全 文 ：书! "#$ %&&’
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生 物 加 工 过 程
*+,-./. 0123-#4 15 6,17318.// 9-:,-..3,-:
第 ( 卷第 % 期
%&&’ 年 ’ 月
响应面法优化弗氏链霉菌 ;杨永涛，涂国全!
（江西农业大学 生物工程系，南昌 ((&&=’）
摘! 要：用响应面法对弗氏链霉菌 ;<%%> 变种液体发酵生产氨基酸的培养基进行了优化。首先，用全因子试验方法
对相关影响因素的效应进行评价，并筛选出有显著效应的羽毛胨和蛋白胨两个因素，第 % 步用最陡爬坡实验逼近
以上两因素最优水平。最后由中心组合设计法及响应面分析确定主要影响因素的最佳条件。在优化培养条件下，
发酵液中氨基酸浓度从 =? > : @ >&& AB 提高到 )? =>% : @ >&& AB。
关键词：弗氏链霉菌 ;<%%>；培养基；响应面法
中图分类号：CD(D! ! ! ! 文献标识码：E! ! ! ! 文章编号：>)F% G ()FH（%&&’）&% G &&() G &’
#$%&’ ()*&+&,’*&(- (. !"#$%"&’()$! *#+,-+$ /’0 12%%>34
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! ! 响应面分析（ 3./71-/. /235#8. #-#4$/,/，S;E）是
61Q及其合作者于 %& 世纪 ’& 年代创立的一种优化
实验条件的数学方法，和其它统计方法一样，由于采
用合理的实验设计，能以最经济的方式，用很少的实
验数量和时间对实验进行全面研究，科学地提供局
部与整体的关系，从而取得明确的、有目的的结论。
它与过去推广的“正交设计法”不同。响应分析方
法以回归方法作为函数估算的工具，将多因子实验
中因子与实验结果（响应值）的关系函数化，依此可
对函数的面进行分析，研究因子与响应值之间、因子
与因子之间的相互关系，并进行优化。61Q 及其合
作者完善了响应面方法学后，广泛用于化学、化工、
农业、机械工业等领域［>，%］。
鸡、鸭羽毛资源丰富，但常作为废物处理。鸡、
鸭羽毛属于角蛋白类，其粗蛋白含量在 H&[左右，
含有丰富的蛋白质和多种动物必需氨基酸。高压水
! 收稿日期：%&&=<>%<%&
基金项目：江西省教育厅重点项目
作者简介：杨永涛（>DFH<），男，江西农业大学在读硕士研究生，研究方向：发酵工程。
联系人：涂国全，M.4：&FD><(H>(=))! 9! "##$ 年 $ 月 杨永涛等：响应面法优化弗氏链霉菌 %&""’ 变种发酵培养基 · ()! ·
解、盐酸处理和碱处理等开发方法，存在能耗高，部
分氨基酸被破坏等缺点。近年来，采用生物降解的
方法利用角蛋白资源成为研究的热点。江西农业大
学涂国全教授从土壤中分离到一株能高效降解角蛋
白的菌株———弗氏链霉菌 %&""’ 变种（ !"#$%"&’()$!
*#+,-+$ *+, %&""’-.）［(］，并利用该菌株成功的研制
出角蛋白饲料。但利用该菌株生产氨基酸的研究起
步较晚。以提高氨基酸产量为目标，本文利用响应
面法对弗氏链霉菌 %&""’ 变种发酵培养基进行了优
化。
!" 材料与方法
’/ ’! 菌! 种
弗氏链霉菌 %&""’ 变种（ !"#$%"&’()$! *#+,-+$ *+,
%&""’-.）［(］：本实验室保存。
’/ "! 孢子平板培养基
改良高氏一号培养基：添加 "0的麸皮浸出液。
’/ (! 测定方法
发酵液中氨基酸含量的测定，采用在日立 1($
型氨基酸自动分析仪上进行测定。
’/ 2! 孢子培养
将孢子接种于装有 $# 34改良高氏一号培养基
的茄子瓶中，于 () 5恒温培养箱中，培养 6# 7。
’/ $! 发酵培养
取 ( 34弗氏链霉菌 %&""’ 孢子菌悬液接种于
装有 $# 34发酵培养基的 "$# 34 三角瓶中，() 5、
’1# , 8 39:回转式摇床振荡培养 ;6 7。测定发酵液
中的氨基酸含量。
研究初始发酵培养基见表 ’。
表 ’! 初始发酵培养基的组成
-+<=> ’! -7> ?@:AB9B.B> @C @,9D9:+= C>,3>:B+B9@: 3>E9.3
因素类别 变化范围
.’（羽毛胨）8（D 8 ’## 34） 变量 ’"/ $ F ’)/ $
."（糖蜜）8（D 8 ’## 34） 变量 6 F ’#
.(（工业蛋白胨 8（D 8 ’## 34） 变量 #/ $ F ’/ $
.2（GH"IJ2）8（D 8 ’## 34） 变量 #/ ’$ F #/ 2$
KD%J2 #/ ’$0，K:%J2 #/ ###’0，L:%J2 #/ ###’0，M>%J2 #/ ##’0
’/ 6! 应用全因子实验设计（M.== M+?B@,9+= N>A9D:，
MMN）法筛选重要因素［2，$］
取 MMN设计中两水平的实验设计方法，以用最
少实验次数达到使因素的主效应得到尽可能精确的
估计，从而选出最为重要的几个因素，供进一步研
究。
取发酵培养基中的 2 组分设为 2 个因子，选用
2 因子 " 水平的 "2设计，共进行 ’6 次实验。全因子
实验设计能够充分估计因子的主效应及全部交互作
用，确定重要影响因素，并且根据实验数据回归分析
有效确定最陡攀登方向，由此接近最大响应区域。
MMN设计各因素、水平见表 "。
表 "! 全因子实验中因子取值范围
-+<=> "! -7> ,+:D> @C C+?B@,A 9: MMN
变量
水平
O ’ # P ’
.’（羽毛胨）8（D 8 ’## 34） ’"/ $ ’$ ’)/ $
."（糖蜜）8（D 8 ’## 34） 6 1 ’#
.(（工业蛋白胨）8（D 8 ’## 34） #/ $ ’ ’/ $
.2（GH"IJ2）8（D 8 ’## 34） #/ ’$ #/ ( #/ 2$
’/ )! 最陡爬坡实验
响应面拟合方程在考察的紧接邻域里才近似真
实情形，在其他区域，拟合方程与被近似的函数方程
毫无相似之处，几乎无意义。所以，要先逼近最大产
氨基酸区域后才能建立有效的响应面拟合方程。最
陡爬坡法以实验值的变化方向为爬坡的方向，根据
各因素效应值的大小确定变化步长，能最快的逼近
最大产氨基酸区域。
’/ 1! 中心组合实验［2，$］
逼近最大产氨基酸区域后，按参考文献进行中
心组合实验，以拟合数据得到一个描述响应量（氨
基酸含量）与自变量（操作条件）关系的二阶经验模
型：
/ 0 !# 1 "!- 2- 1 "!-3 2-3 1 "!-- 2--
" （’）
式中，/为预测响应值即氨基酸含量，! 为回归
系数，2-为自变量的编码水平，它与自变量真实值 .-
的关系为：
2 0（.- 4 .-#）5 #.- （"）
式中，. 9#为实验中心点处自变量的真实值，#.9
为自变量的变化步长。用 %Q% 统计软件对实验数
据进行回归拟合，并对拟合方程作显著性检验及方
差分析。所得拟合方程（’）分别对各自变量求偏导
数的方程，并均令为 # 可得到一个二元一次方程组，
用 KQ-4QR数学软件求解此方程组可得到最大产
氨基酸区域对应的最适条件。
’/ ;! 统计分析
使用 %-Q-S%-STQ 6/ ’" 对实验数据进行拟合和
方差分析［6］。万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 " 卷第 $ 期
!" 实验结果
$% &! 全因子实验实验结果
全因子实验需要 &’ 次实验，中心点做 ( 次重复
实验，共需 $) 次实验。将各因子代码中心化：
!& "（#& $ &*）% $% * ；!$ "（#$ $ #）% $ ；!" "（#"
$ &）% )% * ；!( "（#( $ )% "）% )% &* （"）
由表 " 实验结果可以看出，氨基酸含量随实验
条件的改变差异很大，最低 "% * + , &)) -.，最高
*% // + , &)) -.。由全因子实验的回归结果（表 (）
可以看出，羽毛胨的量和蛋白胨的量是主要影响因
素，对氨基酸产量影响显著，而糖蜜和 01$23(对氨
基酸的产量影响不显著。根据表 " 中的数据进行回
归分析可以得到一次拟合回归方程为：
& " )% #() /*) 4 )% $)" $*) #& $ )% )&& *’" #$
’ )% //# /*) #" $ )% $/5 &’/ #( （(）
该方程的方差分析（表 *）表明，( 检验非常显
著，用方程（(）描述各因子与响应值之间的关系时，
其因变量与全体自变量之间的线性关系显著。另
外，)$ 6 )% 5&) ’，表明 5&% )’7的实验数据可用此模
型解释。
表 "! 全因子实验设计及实验结果
89:;< "! 8=< >?;; >9@ABCD9; E实验号 !& !$ !" !(
氨基酸含量 ,
（+ , &)) -.）
& H & H & H & H & "% 5
$ & H & H & H & (% *
" H & & H & H & "% (5
( & & H & H & (% ’#
* H & H & & H & (% &
’ & H & & H & *% //
/ H & & & H & (% $
# & & & H & *% *
5 H & H & H & & "% *
&) & H & H & & (% (*
&& H & & H & & "% 5
&$ & & H & & (% $/
&" H & H & & & (% "
&( & H & & & *% (/
&* H & & & & (% "*
&’ & & & & *% $"
&/ ) ) ) ) (% *’
&# ) ) ) ) (% **
&5 ) ) ) ) (% *5
$) ) ) ) ) (% *"
表 (! 全因子实验参数估计表
89:;< (! 29C9- >?;; >9@ABCD9; <变量 代表因子 自由度 参数估计 标准误差 *值 +,-. K L* L 显著性
MN8OPQO2 MN8OPQO2 & )% #() /*) )% ()( 55" )5 $% )/’ )% )** *
#& 羽毛胨 & )% $)" $*) )% )$) //* /& 5% /#" )% ))) & !!
#$ 糖蜜 & H )% )&& *’" )% )$* 5’5 ’" H )% ((* )% ’’$ *
#" 工业蛋白胨 & )% //# /*) )% &)" #/# *" /% (5/ )% ))) & !!
#( 01$23( & H )% $/5 &’/ )% "(’ $’& /# H )% #)’ )% ("$ /
表 *! 全因子实验方差分析表
89:;< *! R<9G FS?9C< 9G9;TFDF B> >?;; >9@ABCD9; E变异来源
（FB?C@<）
自由度
（UV）
离差平方和
（F?- B> FS?9C<）
均方差
（R% W）
(值
（( X9;?<）
+,-. / (
模型（RBE<;） ( ’% *5" &% ’(# "#%  )% ))) &
误差（OCCBC） &* )% ’(/ )% )("
总和（Q 8BA9;） &5 /% $()
)$ 6 )% 5&) ’
$% $! 应用最陡爬坡实验法接近重要因素的最优水
平
最陡爬坡的方向可由方程（(）及回归分析确定，
羽毛胨（#&），蛋白胨（#"）对氨基酸产量影响显著，且
#&系数为正，#"系数为正。这说明，适当增加
羽毛胨和工业蛋白胨的用量，对氨基酸的产量提高有
促进作用。实验设计及实验结果见表 ’。
表 ’! 最陡爬坡实验设计及实验结果
89:;< ’! 8=< FA<实验组数
#&（羽毛胨）,
（+ , &)) -.）
#"（蛋白胨）,
（+ , &)) -.）
氨基酸含量 ,
（+ , &)) -.）
& &* )% * (% ")
$ &’ )% /* *% &$
" &/ & ’% )&
( &# &% $* *% ""
* &5 &% * ’% )’
’ $) &% /* ’% )&
/ $& $ *% #*
# $$ $% $* *% ((
万方数据
! "##$ 年 $ 月 杨永涛等：响应面法优化弗氏链霉菌 %&""’ 变种发酵培养基 · ()! ·
表 * 中列出了羽毛胨和工业蛋白胨的改变方
向。其中羽毛胨改变步长为每次增加 ’ + , ’## -.，
工业蛋白胨每次增加 #/ "$ + , ’## -.。从表中可以
看出，第 $ 组实验中氨基酸含量最高，随后产量下
降。这说明，最优点在第 $ 组实验附近。
"/ (! 应用响应面分析实验设计法确定重要因素的
最优水平
本文采用响应面分析方法，以羽毛胨、蛋白胨二
因素为自变量，以产氨基酸的量为响应值。对弗氏
链霉菌 %&""’ 变种的发酵培养基组成进行优化。采
用二次回归的旋转中心组合设计，以表 ( 的第 $ 组
实验为中心点。实验设计及实验结果见表 0。
表 0! 中心组合实验设计及实验结果
12345 0! 165 7589:24 7;-<;=>95 ?5=>+8 28? 965 :5=@49
实验组数 !’（羽毛胨） !(（蛋白胨）
氨基酸含量 ,
（+ , ’## -.）
’ A ’ A ’ $/ BB
" A ’ ’ $/ B$
( ’ A ’ $/ *’
B ’ ’ $/ )"
$ A ’/ B’B # $/ "(
* ’/ B’B # */ #B
0 # A ’/ B’B $/ ""
C # ’/ B’B $/ C$
) # # */ #’
’# # # */ #(
’’ # # */ #$
’" # # */ #*
’( # # */ #B
!’ "（#’ $ ’)）% ’；!( "（#( $ ’/ $）% #/ "$
对表 0 中实验数据进行多项式回归分析，拟合
得二次方程为：
& " $ (#/ #$0 D "/ )C(#’ ’ C/ ##* #( $ #/ #C0
#’
" $ B/ (*0 #(
" ’ #/ (# #’#( （$）
回归系数的估计及其 (检验的结果示于表 C 。
表 C! 回归系数的估计
12345 C! E=9>-295 ;F :5+:5==>;8 <2:2-595:
回归系数 参数估计 标准误 (值
显著水平
（)*+, - . ( .）
显著性
!# A (#/ #$0 )/ *#’ A (/ ’( #/ #’0
!’ "/ )C( #/ CB) (/ $’B #/ #’ !!
!( C/ ##* B/ ’$0 ’/ )"* #/ #)*
!’’ A #/ #C0 #/ #"’ A B/ #$’ #/ ##$ !!
!(( A B/ (*0 #/ *#0 A 0/ ’) #/ ### !!
!’( #/ ( #/ ’)0 ’/ $"* #/ ’0’
交互项系数 !’( 不显著，这表明羽毛胨和蛋白胨之
间不存在交互作用。
由表 ) 可以看出，回归模型在 " G #/ #’ 水平上
/检验显著，表明用方程（$）描述各因子与响应值之
间的关系时，其因变量与全体自变量之间的回归关
系显著。同时 0" G #/ )B0 0，这说明 )B/ 00H的氨基
酸产量变化可由此模型解释，该方程为弗氏链霉菌
发酵提供了一个合适的模型。图 ’ 绘出了方程的三
维响应面图，直观的表示出了最大值点。工业蛋白
胨的最佳质量浓度在 ’/ $ + , ’## -. 左右，羽毛胨的
最适值在 "# + , ’## -.左右。
表 )! 中心组合实验回归分析
12345 )! 165 :5+:5==>;8 2824I=>= ;F 965 7589:24 7;-<;=>95 ?5=>+8
5J<5:>-589
变异来源
（%;@:75）
自由度
（KL）
离差平方和
（%@- ;F %M@2:5=）
均方差
（N/ %）
/值
/ O24@5
)*+, - /
模型（P5+:5==>;8） * B((/ (B’ 0"/ ""( 0 $"(/ "" #/ ### ’
误差（P5=>?@24） 0 #/ #*0 $ #/ ##) *
Q87;::5795? 1;924 ’( B((/ B#C
（R;::5795? 1;924） ’" ’/ ")(
0" G 校正总离差平方和 A残差平方和 ,校正总离差平方和 G #/ )B0 0
图 ’! 回归方程的响应面图
L>+/ ’! P5=<;8=5 =@:F275 F>+@:5 ;F :5+:5==>;8 5M29>;8
为了更进一步确证最佳点的值，对方程（$）取
一阶偏导等于零，整理得：
$ #/ ’0B #’ ’ #/ ( #( ’ "/ )C( G #
#/ ( #’ $ C/ 0"" #( ’{ C/ ##* G #
解方程组可以得到模型的极值点，羽毛胨为
’)/ CC( + , ’## -.（!’ G #/ CC(），工业蛋白胨为 ’/ $))
+ , ’## -.（!( G #/ ()*），此时的氨基酸含量为 */ B’"
+ , ’## -.。在该模型处做三次实验验证。得出响应
量为 */ B’" S #/ ’。此结果证实了模型有效性及存在
着极大值点。
综上所述，最优培养基为：羽毛胨 ’)/ CC(H，糖
万方数据
! · "#! · 生物加工过程 第 $ 卷第 % 期
蜜 &’，工业蛋白胨 () *++’，,-%./" #) (*’，012/"
#) (*’，032/" #) ### (’，432/" #) ### (’，562/"
#) ##(’。
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(++E7
（上接第 (& 页）
采用调控时，产率提高将近 (# 倍。由此说明，在 !C
.B发酵中通过外部环境的调控可以提高 !C.B 的产
率。
—#—I-；—$—生物量；
—%—残糖；—&—!C.B
图 E! I-调控和补料时 !C.B发酵曲线
5A1) E! JA=6 I;1LN9
!" 结" 论
$7 (! 对 !C.B 产生菌株 !"#$%$#&%’&($ ?I) .BEC$ 的形
态特征和生理生化特性进行了系统研究。
$7 %! 当搅拌转速为 $*# ; P =A3、控制 I- ") # 并采用
初糖质量分数为 $’及补糖时可获得最大的 !C.B
产量 E) E* 1 P B，菌体量为 E) +" 1 P B。
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BCL>?A36CI;万方数据