用图论理论推算丁醇丙酮质量比
的可行性，计算结果表明：丁酸形成和再利用闭环路
径 （Ｌ２环） 是影响丁醇丙酮质量比的主要因素，并且
Ｌ２环的代谢强度越低，丁醇丙酮质量比越高。 此推算
结果与以木薯和玉米为原料丁醇发酵的实验结果相
一致。 在木薯原料丁醇发酵中，丁酸的浓度约为玉米
原料发酵的一半，且最终的丁醇丙酮质量比达 ２􀆰 ２４，
相比于玉米原料发酵的１􀆰 ９８提高了１２􀆰 ９％；而且在木
薯生物柴油萃取发酵中，生物柴油中丁醇含量相对于
玉米生物柴油萃取发酵的提高了 １６％，进一步提升
了改良型生物柴油的品质，使其可直接作为高品质柴
油来使用。
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ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅ ＂ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｉｍｐｒｏｖｅｄ＂ ｂｉｏｄｉｅｓｅｌ ａｎｄ
ｂｕｔａｎｏｌ ｉｎ ａ ｗａｔｅｒ ａｎｄ ｅｎｅｒｇｙ⁃ｓａｖｉｎｇ ｏｐｅｒａｔｉｏｎ ｗａｙ ［ Ｊ ］． Ｊ
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ｏｆ ｂｉｏ⁃ｂｕｔａｎｏｌ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｙ Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ
ＡＴＣＣ８２４ ｕｓｉｎｇ ｃａｓｓａｖａ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ［ Ｊ］ ． Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ Ｔｅｃｈｎｏｌ，
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１１⁃１６．
７　 第 ４ 期 李　 乐等：木薯和玉米原料丁醇发酵中丁醇丙酮质量比的图论理论计算及其验证
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