全 文 ：第 35 卷第 5 期
2015年 3月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.35,No.5
Mar.,2015
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(31000122, 31270450); 重庆市自然科学基金(cstc2012jjA80022); 教育部作物资源利用创新引智基地(B12006)
收稿日期:2013鄄05鄄07; 摇 摇 网络出版日期:2014鄄04鄄17
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: ljn1950@ swu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201305070972
倪郁,宋超,李加纳.UV鄄B辐射增强对拟南芥表皮蜡质的影响.生态学报,2015,35(5):1505鄄1512.
Ni Y, Song C, Li J N.Effect of enhanced ultraviolet鄄B radiation on epicuticular wax in Arabidopsis thaliana.Acta Ecologica Sinica,2015,35(5):1505鄄1512.
UV鄄B辐射增强对拟南芥表皮蜡质的影响
倪摇 郁,宋摇 超,李加纳*
西南大学农学与生物科技学院,南方山地农业教育部工程技术中心,重庆摇 400716
摘要:以野生型拟南芥、蜡质不同程度缺失突变体 CER1、CER3、CER4、CER6、CER10、CER20 及 KCS1 为试验材料,通过施加 50
滋W/ cm2、长达 10 d的 UV鄄B辐射,研究了拟南芥表皮蜡质晶体结构、组分及蜡质基因对 UV鄄B辐射的响应机制。 结果表明:UV鄄
B辐射增强改变了拟南芥表皮蜡质晶体结构,表皮蜡质松针状(CER1)、柱状、杆状(CER3、CER10与 KCS1)晶体结构显著减少,
球状蜡质晶体类型出现在 CER6表面,无规则片状、膜状结构覆盖在 KCS1与 CER10茎表面。 野生型拟南芥蜡质晶体结构类型
无明显变化,但在部分区域积累了大量水平杆状、管状结构,增加了蜡质层厚度。 UV鄄B辐射增强也改变了拟南芥表皮蜡质组分
的分泌量。 野生型在 UV鄄B处理后一级醇、酸、醛含量显著上升,烷、次级醇及酮含量显著下降,蜡质总量增加不显著。 一级醇
含量的增加及酮和次级醇含量的减少在拟南芥各材料响应 UV鄄B 辐射中具有普遍性。 UV鄄B 辐射增强诱导了野生型 CER3、
CER4、KCS1基因表达的上调,其中 CER4大量表达,促进了蜡质组分中一级醇、酸和醛含量的积累;CER1 在 UV鄄B 处理后表达
量下调,可能导致烷合成下游分支途径相关产物(烷类、次级醇及酮类)的减少。 WIN1 表达量的下调对蜡质总量没有显著影
响。 UV鄄B辐射增强使蜡质前体从烷合成分支途径更多地转向一级醇分支途径。
关键词:拟南芥;表皮蜡质;基因;UV鄄B辐射;蜡质突变体
Effect of enhanced ultraviolet鄄B radiation on epicuticular wax in Arabidopsis
thaliana
NI Yu, SONG Chao, LI Jiana*
College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing
400716, China
Abstract: Due to the depletion of stratospheric ozone (O3), the quantity of UV鄄B radiation reached the earth忆s surface has
increased significantly. Enhanced UV鄄B radiation influenced plant growth, development and productivity by damaging DNA,
RNA, and proteins. Plants are thought to employ a variety of UV鄄B protective mechanisms, including accumulation of a
range of secondary metabolites and adaptive changes in plant morphological features. As the outer surface of aerial plant
tissues, the epicuticular wax is believed to play an important role in protecting plants against ultraviolet鄄B radiation.
Epicuticular wax was composed primarily of saturated free fatty acids, aldehydes, alkanes, primary alcohols, secondary
alcohols, ketones, and wax esters. Arabidopsis, as a model system to study the genetics and the molecular biology, has the
typical structure and composition of cuticle, and it should be a model system to study the ecology of epicuticular waxes.
However, little is known as to the responsees of different wax constituents to enhanced UV鄄B radiation, and the role of
epicuticular waxes in providing protection for Arabidopsis from UV鄄B has not been examined either. Therefore, in the current
study, seven wax mutants (CER1, CER3, CER4, CER6, CER10, CER20 and KCS1) and wild type of A. thaliana were
selected to analyze the responses of epicuticular wax in crystalloid structure, content and constituents, and wax related gene
to UV鄄B radiation (50 滋W / cm2) . The plants accepted UV鄄B radiation 2 h every day for consecutive 10 days. The results
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showed that enhanced UV鄄B radiation altered the crystalloid structure of epicuticular wax on Arabidopsis stems. Under the
enhanced UV鄄B radiation, amounts of pine needle鄄shaped crystalloids (CER1), columnar鄄shaped crystalloids and rods
(CER3、CER10 and KCS1) decreased significantly. Some small globular鄄shaped crystalloids appeared on the surface of
CER6 mutant. Some irregular plate鄄 and membrane鄄shaped structures covered the surface of KCS1 and CER10. No
significant change of crystalloid types was observed on the stem of the Arabidopsis wild type; however, many horizontal rod
and tube crystalloids accumulated in specific zones, which increased the thickness of cuticle. Enhanced UV鄄B radiation also
altered the secretion quantities of wax constituents. Under UV鄄B radiation, the contents of primary alcohols, fatty acids and
aldhydes in Arabidopsis wild type increased significantly, the contents of alkanes, secondary alcohols and ketones decreased
significantly, while the contents of total wax changed insignificantly. Under UV鄄B radiation, the increase of primary alcohols
and the decrease of secondary alcohols and ketones were universal in Arabidopsis mutants. Enhanced UV鄄B radiation
upregulated the expression of CER3, CER4 and KCS1, which promoting the accumulation of primary alcohols, fatty acids
and aldehydes. The decreased expression of CER1 under UV鄄B radiation might lead to the reduction of products from alkane鄄
synthesizing branch of the pathway, including alkanes, secondary alcohols and ketones. The decreased expression of WIN1
under UV鄄B radiation had no effect on the content of total wax, implying that the accumulation of total wax was a result of
comprehensive effects of multi genes involved in wax synthesis pathway. Enhanced UV鄄B radiation shunted wax precursors
away from the alkane鄄synthesizing branch to primary alcohol branch of the pathway.
Key Words: Arabidopsis thaliana; epicuticular wax; gene; UV鄄B radiation; wax mutants
大气臭氧层减薄导致的紫外线 B(UV鄄B,280—320 nm)辐射增强是当今人类面临的全球性重大环境问题
之一[1鄄4]。 研究 UV鄄B 辐射增强对植物的伤害作用以及植物响应 UV鄄B辐射的防御与修复机制,对于促进 UV鄄
B辐射环境下植物的正常生长发育以及作物的高产、稳产均具有重要的理论意义。 植物叶片形态特征的变化
是植物对环境胁迫的防御反应之一。 前人研究表明,植物叶表皮毛的结构与密度、蜡质层及表皮细胞层的厚
度均影响紫外线辐射能否穿透到叶肉细胞[5];蜡质含量高的植物叶片比含量低的叶片能吸收更多的紫外
线[6]。 表皮蜡质主要由可溶性的超长链脂肪酸、烷烃、一级醇、二级醇、脂肪醛、酮类和酯类组成。 前人对 UV鄄
B辐射与植物表皮蜡质互作研究主要集中在对表皮蜡质组分及含量的化学分析上[7鄄11],而对表皮蜡质响应
UV鄄B辐射变化的分子机制了解甚少。 拟南芥作为研究遗传学和分子生物学的一种模式植物,具有典型的角
质层结构及组份。 因此,拟南芥在植物角质层的生态学特性研究上也应该是个模式系统。 在包括拟南芥在内
的大多数植物中,角质层蜡生物合成主要依靠蜡质前体超长链脂肪酸(very long chain fatty acids, VLCFAs)通
过脱羰基途径(烷合成途径)与酰基还原途径(一级醇合成途径)进行[12]。 在拟南芥蜡质合成途径中,一些蜡
质相关基因陆续被克隆,如蜡质前体 VLCFAs合成基因 KCS1[13]、催化生成一级醇的脂肪酰鄄CoA 还原酶基因
CER4[14]、醛类合成相关基因 CER3[15]、烷类合成基因 CER1[16,17]及表皮蜡质过量表达转录因子 WIN1[18]等。
这些蜡质基因的分离鉴定为揭示蜡质组分在植物中的功能奠定了分子基础。 本试验以野生型拟南芥以及蜡
质不同程度缺失突变体为试验材料,研究 UV鄄B 辐射增强条件下表皮蜡质含量、组分及蜡质晶体结构的变化
规律;分析 UV鄄B辐射诱导表达的主要蜡质基因、特异性蜡质组分,为深入揭示植物表皮蜡质与 UV鄄B 辐射互
作机制积累基础资料。
1摇 材料与方法
1.1摇 试验材料
哥伦比亚野生型(Columbia鄄0 ecotype) 拟南芥种子来源于西南大学植物生理生化研究室,其余表皮蜡质突
变体 CER1、CER3、CER4、CER6、CER10、CER20及 KCS1种子均购于拟南芥资源中心(ABRC,USA)。 突变体特征
如表 1所示。 蛭石、珍珠岩和有机土按 1颐1颐1的比例混匀,装入花盆(7 cm伊8 cm),将低温春化后的种子播在花盆
中,每盆 4 株,然后用塑料薄膜覆盖 5 d 以利于出苗。 试验材料放置在人工气候培养箱中培养,温度为 21 益 /
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23 益(黑夜 /白天),光照每天 16 h,空气湿度为 75%。 待植株生长至 5—6 周时进行 UV鄄B胁迫处理。
表 1摇 拟南芥表皮蜡质突变体特征
Table 1摇 Characteristics of the Arabidopsis thaliana cuticular wax mutants
突变体
Mutants
突变基因
Mutanted gene
茎表皮蜡质化学组成的变化
Alteration in chemical composition of cuticular
waxes on inflorescence stems
CER1 CER1:催化烷类物质合成 烷、次级醇、酮减少
CER3 CER3:参与催化醛类与烷类的合成 碳链长度多态性增加
CER4 CER4:催化生成一级醇 一级醇减少
CER6 KCS6:催化 VLCFAs(very long chain fatty acids)合成 碳链长度多态性减少
CER10 CER10:催化 VLCFAs合成 碳链长度增加
CER20 未知 蜡总量、次级醇、酮微量减少
KCS1 KCS1:催化 VLCFAs合成 碳链长度多态性减少
1.2摇 UV鄄B辐射处理
在植物培养室内使用日光灯管提供正常光照,使用 Philips 公司的 UV鄄B 灯管(TL30W / 03,波峰 308 nm)
进行 UV鄄B辐射处理,UV鄄B灯管用 0.13 mm厚度的醋酸纤维素膜滤除少量 UV鄄C,每隔 3 d 更换 1 次。 UV鄄B
处理的拟南芥植株每天 10:00—12:00 增施 UV鄄B 辐射,辐射强度 50 滋W / cm2。 通过调节紫外灯管与材料间
的高度控制紫外辐射强度。 紫外辐射剂量用 UV鄄 340A 紫外光照度计(Lutron, 台湾) 测定。 连续处理 10 d
后,采集茎秆用于表皮蜡质提取、电镜扫描分析及基因表达检测。 每种材料不同处理各设 3 个重复。
1.3摇 表皮蜡质形态结构观察
采用扫描电子显微镜(S3000鄄N,Hitachi)观察蜡质晶体结构。 将植株茎秆分成 1 cm 长小段,间隔贴于电
镜载物台上,进行离子溅射镀金膜,镀金后材料进行电镜扫描观察、拍照。
1.4摇 表皮蜡质含量和组分分析
利用气相色谱鄄质谱联用仪(GCMS鄄QP2010 plus)测定分析蜡质组成与含量。 采集植株茎杆放入含有 10
mL氯仿的试管中浸提 30 s,以提取表面蜡质,样品中加入 C16烷作为内部标准。 氮吹仪吹干浸提液,在 100 益
下用 80 滋L BSTFA衍生 20 min,再经氮气吹干后,溶于 200 滋L 正己烷中,进行色谱鄄质谱分析。 程序升温方
式:初温 80 益,保持 2 min;每分钟 15 益升温至 260 益,保持 10 min。 然后每分钟 5 益升温至 320 益,保持 5
min。 基于 FID峰值量化蜡质,根据内部标准物(C16烷)的浓度计算各蜡质组分含量。 蜡质含量用单位面积上
的微克数(滋g / cm2)进行表示。 茎秆面积测定采用数字化扫描仪(EPSON V750)和 WinFOLIA 专业叶片图像
分析系统(Regent Instrument Inc, Canada)进行分析并记录。
1.5摇 qRT鄄PCR分析
1.5.1摇 样品 RNA的提取与 cDNA合成
采用 Trizol试剂盒(invitrogen)分别提取对照与 UV鄄B处理野生型拟南芥茎秆总 RNA,DNase I(宝生物工
程有限公司)消化去除基因组 DNA。 样品 mRNA 的反转录依照北京全式金生物技术有限公司的 TransScript
First鄄Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒进行。
1.5.2摇 qPCR 分析
qPCR反应在 Mx3000P 荧光定量 PCR仪(StrataGene, USA)上进行。 反应体系按照 iTaq Universal SYBR
Green Supermix试剂盒(BIO鄄RAD)说明配制,设 3 次重复。 待分析的蜡质基因有:参与烷类物质合成的
CER1、参与醛类物质合成的 CER3、催化 VLCFAs 还原生成一级醇的脂肪酰鄄CoA 还原酶基因 CER4、催化
VLCFAs合成的第一步缩合反应的 茁鄄酮脂酰鄄COA合酶 KCS1、控制表皮蜡质积累的转录因子 WIN1,Actin7 为
内参基因。 本实验所使用引物序列如表 2所示。 数据收集和处理在 MXPro v4.10 软件(StrataGene, USA)中
进行。 UV鄄B胁迫下蜡质基因表达水平的变化以相对表达量表示,即 UV鄄B 胁迫下蜡质基因的表达量与对照
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植株蜡质基因表达量的比值。
表 2摇 qPCR相关引物
Table 2摇 Sequences of the primers used in qPCR
名称
Name
正向引物
Forward primer
反向引物
Reverse primer
CER1 GCTCTCTGCCAGAGAGGCGTTCA TCCCACCAGCCATACCTTGTTTGAT
CER3 CTATACTCCAACGTACCATAGTCTGCATCA AACTCCGGCACTCTCTTCCGTT
CER4 GGTTCTTAGCAAATATCTTTGTGGAGAAGA TCCTTCAGCACCTTGAACAAATCTTT
KCS1 TTCGATACGTTCTCTGAGCTTTGGTC TTTACGCTCGTCTTCCGGTTTGTA
WIN1 GTCATCCTCTCTTGAAACGGAGGATTT CGGAAGTTTCTCCGGTGTTGTTGT
Actin7 GTGACAATGGAACTGGAATGGTGA GGACTGAGCTTCATCACCAACGTAA
1.6摇 数据分析
采用 SPSS13.0软件分析 UV鄄B处理对拟南芥茎表皮蜡质含量、蜡质基因表达量的影响。 显著水平为 P<
0.05(LSD检验)。
2摇 结果与分析
2.1摇 UV鄄B辐射增强对拟南芥蜡质晶体结构的影响
野生型拟南芥茎蜡质结构主要由垂直柱状结构与水平片状结构组成,此外还存在少量杆状、管状、和伞状
结构。 与野生型相比较,各蜡质突变体总体上表现出蜡质晶体分布密度减少,晶体结构的形状与大小发生改
变。 UV鄄B辐射处理后,拟南芥各材料表现出不同程度的茎干与莲座叶枯黄现象,其中突变体材料受 UV鄄B 辐
射 影响普遍较野生型严重。扫描电镜显示(图1,图2) ,CER1在受到UV鄄B辐射处理后,松针状晶体结构
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图 1摇 增强 UV鄄B辐射下拟南芥野生型(WT)和蜡质突变体(CER1、CER3、CER4)茎表皮蜡质晶体结构的变化(10 滋m)
Fig.1摇 Effects of enhanced UV鄄B radiation on crystalloid structures of epicuticular wax on stem in Arabidopsis thaliana wild type (WT) and
mutants (CER1, CER3, CER4)
图 2摇 增强 UV鄄B辐射下拟南芥突变体(CER6、CER10、CER20、KCS1)茎表皮蜡质晶体结构的变化(10 滋m)
Fig.2摇 Effects of enhanced UV鄄B radiation on crystalloid structures of cuticular wax on stem in Arabidopsis thaliana mutants( CER6,
CER10, CER20, KCS1)
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减少并显著变短。 CER3、CER10与 KCS1在 UV鄄B辐射处理后柱状、杆状晶体结构显著减少;CER10 局部出现
边界不清的“无定型冶膜状结构覆盖茎表面;而 KCS1则出现许多水平无规则片层结构。 CER20蜡质晶体体积
减小,但数量增加。 UV鄄B辐射处理对一级醇减少突变体 CER4结构无显著影响,处理前后均以垂直片状结构
为主。 CER6在 UV鄄B辐射处理后蜡质晶体形状发生变化,一些小型球状蜡质晶体出现。 UV鄄B 辐射处理后,
野生型拟南芥局部区域积累了大量水平杆状、管状结构。
图 3摇 增强的 UV鄄B辐射对拟南芥野生型和蜡质突变体茎表皮蜡质含量的影响
Fig.3摇 Effects of enhanced UV鄄B radiation on contents of wax constituents and total wax in stems of Arabidopsis wild type and mutants
同一品种中数据柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
2.2摇 UV鄄B辐射增强对拟南芥表皮蜡质组分含量的影响
拟南芥各材料经 UV鄄B处理(图 3),一级醇含量显著上升(CER6、CER10 增加不显著),醛类与酸类含量
增加或无显著变化(KCS1酸类含量显著减少),次级醇、酮含量下降或无显著变化,烷及蜡总量在不同材料中
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变化不一致。 野生型在 UV鄄B处理后一级醇、酸、醛含量显著上升,烷、次级醇及酮含量显著下降,蜡质总量无
显著变化(图 3)。
2.3摇 蜡质合成相关基因表达对 UV鄄B辐射的响应
本试验对蜡质前体 VLCFAs合成基因 KCS1、催化生成一级醇的脂肪酰鄄CoA还原酶基因 CER4、醛类合成
相关基因 CER3、烷类合成基因 CER1、及表皮蜡质过量表达转录因子 WIN1 对 UV鄄B 辐射的响应进行了调查。
结果表明,这 5个蜡质基因在野生型拟南芥中均有表达。 在增强的 UV鄄B辐射下,蜡质相关基因 CER3、CER4、
KCS1表达量上调,其中 CER4表达量是对照植株的 13.64 倍。 而 UV鄄B 处理植株的 CER1 与 WIN1 表达量下
调,分别是对照植株的 0.09倍和 0.01倍(图 4)。
摇 图 4摇 增强的 UV鄄B 辐射对野生型拟南芥相关蜡质基因表达的
影响
Fig.4摇 Effects of enhanced UV鄄B radiation on the transcript of
wax鄄related gene in Arabidopsis wild type
相对表达量为 UV鄄B处理植株的表达量与对照植株表达量的比值
3摇 讨论
强紫外线辐射下,植物采取一系列防御措施以适应
环境条件的改变,如减少叶面积、节间长度及生物
量[19];叶片表面玻璃化[20];合成大量类黄酮类物质以
提高对紫外线的吸收能力等[21鄄22]。 植物表皮蜡质在减
少紫外线辐射伤害方面也发挥着积极作用,如玉米蜡质
缺失突变体出现了比野生型更多的卷叶及 DNA损伤现
象[6,23]。 各拟南芥材料经 UV鄄B 处理后表现出不同程
度的茎干与莲座叶枯黄现象,其中蜡质突变体材料枯
黄、萎蔫程度大于野生型拟南芥。
前人研究报道,叶表皮蜡质晶体结构不同,其叶片
对光的反射率也不尽相同,如水平片状蜡质结构比垂直
片状结构及光滑表面有更强的反射率[24]。 本实验中
UV鄄B辐射处理除了对 CER4 与 CER20 蜡质晶体结构
无显著影响外,其余突变体材料蜡质晶体结构均发生了一定的变化。 例如,UV鄄B 辐射处理后,表皮蜡质松针
状(CER1)、柱状、杆状(CER3、CER10 与 KCS1)晶体结构显著减少;CER10 与 KCS1 不同程度出现无规则膜
状、片状结构覆盖在茎表面等。 野生型拟南芥蜡质结构类型虽然无明显变化,但在部分区域积累了大量水平
杆状、管状结构,增加了蜡质层厚度。 紫外线辐射下,植物蜡质层厚度是影响紫外线辐射到达叶肉细胞的因素
之一[5]。 UV鄄B辐射诱导的拟南芥蜡质晶体结构变化反映了植物的一种主动调节适应过程。
蜡质总量对 UV鄄B辐射的响应在不同植物中是不一样的。 UV鄄B 处理条件下大麦(Hordeum vulgare)、黄
瓜(Cucumis sativus)等蜡质含量增加[25],云杉 (Picea asperata)蜡质含量变化不显著[10],烟草 (Nicotiana
tabacum)蜡质含量降低[26]。 UV鄄B处理后的不同材料间蜡质总量总体上呈现出不变或增加趋势(CER10 蜡质
总量在 UV鄄B处理后下降)。 蜡质组分中一级醇含量在 UV鄄B处理后普遍上升,酮和次级醇含量普遍下降,暗
示了拟南芥植株可通过改变特定蜡质组分的分泌量来响应 UV鄄B 胁迫。 在增强的 UV鄄B 辐射下,挪威云杉叶
表蜡质中二十九烷含量显著增加,烷基酯含量显著下降[10];黄瓜子叶的主要蜡质组分———烷和一级醇的种类
和含量发生改变[11]。
拟南芥角质层蜡生物合成主要依靠蜡质前体 VLCFAs 通过一级醇分支途径与烷合成分支途径进行[12]。
野生型拟南芥 qRT鄄PCR结果表明,CER3、CER4、KCS1在 UV鄄B辐射处理后表达量上调,增强的 UV鄄B 辐射诱
导了 CER4基因的大量表达。 这 3个基因的表达上调解释了蜡质组分中一级醇、酸和醛含量在受到 UV鄄B 胁
迫后的显著增加。 另外一方面,CER1与 WIN1在 UV鄄B辐射处理后表达量下调。 CER1 催化长链醛到烷的转
化,其表达量的降低可能会导致烷合成下游分支途径相关产物的减少及醛的积累。 野生型拟南芥在受到 UV鄄
B胁迫后烷类、次级醇及酮类的显著下降证明了这一点。 WIN1作为表皮蜡质过量表达时的转录因子,其表达
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量的降低将影响蜡质总量的积累。 但在本实验中,野生型拟南芥蜡质总量无显著变化,说明蜡质数量的积累
受蜡质合成途径中上、下游相关蜡质基因的共同作用。 综合分析蜡质组分与基因表达结果表明,增强 UV鄄B
辐射使蜡质前体从烷合成分支途径更多地转向了一级醇分支途径。
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