全 文 ：第９卷第３期
２０１１年５月
生　物　加　工　过　程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．３
Ｍａｙ２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０３．００４
收稿日期：２０１０－１１－１９
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０８７６０１１，２０８７６０１２）；国家转基因重大专项资助项目（２００８ＺＸ０８０１２－００１）；国家重点基础研究发展计
划（９７３计划）资助项目（２００７ＣＢ７１４３０４，２００７ＣＢ７０７８０４）；国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００９ＡＡ０５Ｚ４３６，
２００９ＡＡ１０Ｚ４０４）；北京市自然科学基金资助项目（２０７１００２）
作者简介：徐大鹏（１９８３—），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：生物能源；谭天伟（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｔｗｔａｎ＠ｍａｉｌ．ｂｕｃｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
耐高温酵母菌的筛选及特性
徐大鹏，李云杰，张　栩，谭天伟
（北京化工大学 生命科学与技术学院 北京市生物加工过程重点实验室，北京 １０００２９）
摘　要：筛选得到１株在４１℃可以良好生长的耐高温酵母菌，并对其特性及发酵性能进行研究。结果表明：该菌
的最适生长ｐＨ为５０，转速１８０ｒ／ｍｉｎ，最高生长温度４５℃。在４１℃和初糖质量浓度为９３０ｇ／Ｌ的条件下发酵２４
ｈ后，乙醇质量浓度达到４４０ｇ／Ｌ，乙醇得率为９３０％。
关键词：耐高温酵母；筛选；生理特性；乙醇；发酵
中图分类号：Ｑ９３３３１　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０３－００１７－０５
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｙｅａｓｔａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
ＸＵＤａｐｅｎｇ，ＬＩＹｕｎｊｉｅ，ＺＨＡＮＧＸｕ，ＴＡＮＴｉａｎｗｅｉ
（ＢｅｉｊｉｎｇＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓ，ＣｏｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
ＢｅｉｊｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００２９，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｎｅｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｙｅａｓｔｓｔｒａｉｎｅｎｄｕｒｅｄａｔ４１℃ ｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｇｒｏｗｔｈｐＨｗａｓ５．０，ｒｏｔａｔｉｎｇｓｐｅｅｄｗａｓ１８０ｒ／ｍｉｎ
ａｎｄｍａｘｉｍｕｍｇｒｏｗｔｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｗａｓ４５℃．Ｔｈｅｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎａｔ４１℃ ａｎｄ９３０ｇ／Ｌｏｆｇｌｕｃｏｓｅ
ｗａｓｃｏｍｐｌｅｔｅｄａｆｔｅｒ２４ｈｔｏａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ４４０ｇ／Ｌｏｆｅｔｈａｎｏｌ，ｃｏｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｔｏａｎｏｖｅｒａｌ
ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｙｉｅｌｄｏｆ９３０％．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔｙｅａｓｔ；ｓｃｒｅｅｎ；ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ；ｅｔｈａｎｏｌ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
　　乙醇是国民经济重要的原料，它广泛应用于食品
工业、化学工业、医药卫生等领域，可用作酒基、浸提
剂、溶剂等［１］。传统的酿酒酵母乙醇发酵的最适温度
在２８～３３℃，一般不会超过３６℃，在气温较高地区
和季节则无法保证正常生产，应用耐高温酵母生产乙
醇可节约能源、提高出酒率、缩短发酵周期、提高设备
的利用率并维持夏季正常生产［２］。
同步糖化发酵纤维素生产乙醇的主要问题之
一是糖化（４５～５０℃）和发酵（２５～３５℃）的最适温
度不同［３］，并且浓醪乙醇发酵有利于降低水耗和能
耗，提高乙醇生产率，但会引起发酵温度和乙醇浓
度升高，导致酵母生长抑制和发酵不彻底［４］。在没
有冷却系统时，乙醇发酵由于微生物生长代谢放
热，可使系统环境升高 １１℃，当发酵温度上升到
４０℃以上时，会导致乙醇减产［５］。宋瑶等［４］研究发
现耐高温性较好的酵母菌往往并非产乙醇能力较
强的酿酒酵母。耐高温高产乙醇酵母菌的选育和
发酵工艺的改进是实现浓醪发酵工业的关键，因此
研究和应用耐高温高产乙醇酵母菌已受到广泛重
视，成为当前国内外乙醇行业研究的热点［６］。
耐受性（耐高糖、耐乙醇、耐高温等特性）好的
菌株是生产乙醇的关键。笔者通过初筛、复筛实验
得到１株耐高温的酵母和１株高产乙醇酵母，并对
耐高温酵母的生理特性及发酵性能进行研究。
１　材料与方法
１１　菌种和培养基
本实验所用酵母菌为北京市生物加工过程重
点实验室保藏的１８株菌。
初筛培养基由下层培养基和上层培养基构成。
下层培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 １０１、ＫＨ２ＰＯ４１０、牛肉
膏蛋白胨 ２０、酵母粉 １５、无水ＭｇＳＯ４０４、柠檬酸
０２７、琼脂 ２００；上层培养基（ｇ／Ｌ）：２，３，５ 氯化三
苯基四氮唑（ＴＴＣ）０３、葡萄糖 ３００、琼脂 ２００。
复筛培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２６００、ＫＨ２ＰＯ４１０、
牛肉膏蛋白胨 １００、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４１。
种子培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖 ２００、酵母粉 １００、
牛肉膏蛋白胨 ２００。
发酵培养基（ｇ／Ｌ）：葡萄糖１０００、ＫＨ２ＰＯ４１０、
牛肉膏蛋白胨 １００、ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ４１。
１２　筛选方法
１２１　酵母菌初筛
将在一定的培养基上培养的酵母菌落上覆盖
一层ＴＴＣ显色剂，ＴＴＣ显现不同的颜色，产乙醇能
力强的酵母会显现深红色，次之显粉红色，微红色
的或者不显色的为野生酵母［６］。
１２２　酵母菌复筛
摇瓶复筛，测定各个生化参数。
１３　酵母菌的生理特性
１３１　温度
将菌株按体积分数１０％接种量接入到种子培
养基，在 ３７、３９、４１、４３和 ４５℃培养 ２４ｈ，测其生
物量。
１３２　耐糖性
制备初始葡萄糖质量分数分别为 ５％、１０％、
１５％、２０％、２５％、３０％、３５％和４０％的培养基，４１℃
培养２４ｈ，测其生物量。
１３３　耐乙醇性
制备初始乙醇体积分数分别为 ０、２％、４％、
６％、８％、１０％、１２％、１４％和 １６％的种子培养基，
４１℃培养２４ｈ，测其生物量。
１３４　耐酸性
制备初始 ｐＨ分别为 ３５、４０、４５、５０、５５、
６０的种子培养基，４１℃培养２４ｈ，测其生物量。
１３５　转速
按接种量为１０％接入到种子培养基，在转速分
别为０、６０、１００、１４０、１８０和２２０ｒ／ｍｉｎ条件下，４１℃
培养２４ｈ，测其生物量。
１４　分析方法
生物量的测定：采用比浊法，将发酵液混匀后
稀释一定倍数，测定其在６６０ｎｍ的吸光度（ＯＤ６６０）。
残糖和乙醇的测定：利用 ＳＢＡ ４０Ｃ生物传感
仪（山东省科学院生物研究所）测定［７－８］。
１５　乙醇得率的计算
乙醇得率 ＝ρ（实际乙醇）
ρ（理论乙醇）
×１００％ （１）
ρ（理论乙醇）＝ρ（初始糖）－ρ（残糖）１８０ ×９２
（２）
式中：９２和１８０分别代表２ｍｏｌ乙醇和１ｍｏｌ葡萄糖
的相对分子质量，乙醇和糖质量浓度单位都是ｇ／Ｌ。
２　结果与讨论
２１　耐高温菌的初筛
１８株酵母用灭菌的牙签分别接种于初筛培养
基中，分别于３７、３９、４１、４３和４５℃下培养２４ｈ，长
出菌落后，倒入配好的ＴＴＣ溶液，覆盖菌落，３７℃再
继续培养２ｈ，结果如图１所示。
从图１可以看出：第１８株菌（从右至左、从上至
下数起）的菌落最大，乳白色，圆形，中心凸起，表面
光滑，不透明，在高温条件下生长稳定。
２２　耐高温菌的复筛
摇瓶复筛的实验，将１８株酵母按１０％的接种
量接种于复筛培养基中，在３７℃条件下培养，结果
如图２所示。
从图２可以看出：发酵３６ｈ后，在３７℃培养条件
下，第１５株菌乙醇质量浓度最高，达到１０２０ｇ／Ｌ，残糖
质量浓度为３８０ｇ／Ｌ，ＯＤ６６０为１１８４；第１８株菌乙醇质
量浓度较低，为９４０ｇ／Ｌ，残糖质量浓度为５４０ｇ／Ｌ，
ＯＤ６６０最高，为１１９８，乙醇得率为８９３％。
２３　耐高温菌的生理特性
２３１　温度对酵母菌的影响
在低温范围内，温度越高，酶反应越快，酵母生
长代谢加快，乙醇提前生成。当温度升高到一定程
度后，继续升温则酶失活的也越快，表现出酵母易
衰老、发酵周期短，从而影响发酵乙醇的产量［９］。
８１ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
图１　不同温度下的菌落形态
Ｆｉｇ．１　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｅｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｃｏｌｏｎｉｅｓａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
图２　不同酵母发酵乙醇
Ｆｉｇ．２　Ｅｔｈａｎｏｌｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｂｙｄｉｆｅｒｅｎｔｙｅａｓｔｓ
温度对酵母菌的影响如图３所示。
从图３可以看出：在考察上述温度时，该菌的最
适生长温度是３７℃，ＯＤ６６０达到２０７４。随着温度的
图３　不同温度下酵母菌的生长曲线
Ｆｉｇ．３　Ｇｒｏｗｔｈｃｕｒｖｅｓａｔｄｉｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
提高，ＯＤ６６０也逐渐减小。
２３２　初始糖浓度对酵母菌的影响
Ｃ源的浓度对发酵也会产生影响，若培养基中
营养物质过于丰富，会导致酵母异常增殖，对酵母
发酵乙醇会产生不良影响；反之，供给量过小，则酵
母生长和乙醇合成都会停止［９］。初始糖浓度对酵
母菌的影响如图４所示。
从图４可以看出：在初始低糖浓度范围内，初始
糖浓度越高，ＯＤ６６０值越大，但是，当初始糖质量分数
在２０％以上时，就出现抑制作用，是因为高糖浓度
下，渗透压大，对酵母造成伤害。
２３３　初始乙醇浓度对酵母菌的影响
乙醇从酵母细胞排出后，因为乙醇可以任何比
９１　第３期 徐大鹏等：耐高温酵母菌的筛选及特性
图４　初始糖质量分数对酵母菌生长的影响
Ｆｉｇ．４　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌｓｕｇａｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎ
ｃｅｌｇｒｏｗｔｈ
例与水混合，所以很快就渗透到周围介质中。这样
酵母细胞周围的乙醇浓度并不比发酵醪中的高，发
酵继续进行下去，直至发酵液中糖分耗尽或乙醇浓
度超过酵母的耐受程度［９］。初始乙醇体积分数对
酵母菌的影响如图５所示。
图５　初始乙醇体积分数对酵母菌生长的影响
Ｆｉｇ．５　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌｅｔｈａｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｎ
ｃｅｌｇｒｏｗｔｈ
从图 ５可以看出：初始乙醇体积分数越高，
ＯＤ６６０值越小，当初始乙醇体积分数在６％以上时，对
酵母有抑制作用，这是因为在高温与高乙醇浓度
下，酵母细胞膜通透性改变，毒害了酵母。
２３４　初始ｐＨ对酵母菌的影响
ｐＨ过高或过低能抑制酵母体内酶的活性，使酵
母生长代谢受阻，会影响酵母细胞膜所带电荷状
态，从而改变细胞膜的通透性［９］。初始 ｐＨ对酵母
菌的影响如图６所示。
从图６可以看出：该菌在ｐＨ为４５～５５时，ＯＤ６６０
变化不大，该菌的最适ｐＨ为５０，ＯＤ６６０为２２６０。
２３５　转速对酵母菌的影响
酵母菌在发酵液溶氧浓度过高时，以好氧生长
为主，而当溶氧不足时则以乙醇发酵为主［９］。转速
对酵母菌的影响如图７所示。
图６　初始ｐＨ对酵母菌生长的影响
Ｆｉｇ．６　ＥｆｅｃｔｓｏｆｉｎｉｔｉａｌｐＨｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈ
图７　转速对酵母菌生长的影响
Ｆｉｇ．７　Ｅｆｅｃｔｓｏｆｒｏｔａｔｉｎｇｓｐｅｅｄｓｏｎｃｅｌｇｒｏｗｔｈ
从图７可以看出：该菌在静止状态下培养时，
ＯＤ６６０为８５４，随着转速的提高，ＯＤ６６０也提高，当转
速为１８０ｒ／ｍｉｎ时，生长最好，ＯＤ６６０为２１１４，当转速
为２２０ｒ／ｍｉｎ时，ＯＤ６６０下降。
２４　５Ｌ发酵罐实验
在优化的特性条件基础上，进行５Ｌ发酵罐实
验，结果如图８所示。
图８　高温菌株乙醇发酵
Ｆｉｇ．８　Ｅｔｈａｎｏｌｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｂｙｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅｙｅａｓｔ
从图 ８可以看出：在 ４１℃和初糖质量浓度
９３０ｇ／Ｌ条件下发酵 ２４ｈ后，乙醇质量浓度达到
４４０ｇ／Ｌ，残糖质量浓度为 ０５ｇ／Ｌ，乙醇得率
为９３０％。
０２ 生　物　加　工　过　程　　 第９卷　
３　结论
经初筛、复筛得到１株耐高温酵母菌，其最高生
长温度为４５℃，高浓度的糖和高浓度的乙醇会抑制
该菌的生长，在３７℃和初糖质量浓度为２６００ｇ／Ｌ条
件下，发酵３６ｈ后，乙醇质量浓度达到９４０ｇ／Ｌ，残糖
质量浓度为５４０ｇ／Ｌ，乙醇得率为８９３％。在４１℃
和初糖质量浓度为９３０ｇ／Ｌ条件下，发酵２４ｈ后，乙
醇质量浓度为４４０ｇ／Ｌ，残糖质量浓度为０５ｇ／Ｌ，乙
醇得率为９３０％。
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１１４１２４．
国内简讯
广西甘蔗糖蜜酒精发酵技术获突破，发酵效率提高３％
糖蜜是制糖业的副产物，广西每年有３００万ｔ的标准糖蜜，可生产７０多万ｔ酒精。由于我国糖蜜酒精发
酵水平较低，醪液酒精体积分数只有９％～１０％，造成糖蜜酒精生产能耗高、排污量大、生产成本高。以广西
科学院黄日波院长为学术带头人的研究团队，针对糖蜜酒精发酵技术落后的状况，利用国家非粮生物质能
源工程技术研究中心的平台，构建得到的菌株用于年产５万ｔ的甘蔗糖蜜酒精生产线生产，发酵成熟醪液的
酒精体积分数可由１０％提高到１３．５％，发酵效率由原来的９０％提高到９３％，每吨酒精消耗标准糖蜜由４３ｔ
减少到４．１ｔ，燃煤消耗由０．６ｔ减少到０．４ｔ，每吨酒精排放废液由１１．６ｔ减少到７．５ｔ。
（胡晓丽）
１２　第３期 徐大鹏等：耐高温酵母菌的筛选及特性