全 文 ：Mav2008
· 62·
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
第6卷第3期
2008年5月
木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化
周晨妍1，李东峰1，邬敏辰1’2，王武1
(1．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122；
2．江南大学 医药学院，无锡214122)
摘要：对来源于宇佐美曲霉(Aspergillususamii)E001的木聚糖酶XynII进行同源建模和序列比较，发现第11族
木聚糖酶的催化结构域在卢折叠股A3和B3之间存在一个保守的氨基酸位点，该位点与木聚糖酶的pH特性有关，
据此设计了XynII的D37N定点突变。酵母表达的XynnD37N经纯化后与原酶XynII(同样经毕赤酵母表达后纯
化)进行酶学性质比较，结果表明，XynII。。的最适pH由4．2升高到5．3，pH稳定范围由3．O一7．5缩减为3．O一
5．5，但最适温度和热稳定性基本保持不变。结果证实，木聚糖酶XynII的第37位Asp与最适pH相关，为进一步
的结构与功能研究提供了理论基础。
关键词：宇佐美曲霉；突变；定点；木聚糖酶
中图分类号：Q786；TQ925文献标识码：A 文章编号：1672—3678(2008)03—0062—06
Site-directedD37Nmutagenesis，expression，andenzymatic
characterizationofxylanaseXynII
ZHOUChen—yanl，LIDong．fen91，WUMin．chenl’。，WANGWul
(1．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；
2．CollegeofM dicineandPharmaceutics，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China)
Abstract：AhomologymodelingofxylanaseXyn11fromAspergillususamiiEt)01惴constructedbySWISS—
MODELandBLAST．Aconservedaminoacidhadbeenfoundinthecatalyticdomainbetween』B—sheetA3and
B3inthetertiarystructure．whichinfluencedthepHpropertiesofenzyme．ThenaD37Nmutationwasintro—
ducedinXynlIbysite—directedmu agenesis．TheXynlIandmutantxylanase(Xyn如玎N)expressedinPichia
pastoriswerepurifiedantheirenzymaticpropertiesweredetermined．Theoptimalt mperaturendth xmosta-
bilityofXynⅡ硎hadalmostnochanges，buttheoptimumpHofXyn峙Nwasincreasedfrom4．2to5．3and
thepHstabilityofX nⅡ肼NwasnarrowedfrompH3．0—7．5topH3．0-5．5．
Keywords：Aspergillususamii；mutagenesis；site-directed；xylanase
JB一木聚糖酶水解木聚糖主链内的卢一1，4糖苷键
产生不同长度的木寡糖短链。基于氨基酸序列和
疏水簇分析，木聚糖酶在糖苷水解酶中被分成10和
11两个家族¨21。家族10包含酸性pH的木聚糖
酶(和部分纤维素酶)，该族木聚糖酶的三维结构是
(邮)。的桶形折叠。家族11含有通常表现出碱性
pH的木聚糖酶(除一些真菌来源的木聚糖酶显示
出酸性pH外)，该族木聚糖酶的三维结构是一种
收稿日期：2007-11-06
基金项目：国家863资助项目(2006AAIOZ305)
作者简介：周晨妍(1979一)，女，河南焦作人，博士研究生，研究方向：基因工程。
联系人：王武，教授，博士生导师，E—mail：zhouehenyan2008@163．corn
万方数据
2008年5月 周晨妍等：木聚糖酶XynⅡ的D37N突变、表达及酶学性质变化 -63·
“三明治”形状的折叠结构，包括1个d一螺旋和2个
口一片层，形成1个巨大的裂缝来容纳木聚糖多聚
体旧J。由于G／11木聚糖酶结构较小，所以对这个
家族的酶学性质研究也较多。1995年，根据zlee．
seii2个木聚糖酶晶体结构的差异推测同活性位点
在空间位置上较近的氨基酸对于酶最适pH有影
响，从而造成了这2个酶最适pH的不同MJ。同样，
1996年，来源于Aspergillusniger的木聚糖酶的最适
pH为3．0，研究表明这与Asp37与催化残基Glul70
和Glu79的互相作用有关"J。2004年，在对来源于
AspergilluspuUulans嗜酸性木聚糖酶的研究时发现，
位于活性中心的Glu208和Glull4为催化残基，与
它们空间位置邻近的Glul57和Asp73对该酸性木
聚糖酶的嗜酸性有重要作用峥J。2006年，对来源于
Streptomycesolivaceoviridis的木聚糖酶B进行定点突
变，研究发现将Asn46替换为Asp46，酶催化反应从
最适pH5．2下降到4．2¨’。
本文通过对具有不同最适pH的第11族木聚
糖酶同源序列的比较分析，选择了影响最适XynII
pH的Asp37位点进行研究。
1材料和方法
1．1酶、培养基和主要试剂
限制性内切酶、T4DNA连接酶、咖DNA聚合
酶、4种dNTP、十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺(SDS—
PAGE)低相对分子质量Marker均购自TaKaRa公
司，燕麦木聚糖购自Sigma公司，G418和YNB购自
上海生工生物公司，其他试剂均为进口或国产分析
纯产品；YPD、MM、MD、BMGY、BMMY培养基见In．
vitrogen公司的毕赤酵母操作手册。
1．2菌株和质粒
大肠杆菌(E．coli)JMl09和BL21一CodonPlUS
(DE3)-RIL由本实验室保存；克隆质粒pMDl9一T
SimpleV ctor购自TaKaRa公司；表达质粒pET28a
(+)购自Novagen公司；巴斯德毕赤酵母(Pichia
pastoris)GSll5和穿梭质粒pPIC9K购自Invitrogen
公司；含有XynⅡcDNA的重组质粒pUCm-T—
XynII，根据文献[8]，由本实验室构建和保存。
1．3定点突变
采用重叠延伸法一1定点突变。根据木聚糖酶
基因XynII(Genbank登录号为DQl91144)序列和
目的突变位点设计4条引物：JN：57一CGGAAT．
里里AG’I’GccGGII．A’I’CAAcTATG．37；JZ：5’_A’I’I’I’!!!；生
堡垦鱼堡鱼TTAAGAAGATATcGTGAC．3’；FN：5’一CAGT-
TCCAACTTCGTCGTTG-3’：RZ：5’一CGACGAAGTTD
GAACTGACT-3’。其中下划线为引入的踟RI和
NotI酶切位点，黑体为引入的突变碱基。定点突变
程序如图1所示，以pUCm—T·XynII质粒为模板，用
咖DNA聚合酶进行扩增，反应条件：94℃预变性2
rain；94oC变性30s，52℃退火30s，72℃延伸308，
25个循环；72oC延伸10min，胶回收目的片段，记作
JNRZ。以FN、JZ分别为上、下游引物，用同样方法
得到的扩增产物记为FNJZ。再以JN、JZ分别为上、
下游引物，以JNRZ和FNJZ为模板链进行扩增，反
应条件为：94℃预变性2min；94oC变性30s，55oC
退火30s，72oC延伸458，30个循环；72℃延伸10
min，回收目的片段，连接，转化E．coliJMl09感受
态细胞，蓝白斑筛选阳性转化子pMDl9．T-xyn
Ⅱ∞，。，送上海英骏公司测序。
』k FN口．
—早肱 百J上J
JN+RZl FN+Jz(第一轮PcR扩增)
口口
—i一．口—而■——一l退火
占
匕了————————————一
I JN+Jz(第二轮PCR扩增)
＼引入的突变位点
图1 D37N定点突变示意
Fig．1MapofD37Nsite-directedmutagenesis
1．4重组表达载体的构建
1．4．1pET28a-xynIID37N表达载体
根据pET28a(+)多克隆位点另设计2条引物
XN：5’·CATGg垦垒!堡鱼AGTGCCGGTATCAACTATG-3’
(含NcoI酶切位点)和XZ：5’一GCGTCGACTrA
AGAAGATATCGTGACAC-3’(含SalI酶切位点)，通
过NcoI和SalI双酶切位点将突变酶基因xyn
Ⅱ∞，N克隆进了pET28a(+)，载体转化E．
coliJMl09。
1．4．2pPIC9K-xynII∞7N表达载体
通过踟RI和NotI双酶切位点将突变酶基因
xynlID37N定向插入到pPIC9K上的EcoRI和NotI
万方数据
·64· 生物加工过程 第6卷第3期
位点之间，形成重组质粒pPIC9K-xynIIIY37N，从而将
目的基因克隆到AOXl启动子下游，与信号肽编码
序列形成正确的阅读框架。
重组质粒均经酶切和测序鉴定。
1．5 重组木聚糖酶在大肠杆菌中的诱导表达
将过夜培养的菌种以1：50的体积比转接于
50mL含Kan、Cat(各1001山g／mL)的新鲜LB中，
220r／min，待DD600达0．6左右时，加入IPTG至终
浓度为0．8mmol／L，30℃诱导培养5h。将培养液
离心，收集部分菌体进行SDS—PAGE电泳¨0f。另将
菌体沉淀，用10mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH
4．2)悬浮，在冰水浴中用超声波破碎菌体，
12000r／min离心10min，所得上清液用于酶活性
测定。
1．6重组木聚糖酶在毕赤酵母中的表达
1．6．1酵母的电击转化和筛选
将重组质粒pPIC9K-xynIID3，。用SalI线性化
后，电击转化毕赤酵母，挑取阳性转化子。电转化
及筛选方法参见Invitrogen公司操作手册。
1．6．2重组酵母的培养、诱导表达和检测
具体方法见参考文献[11]。
1．7重组木聚糖酶的纯化
酵母发酵液8000r／min离心10min，取上清
液，将酶液置于冰浴中，边搅拌边加入硫酸铵至
70％饱和度，冰浴2h，然后12000r／min离心30
rain，取沉淀，沉淀用柠檬酸．磷酸氢二钠缓冲液(pH
6．0)重新溶解，得到浓缩酶液，透析袋脱盐后，进一
步经过分子筛Superdex75HR10／30纯化，得到电泳
纯的木聚糖酶。
1．8木聚糖酶活性的测定
采用改进的DNS法¨2|。在一定体积分数为
0．5％的木聚糖中加入适当稀释的酶液，保持总反
应体积为2．5mL，50oC下反应15rain，加入2．5mL
DNS终止反应，沸水中显色7rain，定容后测
定∞540。
酶活力单位(IU)的定义：在该反应条件下，以
每min产生1斗mol还原糖所需的酶量定义为1个
单位。
1．9酶学性质的分析与比较
将纯化后的突变酶与原酶(同样经毕赤酵母表
达并纯化)进行酶学性质的比较研究，包括酶的最
适pH和pH稳定性、最适温度和热稳定性，具体操
作方法见参考文献[13]。
2结果与讨论
2．1突变位点的确定
对XynlI的同源建模在http：／／www．expasy．
org／swissmod／SWISS·MODEL．html和http：／／us．ex-
pasy．ors／cgi—bia／prosite／scanview．cgi网站上完成。
木聚糖酶XynⅡ属于第11族木聚糖酶，由2个反向
的口折叠片和一个短的乜螺旋组成，整个酶分子成
右手型结构(图2(a))。第11族木聚糖酶的催化机
制是经典的酸碱催化机制¨引，分析XynII中所有的
可能作为催化残基的酸性氨基酸，只有Glu79和
Glul70位于酶与底物作用的活性中心，通过进一步
的点突变证实Glu79和Glul70为XynII的活性中
心起关键作用的催化残基，Asp37位于Glul70附近
(图2(a))。
木聚糖酶的pH特性与空间上邻近酸碱催化残
基的氨基酸有很大关系，特别是与催化残基天冬氨
酸和谷氨酸形成所谓的“电荷网”的氨基酸，它们往
玎_ⅥQ!06
HELIX
阑440／Xx69r-q7被1／I,．291-"116
15。 145L‰3[]"—J52Ⅵ—1J也￥o
∞
图2 XynII∞7N的分子模型
Fig．2Themolecul耵modelofXynIIm7N
万方数据
2008年5月 周晨妍等：木聚糖酶XynII的D37N突变、表达及酶学性质变化 ·65·
往带有电荷并与催化残基形成氢键¨引。在多种第
11族木聚糖酶中，其口折叠股A3和B3之间的一个
保守的氨基酸Asn或Asp可能就是这样的一个氨基
酸(图2(b))，当木聚糖酶的最适pH在5．0以上时
为Asn，pH在5．0以下时是Asp。XynII的最适pH
为4．6，其相应的氨基酸为Asp37(图3)，如果将此
位点的Asp37突变为Ash37，可能会改变它与催化
残基的相互作用，从而提高XynII的最适pH。
2．2定点突变
以xynII为模板，通过PCR扩增，完成D37N点
突变，其编码的氨基酸由原来的Asp37突变为
Asn37，突变基因克隆到pMDl9．T上，通过测序分
析，确定突变位点与设计的目标位点一致。
2．3重组表达质粒的构建
构建的大肠杆菌表达载体和毕赤酵母表达载
体的示意图见图4。
DH optimumpH
^B02931 B GTHDGYDYEF可KDsGGsGsHTLNsGGTFs^Q可sNvN麓ILF47 9．0
U012qZ 8 GYHDGYFYSFETDAPGTVSHELGPGGNySlSVRNTG搿FVA耳7 ，·u
置64552 10G订衄叮6Y7YSF耵TDsOGTVs阳忸Gs66Qys丁s张N1．G禽Fv^q9 o．，
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D148481 S且G工NWC村YNGNLADFTYDESAG"ITS互Y硎EDGVSS■FVV40 2．0
D633821 ．．TGNWONYNGNV心FEYSOYDGTFSVNl珊GNT．．■FVC36 2．O
图3 Xy．Ⅱ(DQl91144)与其他第11族木聚糖酶相关序列的比较
Fig．3AlignmentofXynII(DQl91144)withotherfamily11xylanases
图4重组表达质粒构建 ．
Fig．4Physicalm pofrecombinantexpressionplasmid
pET-28a-XynIID盯NandpPIC9K·XynIID37N
2．4重组木聚糖酶的表达及纯化
2．4．1大肠杆菌中的表达
实验表明，突变酶在大肠杆菌中得到了表达
(图5(a))，相对分子质量为2．0X104，与理论相对
分子质量一致，重组大肠杆菌细胞裂解液上清的酶
活性为6IU／mL，这说明突变酶有木聚糖酶活性。
2．4．2毕赤酵母中的表达
重组毕赤酵母表达的突变酶XynⅡD硎相对分子质
量为2．1XlO(图5(b))，大于大肠杆菌表达的Xyn
Ⅱ叻。相对分子质量，而与原酶XynⅡ在酵母中表达的情
况一致。由于XynⅡ聊。序列中不含有肛糖基化位点，
所以推测XynⅡ嘟N在酵母中表达时发生了0-糖基化导
致分子量增大。在摇床水平上诱导96h，表达量最高
的重组子酶活性达到265U／mL。由于研究的目的是
酶的结构与酶学性质之间的关系，在酵母表达时并没
有筛选高拷贝的转化子，这可能是XynⅡ嘟。与XynⅡ相
比在酵母中表达量较低的主要原因之一。
2．4．3木聚糖酶XynII麟N的纯化
酵母发酵上清液经硫酸铵沉淀，透析袋脱盐
后，再经分子筛Superdex75HR10／30纯化，得到电
泳纯的目标蛋白(图5(b)，与纯化的经毕赤酵母表
达的原酶XynII一起进行酶学性质的比较研究。
2．5酶学性质的比较
实验结果表明，XynⅡ聊。的最适pH由4．2上升
到5．3(图6)，pH稳定性范围由原来的pH3．0—7．5
缩减为pH3．O一5．5(指相对剩余酶活性在90％以上
万方数据
·66· 生物加工过程 第6卷第3期
的pH范围)(图7)。木聚糖酶的催化机制是酸碱催
化机制，通过SWISS．MODEL对XynII空间结构的分
析表明，Asp37的OD2氧原子与Glul70的OE2氧原
子之间的距离为3．13nm，二者之间较强的氢键作用
使Glul70质子供体的作用增强，对催化残基的影响
比较大。突变酶XynⅡ∞，。中，Asp37变成了Asn37，
Asn37的ND2与Glul70的OE2氧原子之间的距离较
远，为3．32rim，二者之间较弱的氢键作用使Glul70
质子供体的作用减弱，使酶的催化能力下降。但在偏
碱性的环境下，ASh就会增强与Glul70的作用，进而
使Glul70质子供体的作用增强，因此突变酶与原酶
相比在偏碱性pH下的活性更高，这与图3中“第11
族木聚糖酶相应蛋白质序列的比较与木聚糖酶的最
适pH的分析”的结果相符。
XynIID3，N最适温度与原酶一致均为50℃(图
8)，将突变酶与原酶在50℃保温不同时间，热稳定
性的变化不大(图9)，说明D37位点对该酶最适温
度及热稳定性不起关键作用。
LaneM-Proteinmarker；(B)Lane1-4一Ecol／／pET-28a-xynII∞7NwithIPTGinductionfor2-4h；Lane5-Ecoli／pET-28a-xynⅡD37NwithoutIPrG
induction．(b)Lane1-culturesupernatantsofP．pa tor／sGSll5／pPIC9Kinduced∞negativecontrol；Lane2-purifiedXynIID37Nsecretedbyrecombi-
nantP．pastor／sGSI15．
图5表达产物(a)和纯化产物(b)的SDS-PAGE图谱
Fig．5SDS-PAGEanalysisofthexpressionpr ducts(a)andpurifiedproducts(b)
120
100
冰80
1}g60
髓
40
20
O
pH
图6 pH对酶活的影响
Fig．6EffectofpHonenzymeactivity
图7 pH对酶稳定性的影响
Fig．7EffectofpHonenzymestability
图8温度对酶活的影响
Fig．8Effectof emperatureonenzymeactivity
图9温度对酶稳定性的影响
Fig．9Effectof emperatureOilenzymestability
万方数据
2008年5月 周晨妍等：木聚糖酶XynlI的D37N突变、表达及酶学f|生质变化
3结论
木聚糖酶作为一种重要的工业酶制剂，在工业
上有着广泛的用途，然而在不同领域中应用的木聚
糖酶需具有不同的综合性质，而天然酶往往难以满
足，所以有必要利用基因工程技术对木聚糖酶结构
中影响其性质的因素进行研究。本文利用生物信
息学手段对宇佐美曲霉木聚糖酶XynII进行同源
建模和同源序列比较，发现第11族木聚糖酶的催化
结构域在口折叠股A3和B3之间存在一个保守的
氨基酸位点，该位点与木聚糖酶的pH特性有关，因
此应用定点突变技术将XynII第37位的Asp突变
为Asn，结果发现XynII的最适pH从4．2提高至
5．3。这一方面有利于木聚糖酶在生产中的应用，同
时也能为木聚糖酶结构与功能关系的研究提供较
好的材料。
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