全 文 ：第 １１ 卷第 ６ 期
２０１３ 年 １１ 月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ． １１ Ｎｏ． ６
Ｎｏｖ． ２０１３
ｄｏｉ：１０． ３９６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １６７２ － ３６７８． ２０１３． ０６． ０１４
收稿日期：２０１３ － ０１ － ３１
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３ 计划）（２０１１ＣＢ２００９０３）；国家高技术研究发展计划（８６３ 计划）（２０１２ＡＡ０５２１０１）；中国科学院百人
计划 （Ａ１０９７）；辽宁省自然科学基金（２０１２０１０２６３）；中国科学院大连化学物理研究所知识创新项目（Ｋ２０１０Ａ３）；中国科学院知识创
新工程领域前沿项目———大连化学物理研究所科研基金———青年基金
作者简介：刘亚男（１９８２—），女，黑龙江双鸭山人，硕士，助理研究员，研究方向：微藻生物能源；薛 　 松（联系人），研究员，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｘｕｅｓｏｎｇ＠
ｄｉｃｐ． ａｃ． ｃｎ
使用 ＢＯＤＩＰＹ荧光染料快速测定微藻
油脂含量方法
刘亚男１，姚长洪１，２，周建男１，孟迎迎３，王海涛１，２，曹旭鹏１，薛　 松１
（１．中国科学院 大连化学物理研究所，大连 １１６０２３；２．中国科学院大学，北京 １０００４９；
３．大连理工大学 生命科学与技术学院，大连 １１６０２４）
摘　 要：使用 ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 荧光染料，通过荧光分光光度法测定藻细胞中的油脂含量。 结果表明：ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／
５１５ 的最佳染色条件为二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）体积分数 ２％ ，ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 最终质量浓度 ０􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ，染色时间 ３０
ｍｉｎ，染色温度 ３５ ℃。 在最佳染色条件下，微藻油脂含量与荧光强度呈线性相关（Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９７６ ４）。 通过测定
ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 染色的不同种属微藻的荧光强度，应用该关系计算其油脂含量，与质量法测定的结果相比没有显
著差异。 该方法较为普适，比传统方法相比具有简便快捷，试样用量少的特点，与尼罗红荧光染料相比具有较窄的
发射波谱范围，不会与微藻的自身荧光相互干扰，更适于过程监控及高含油藻株的筛选。
关键词：ＢＯＤＩＰＹ；荧光；油脂；微藻
中图分类号：Ｑ９４９　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２ － ３６７８（２０１３）０６ － ００６８ － ０５
Ｒａｐｉｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｆｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ＢＯＤＩＰＹ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ＬＩＵ Ｙａｎａｎ１，ＹＡＯ Ｃｈａｎｇｈｏｎｇ１，２，ＺＨＯＵ Ｊｉａｎｎａｎ１，ＭＥＮＧ Ｙｉｎｇｙｉｎｇ３，
ＷＡＮＧ Ｈａｉｔａｏ１，２，ＣＡＯ Ｘｕｐｅｎｇ１，ＸＵＥ Ｓｏｎｇ１
（１． Ｄａｌｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２３，Ｃｈｉｎａ；
２． Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９，Ｃｈｉｎａ；
３． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｌｉａｎ １１６０２４，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｙｅ ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ ｉｓ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｄｙｅｉｎｇ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ ｗｅｒｅ： ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ ｆｉｎａｌ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ０􀆰 ２５ ｇ ／ ｍＬ ｗｉｔｈ ２％ ＤＭＳＯ，ａｎｄ ｄｙｅｉｎｇ ａｔ ３５ ℃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ． Ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅ
ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｏｉｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｗａｓ ｂｕｉｌｔ ｗｉｔｈ Ｒ２ ＝ ０􀆰 ９７６ ４． Ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｆｏｕｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ａｂｏｖｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｎｉｌｅ ｒｅｄ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｙｅ ｍｅｔｈｏｄ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ， ｔｈｅ ａｄｖａｎｔａｇｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ
ｕｎｉｖｅｒｓａｌ，ｓｉｍｐｌｅ，ｌｅｓｓ ｓａｍｐｌｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｎｉｌｅ ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｄｙｅｓ，ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５
ｈａｄ ｎａｒｒｏｗ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏａｌｇａｌ ａｕｔｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ， ｍｏｒｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ
ｏｌｅａｇｉｎｏｕｓ ａｌｇａｌ ｓｔｒａｉｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｃｅｓｓ ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＢＯＤＩＰＹ；ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ；ｌｉｐｉｄ；ｍｉｃｒｏａｌｇａｅ
　 　 能源是经济可持续发展的动力，而石化燃料资
源的日益枯竭却给全球经济的发展带来了危机［１］。
微藻作为一种潜在的可再生能源的生产者，具有光
合效率高、生长速率快、生长周期短、单细胞油脂含
量高和不占用耕地等优点，在生物质能源生产领域
受到了越来越广泛的重视［２］。
微藻藻种选育是生物柴油生产过程中关键环
节之一，其中油脂含量是藻种筛选的重要指标，选
育富油藻种是规模化培养的前提条件［３］。 快速、准
确、简便的油脂含量测定方法不仅对富油藻种的筛
选和生物柴油的生产极其重要，对微藻生物学的研
究也具有十分重要的意义［４］。
质量法是最为常用的微藻油脂测定方法，该方
法准确度高，但存在所需试样量大、试样处理与提
取过程耗时长、使用有毒的有机溶剂提取、环境友
好度差且测量成本较高的缺点。 近年来，文献
［５ － ７］利用荧光染料特异性结合微藻中性脂油滴
来分析油脂含量，以尼罗红荧光染色法最为常见。
这种方法能快速、灵敏地实现微藻中性脂的检测，
但是尼罗红的发射光在 ５９０ ～ ６４０ ｎｍ 范围内，与很
多藻的自身叶绿素荧光相互干扰，导致不能准确地
进行检测。 因此，需要找到一种更为广泛适用的能
够避免藻类自身荧光干扰的荧光染料。
ＢＯＤＩＰＹ是一类近红外的短波长荧光染料，常见
的有 ＢＯＤＩＰＹ４９３ ／ ５０３、ＢＯＤＩＰＹ５００ ／ ５１０、ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／
５１５、ＢＯＤＩＰＹ５３０ ／ ５５０、ＢＯＤＩＰＹ５５８ ／ ５６８，它们可以特异
性地作用于中性脂组成的油滴，使得油滴可以被检
测，且其发射波长可以避开大部分藻自身叶绿素荧光
的干 扰［８］，目 前，已 有 在 流 式 细 胞 仪 中 使 用
ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５进行产油微藻筛选的报道［９ － １０］，但
流式细胞仪操作复杂，价格昂贵，不宜推广。 利用
ＢＯＤＩＰＹ染色可以在荧光显微镜下定性观察微藻油
脂积累的情况［１１］，但还没有利用该染料的荧光强度
定量检测微藻油脂含量的报道。
笔者以湛江等鞭金藻（ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎｓｉｓ）
为实验对象，利用 ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 对其中性脂进行
染色，使用荧光分光光度计进行荧光强度的测定，考
察该染料的最佳染色条件，并通过与传统质量法的
比较，建立荧光强度与油脂含量的关系，将应用到
绿藻、硅藻等其他藻中，以实现荧光分光光度计快
速检测微藻油脂含量，为藻类培养的过程监控及产
油微藻的筛选奠定基础。
１　 材料与方法
１． １　 材料
１． １． １　 藻种
海水藻：湛江等鞭金藻（ Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ ｚｈａｎｇｊｉａｎｇｅｎ⁃
ｓｉｓ）、亚心形四爿藻（Ｔｅｔｒａｓｅｌｍｉｓ ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ）、新月
藻（Ｎｉｔｚｓｃｈｉａ ｃｌｏｓｔｅｒｉｕｍ）、巴夫藻（Ｐａｖｌｏｖａ ｖｉｒｉｄｉｓ）和
牟氏角毛藻（Ｃｈａｅｔｏｃｅｒｏｓ ｍｕｅｌｌｅｒｉ），由辽宁海洋水产
研究所提供。 淡水藻：蛋白核小球藻 （ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ），购自中国科学院典型培养物保藏委员
会淡水藻种库（ＦＡＣＨＢ⁃Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）。
１． １． ２　 培养基
海水藻培养基由来自大连附近海域的天然海
水添加相应的营养盐组成，淡水藻培养基由去离子
水添加相应的营养盐组成。
１） 康维方营养盐 （１ Ｌ） 　 ＮａＮＯ３ １００ ｍｇ，
ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ ２０􀆰 ０ ｍｇ，ＥＤＴＡ⁃Ｎａ２ ４５􀆰 ０ ｍｇ，Ｈ３ＢＯ３
３３􀆰 ６ ｍｇ，ＭｎＣｌ２·４Ｈ２Ｏ ０􀆰 ３６ ｍｇ，ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ １􀆰 ３ ｍｇ，
ＺｎＣｌ２ ０􀆰 ２１ ｍｇ，ＣｏＣｌ２·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ２０ ｍｇ，（ＮＨ４）４Ｍｏ７Ｏ２４·
４Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０９ ｍｇ，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ２０ ｍｇ，ＫＮＯ３ １ ｇ，
ＫＨ２ＰＯ４ ０􀆰 ０５ ｇ，Ｔｒｉｓ ０􀆰 ８１ ｇ，ＣＨ３ＣＯＯＨ ０􀆰 ３４６ ｇ，用于
培养亚心形四爿藻。
２） ｆ ／ ２ 营养盐（１ Ｌ） 　 ＮａＮＯ３７５ ｍｇ，ＮａＨ２ＰＯ４·
２Ｈ２Ｏ ５ ｍｇ，ＶＢ１２ ０􀆰 ５ μｇ，生物素（Ｂｉｏｔｉｎ） ０􀆰 ５ μｇ，ＶＢ１
０􀆰 １ ｍｇ，ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ ３􀆰 １６ ｍｇ，Ｎａ２ＥＤＴＡ·２Ｈ２Ｏ ４􀆰 ３６
ｍｇ，ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ ９􀆰 ８ μｇ，Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ６􀆰 ３ μｇ，
ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ２２ μｇ， ＣｏＣｌ２·６Ｈ２ Ｏ １２ μｇ，ＭｎＣｌ２·
４Ｈ２Ｏ ０􀆰 １８ ｍｇ，用于培养湛江等鞭金藻和巴夫藻。
３） ｆ ／ ２ ＋硅酸钠营养盐 　 上述 ｆ ／ ２ 营养盐添加
Ｎａ２ＳｉＯ３ ３０ ｍｇ ／ Ｌ，用于培养新月藻和牟氏角毛藻。
４）ＳＥ 培养基（１ Ｌ） 　 ＮａＮＯ３ ０􀆰 ２５ ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４·
３Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０７５ ｇ， ＭｇＳＯ４·７Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０７５ ｇ，ＣａＣｌ２·２Ｈ２Ｏ
０􀆰 ０２５ ｇ， ＫＨ２ ＰＯ４ ０􀆰 １７５ ｇ， ＮａＣｌ ０􀆰 ０２５ ｇ， ＦｅＣｌ３·
６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ００５ ｇ，ＥＤＴＡ⁃Ｆｅ ０􀆰 ００５ ｇ，Ｈ３ＢＯ３ ２􀆰 ８６ ｍｇ，
ＭｎＣｌ２·４Ｈ２ Ｏ １􀆰 ８６ ｍｇ， ＺｎＳＯ４·７Ｈ２ Ｏ ０􀆰 ２２ ｍｇ，
Ｎａ２ＭｏＯ４·２Ｈ２Ｏ ０􀆰 ３９ ｍｇ，ＣｕＳＯ４·５ Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０８ ｍｇ，
Ｃｏ（ＮＯ３） ２·６Ｈ２Ｏ ０􀆰 ０５ ｍｇ，胰蛋白胨 １ ｇ，用于培养
蛋白核小球藻。
９６　 第 ６ 期 刘亚男等：使用 ＢＯＤＩＰＹ荧光染料快速测定微藻油脂含量方法
１． １． ３　 仪器和试剂
Ｃａｒｙ Ｅｃｌｉｐｓｅ荧光分光光度计（安捷伦公司），二
甲基亚砜 （ ＤＭＳＯ， Ｓｉｇｍａ 公司）， ＢＯＤＩＰＹ ５０５ ／ ５１５
（４，４⁃ｄｉｆｌｕｒｏ⁃１，３，５，７⁃ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ⁃４⁃ｂｏｒａ⁃３ａ，４ａｄｉａｚａｓ⁃
ｉｎｄａｃｅｎｅ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司 ）。 其他试剂为国产分
析纯。
１． ２　 方法
１． ２． １　 培养条件
６株藻的培养条件相同：温度（２５ ± １） ℃，光暗
时间比 １４∶ １０，日光灯作光源。 藻种培养于 ３ Ｌ 锥形
瓶中，光强为（５０ ±５）μｍｏｌ ／ （ｍ２·ｓ），培养至指数期接
种使用。 培养均在 ６００ ｍＬ 鼓泡式柱状反应器中完
成，培养体积为 ５００ ｍＬ，光强（２００ ±１０）μｍｏｌ ／ （ｍ２·ｓ），
ＣＯ２ ２％（体积分数），通气速率 １００ ｍＬ ／ ｍｉｎ，接种初始
密度 ２ ×１０６ 个 ／ ｍＬ。
１． ２． ２　 测定方法
１）油脂含量的测定 　 使用正己烷对干燥的藻
粉进行油脂的提取，称取 １００ ｍｇ藻粉，加入 ２ ｍＬ正
己烷进行总脂的提取，提取 ３ 遍，合并 ３ 次的提取
液，Ｎ２吹扫至无溶剂后，烘干称质量即可测得油脂
占干质量百分比。
２）荧光强度的测定［１２］ 　 使用荧光分光光度计
的孔板阅读模式进行测定，依次向 ９６ 孔板中加入 ５
μＬ稀释后的藻液，３ μＬ 一定浓度的 ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／
５１５ 荧光染料，２９２ μＬ一定浓度的 ＤＭＳＯ水溶液，共
３００ μＬ体系，使藻液的终浓度保持在 ＯＤ６８０值 ０􀆰 １５
左右，一定温度下避光染色一定时间。 选择 ４７０ ｎｍ
作为激发波长，测定在发射波长 ５１５ ｎｍ 的荧光
强度。
１． ２． ３　 统计分析
用 ＳＰＳＳ １６􀆰 ０ 单因素方差分析（ＡＮＯＶＡ）中的
ＬＳＤ多重比较进行数据差异性分析。
２　 结果与讨论
２． １　 染料浓度对染色效果的影响
在不同的 ＢＯＤＩＰＹ最终质量浓度条件下对藻细
胞进行染色，分别考察 ＢＯＤＩＰＹ 浓度对荧光强度的
影响，每个浓度下有 ８ 个重复，结果见图 １。
由图 １ 可知：当染料质量浓度小于 ０􀆰 １８７ ５
μｇ ／ ｍＬ时，荧光强度保持在 １３５，多重比较显示无显
著性差异（ｐ ＞ ０􀆰 ０５）。 随着染料浓度增加，荧光强
度逐渐增加，到 ０􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ 时达到 ２ １７１，此后增
加染料浓度到 １ μｇ ／ ｍＬ，荧光强度无显著增加（ｐ ＞
图 １　 染料浓度对染色效果的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｙｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
０􀆰 ０５）。 只有当染料浓度增加到 １􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ 时荧
光强度迅速增加到 ６ ８５７，同时考虑到染色的灵敏度
和染料用量，选择最佳的染料终质量浓度为 ０􀆰 ２５
μｇ ／ ｍＬ。
２． ２　 染色温度对染色效果的影响
在不同的温度下对藻细胞进行染色，分别考察
染色温度对荧光强度的影响，染料终质量浓度为
０􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ，每个温度下有 ８ 个重复，结果见图 ２。
图 ２　 染色温度对染色效果的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ
ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
由图 ２ 可知：在 ２５ ～ ３５ ℃的范围内，随着染色
温度的升高，荧光强度逐渐升高，到 ３５ ℃达到最大，
这可能是因为温度的升高有利于 ＢＯＤＩＰＹ进入细胞
与油滴结合；之后荧光强度随着温度升高而迅速减
小，可能是由于温度过高会使荧光染料淬灭［１３］。 因
此，选择最佳染色温度为 ３５ ℃。
２． ３　 染色时间对染色效果的影响
为了获得最优的染色时间，考察染色时间对荧
光强度的影响，染料终质量浓度为 ０􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ，染
色温度为 ３５ ℃。 每个染色时间下有 ８ 个重复，结果
见图 ３。
０７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷　
图 ３　 染色时间对染色效果的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
由图 ３ 可知：染色效果随染色时间的延长而增
强，染色 ６０ ｍｉｎ以后荧光强度几乎不变。 在本实验
中，为了缩短染色时间而又能达到较好的染色效
果，选择 ３０ ｍｉｎ为后续的染色时间。
２． ４　 ＤＭＳＯ对荧光染料染色效果的影响
由于湛江等边金藻没有细胞壁，故使用其进行
ＤＭＳＯ浓度对染色效果的促进实验就没有意义，本
文在研究 ＤＭＳＯ 体积分数时仅选用了具有较厚细
胞壁的绿藻———亚心形四爿藻。
在不同的 ＤＭＳＯ的体积分数条件下对藻细胞进
行染色，分别考察不同的 ＤＭＳＯ浓度对藻细胞染色的
荧光强度的影响，染料终质量浓度为 ０􀆰 ２５ μｇ ／ ｍＬ，染
色温度为 ３５ ℃，染色 ３０ ｍｉｎ。 每个体积分数下有 ８
个重复，结果见图 ４。
图 ４　 ＤＭＳＯ体积分数对染色效果的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ＤＭＳＯ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｉｎ ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５
ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
由图 ４ 可知：ＤＭＳＯ体积分数的增加，对扁藻的
染色效果有所加强，随着 ＤＭＳＯ 浓度的增加，荧光
强度也相应地增加，当 ＤＭＳＯ 的量从 ０􀆰 １％增加到
２％时，相应的荧光强度从 ３７５ 增加到 ４４６，当 ＤＭＳＯ
体积分数增加到 ５％ 时，荧光强度更是增加到了
４７４，比 ０􀆰 １％时增加了 １００。 选择 ＤＭＳＯ 添加的最
终体积分数为 ２％ 。
ＤＭＳＯ能够改变生物膜对电解质、药物和代谢产
物的通透性，促进染料进入藻细胞［１４］。 Ｃｈｅｎ等［１５］采
用 ＤＭＳＯ和微波辅助 ＮＲ染色显著提高了采用普通
的染色方法不易染色的普通小球藻 （ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｖｕｌｇａｒｉｓ）、假绿球藻（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｍ ｓｐ． ）、双形栅
藻（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ ｄｉｍｏｒｐｈｕｓ）和若夫小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ
ｚｏｆｉｎｇｉｅｓｉｓ）的染色效果。
２． ５　 油脂含量与荧光强度的相关性
在以上优化的染色条件下，根据荧光强度与对
应的油脂含量制定标准曲线，考察其线性相关性，
结果见图 ５。
图 ５　 油脂含量与荧光强度的相关性
Ｆｉｇ． ５　 Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ
ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ
由图 ５ 可知：在油脂含量 １１％ ～ ２６％的范围
内，油脂含量与荧光强度有较好的线性关系，Ｒ２ ＝
０􀆰 ９７６ ４，并得到油脂含量与荧光强度的回归方程
ｙ ＝ ０􀆰 ０３５ｘ ＋ １􀆰 ２９３ ４（ｙ 为油脂含量，％ ；ｘ 为荧光强
度），根据此标准曲线方程来计算微藻油脂含量。
在质量法中，正己烷由于其极性较弱，提取的
主要是微藻的中性脂，如甘油三酯（ＴＡＧ）、甘油二
酯（ＤＡＧ）、甘油一酯（ＭＡＧ）和游离脂肪酸（ＦＦＡ），
而 ＢＯＤＩＰＹ荧光染料也主要是与中性脂组成的油滴
结合才能在相应的波长下发荧光［１６］，因此用正己烷
提取法测得的油脂含量与 ＢＯＤＩＰＹ荧光强度有较好
的相关性。
２． ６　 荧光染料 ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 优化的染色方法
在其他藻上的应用
　 　 对于不同的微藻，使用 ２􀆰 ５ 中的回归方程，根据
测得的荧光值计算得到油脂占干质量百分比，使用
质量法获得的油脂含量进行比较，结果见图 ６。
由图 ６ 可知：除新月藻外，其余 ３ 株藻用荧光值
计算的油脂含量与质量法测定的油脂含量没有显
著差异（ｐ ＞ ０􀆰 ０５）。 因此，利用 ＢＯＤＩＰＹ荧光染料可
１７　 第 ６ 期 刘亚男等：使用 ＢＯＤＩＰＹ荧光染料快速测定微藻油脂含量方法
图 ６　 使用荧光值计算油脂含量与
质量法测定油脂含量比较
Ｆｉｇ． ６　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｌｉｐｉｄ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｌｇａｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ
ａｎｄ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｇｒａｖｉｍｅｔｒｉｃ ｍｅｔｈｏｄ（ｎ ＝３）
以在较广的微藻范围（如硅藻、绿藻、金藻等多种藻
类）内快速、准确测定油脂含量。 同时，也可以应用
于培养过程油脂代谢监控、藻种筛选等方面。
３　 结　 论
探索了利用 ＢＯＤＩＰＹ５０５ ／ ５１５ 荧光染料，通过荧
光分光光度法测定藻细胞中的油脂含量的方法，确
定了最适的染色条件，即染料质量浓度为 ０􀆰 ２５
μｇ ／ ｍＬ，ＤＭＳＯ的体积分数为 ２％ ，在 ３５ ℃下避光染
色 ３０ ｍｉｎ。 利用该方法可以较准确地测定不同种属
的微藻细胞内中性脂的含量，且具有不与微藻自身
荧光相互干扰、试样和荧光染料用量少、灵敏度高、
操作简便、可定量动态观察细胞内油脂积累情况等
优点，可应用于培养过程油脂代谢监控、藻种筛选
等方面，将成为微藻油脂研究的有力工具。
参考文献：
［ １ ］　 蒋晓菲，周红茹，金青哲，等． 微藻油脂提取技术的研究进展
［Ｊ］ ．中国油脂，２０１２，３７（１０）：６２⁃６６．
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２７ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １１ 卷