全 文 ：第９卷第５期
２０１１年９月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０５．００３
收稿日期：２０１１－０１－０９
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）资助项目（２００８ＡＡ０２Ｚ２０４）
作者简介：朱丽平（１９８６—），女，安徽淮南人，硕士研究生，研究方向：微生物与生化药学；任宇红（联系人），教授，Ｅｍａｉｌ：ｙｈｒｅｎ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
生物法合成辛伐他汀
朱丽平，任宇红，孙常磊，周剑平，魏东芝
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７）
摘 要：通过提高Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＷ３１菌株中的酰基转移酶ＬｏｖＤ的表达，并以ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ为底物，催化合成
辛伐他汀。考察发酵培养基和发酵条件对酰基转移酶ＬｏｖＤ表达的影响；采用ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法检测酰基转移
酶ＬｏｖＤ表达情况；并建立酶活测定方法，测定酰基转移酶ＬｏｖＤ的实际酶活。通过实验确定酰基转移酶ＬｏｖＤ摇瓶发
酵的最佳条件：发酵培养基为ＴＢ培养基，接种量为４％，诱导初始菌密度为０７（ＯＤ６００），ＩＰＴＧ浓度为０２ｍｍｏｌ／Ｌ，在
２０℃下诱导２０ｈ。在最佳条件下，酰基转移酶ＬｏｖＤ的表达水平为１００ｍｇ／Ｌ，辛伐他汀的产量为１２ｇ／Ｌ。
关键词：酰基转移酶；ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ；辛伐他汀
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０５－００１１－０６
Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ
ＺＨＵＬｉｐｉｎｇ，ＲＥＮＹｕｈｏｎｇ，ＳＵＮＣｈａｎｇｌｅｉ，ＺＨＯＵＪｉａｎｐｉｎｇ，ＷＥＩＤｏｎｇｚｈｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳｉｍｖａｓｔａｔｉｎｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｆｒｏｍＭｏｎａｃｏｌｉｎＪｕｓｉｎｇａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＬｏｖＤ．Ｔｈｅｏｂｊｅｃｔｉｖｅｏｆｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙｗａｓｔｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＬｏｖＤ，ａｎｄｏｐｔｉｍｉｚｅｉｔｓｍｅｄｉｕｍａｎｄｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ
ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｗａｓｖｉｓｕａｌｉｚｅｄｂｙｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏ
ｐｈｏｒｅｓｉｓ．ＴｏｑｕａｎｔｉｆｙｔｈｅａｃｔｉｖｅａｍｏｕｎｔｏｆＬｏｖＤｅｘｐｒｅｓｓｅｄｕｎｄｅｒｄｉｆｅｒｅｎｔｇｒｏｗｔｈｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｎｄｉｎｄｉｆｅｒ
ｅｎｔｍｅｄｉａ，ａｎａｃｔｉｖｉｔｙａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｆａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＬｏｖＤｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｓｆｏｌｏｗｓ：ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍｗａｓＴｅｒｉｆｉｃＢｒｏｔｈ；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｖｏｌｕｍｅｗａｓ４％；ｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙ
（ＯＤ６００）ｂｅｆｏｒｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｗａｓ０７；ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＰＴＧｗａｓ０２ｍｍｏｌ／Ｌ；ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｔｅｍｐｒｅｔｕｒｅｗａｓ
２０℃，ａｎｄｔｏｔａｌｔｉｍｅｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｗａｓ２０ｈ．Ｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆａｃｙｌｔｒａｎｓ
ｆｅｒａｓｅＬｏｖＤｗａｓ１００ｍｇ／Ｌａｎｄｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎｗａｓ１２ｇ／Ｌ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ；ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ
辛伐他汀是目前国内外最畅销的降脂药之一，
可用于控制血液中胆固醇含量及预防心血管疾
病［１］，其药理作用是作为竞争性抑制剂抑制胆固醇
合成的限速酶———３ 羟基 ３ 甲基戊二酰辅酶 Ａ
还原酶（ＨＭＧＣｏＡｒｅｄｕｃｔａｓｅ）的活性，从而降低胆固
醇的生物合成。与相同剂量的洛伐他汀（ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ）
和阿托伐他汀（ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ）等他汀类药物相比，辛
伐他汀可以更有效地降低血清中的总胆固醇和低
密度脂蛋白胆固醇（ＬＤＬｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）［２－３］。
辛伐他汀是洛伐他汀的半合成衍生物，而洛伐他
汀可由土曲霉代谢产物分离获得［４－６］。传统的辛伐
他汀生产工艺是以洛伐他汀为原料，经化学合成得
到［７－１１］。随着现代生物学的发展，辛伐他汀的生物
合成受到越来越多的重视［１２－１３］。本研究中，通过诱
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导Ｅｃｏｌｉ工程菌种合成酰基转移酶ＬｏｖＤ，催化ＤＭＢ
ＳＭＭＰ（ａｌｐｈａｄｉｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｒｙｌＳｍｅｔｈｙｌｍｅｒｃａｐｔｏｐｒｏ
ｐｉｏｎａｔｅ）及洛伐他汀水解产物ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ（钠盐形式）
进行转酰基作用，从而经一步生物合成得到辛伐他汀
（钠盐形式）（图１），并通过对Ｅｃｏｌｉ工程菌种发酵培
养基和发酵条件进行优化，确定该菌株的适宜产酶条
件，提高辛伐他汀产量。
图１ 生物合成辛伐他汀的侧链水解路线
Ｆｉｇ．１ Ｓｉｄｅｃｈａｉｎｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓｒｏｕｔｅｏｆｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ
ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
１ 材料与方法
１１ 材料
１１１ 菌种
工程菌ＥｃｏｌｉＤＥ３（ＢＬ２１）／ｐＡＷ３１工程菌株为
生物反应器工程国家重点实验室保藏。
１１２ 培养基
１）ＬＢ斜面培养基：胰蛋白胨１０ｇ，酵母提取物
５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，琼脂２０ｇ，去离子水１Ｌ。１２１℃灭
菌，溶液冷却至４０℃以下，加入氨苄青霉素（Ａｍｐ）
至终质量浓度１００μｇ／ｍＬ，冷却后备用。
２）种子培养基（ＬＢ液体培养基）：胰蛋白胨
１０ｇ，酵母提取物５ｇ，ＮａＣｌ１０ｇ，去离子水１Ｌ。
３）摇瓶发酵培养基（ＴＢ培养基）：胰蛋白胨
１２ｇ，酵母提取物２４ｇ，甘油４ｍＬ，加入去离子水中，
搅拌溶解，定容至 １Ｌ。１２１℃灭菌，溶液冷却至
６０℃以下，加入 １００ｍＬ磷酸缓冲液（１７ｍｍｏｌ／Ｌ
ＫＨ２ＰＯ４，７２ｍｍｏｌ／ＬＫ２ＨＰＯ４），４℃保存。
４）其他摇瓶发酵培养基：ＥＢ培养基（来源于华东
理工大学鲁华所），蛋白胨９ｇ，酵母提取物１８ｇ，
（ＮＨ４）２ＳＯ４４４ｇ，ＮａＨ２ＰＯ４·２Ｈ２Ｏ１０ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４·３Ｈ２Ｏ
２６５ｇ，ＭｇＳＯ４２７ｇ，葡萄糖０７５ｇ，去离子水１Ｌ；Ｍ９
培养基［１４］。
１１３ 主要试剂和仪器
异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）购于上海
捷倍思基因技术有限公司，用无菌水配制成 ０２
ｍｏｌ／Ｌ，过滤除菌后分装于１５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，
－２０℃保存；标准相对分子质量蛋白购自 ＴａＫａＲａ
公司；氨苄青霉素（Ａｍｐ）购于上海锐聪科技发展有
限公司，用无菌水配制成１ｇ／ｍＬ，过滤除菌后分装
于１５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，－２０℃保存；洛伐他汀
和辛伐他汀对照品由浙江京新药业股份公司提供；
ＤＹＹ １１Ｂ型三恒电泳仪，北京市六一仪器厂；生物
电泳图像分析系统，上海复日科技公司；Ａｇｉｌｅｎｔ
１１００型液相色谱仪，Ａｇｉｌｅｎｔ公司。
１２ 实验方法
１２１ ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ钠盐的合成方法［１１，１３］
水解洛伐他汀得到 ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ酸，ｍｐ１２６８～
１２７９℃。１ＨＮＭＲ（ＤＭＳＯ）δ：０８１（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝６９
Ｈｚ）、１１３（ｄ，３Ｈ，Ｊ＝７３Ｈｚ）、１１７～２３８（ｍ，１４
Ｈ）、３５８（ｓ，１Ｈ）、３９９（ｓ，１Ｈ）、４４３（ｓ，１Ｈ）、４４５
（ｓ，１Ｈ）、４７２（ｓ，１Ｈ）、５３９（ｓ，１Ｈ）、５７１～５７４
（ｍ，１Ｈ）、５８８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝９６Ｈｚ）、１２００（ｓ，１Ｈ）。
将 ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ酸溶解于甲醇中 （含 １００ｍｍｏｌ
ＮａＯＨ），室温搅拌８ｈ，减压除去甲醇，真空干燥，得
到ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ钠盐。
１２２ ＤＭＢＳＭＭＰ的合成方法［１３］
将３ 巯基丙酸甲酯和三乙胺加入乙醚溶液中，
０℃条件下滴加二甲基丁酰氯，水合ＮＨ４Ｃｌ淬火，乙
酸乙酯萃取２次。合并有机相，减压蒸去乙酸乙酯，
干燥，硅胶柱纯化，得 ＤＭＢＳＭＭＰ。１ＨＮＭＲ（ＤＭ
ＳＯ）δ：０７５（ｔ，３Ｈ，７４Ｈｚ）、１１４（ｓ，６Ｈ）、１５５
（ｑ，２Ｈ，７５Ｈｚ）、２５８（ｔ，２Ｈ，７０Ｈｚ）、３０１（ｔ，２
Ｈ，７１Ｈｚ）、３６１（ｓ，３Ｈ）。
１２３ 种子液的制备
于平板菌种中挑取 Ｅｃｏｌｉ单克隆，接种于装有
１００ｍＬ种子培养基的 ２５０ｍＬ三角瓶，３７℃、２００
ｒ／ｍｉｎ培养１０～１２ｈ（对数生长期后期），离心取得菌
体，用等体积种子培养基（含１０％甘油）悬浮，分装
于１５ｍＬＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，保藏于－８０℃。
１２４ 产酶发酵条件的优化
将活化后的菌种接种于发酵培养基（含 Ａｍｐ
２１ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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１００μｇ／ｍＬ），３７℃、１８０ｒ／ｍｉｎ培养，按实验需要在
一定的培养时间加入一定量的诱导剂 ＩＰＴＧ，培养一
定时间后离心收集菌体，分别从发酵培养基、培养
温度、接种量、装液量、诱导起始菌密度、ＩＰＴＧ浓度
和诱导总时间等进行单因素试验。
１２５ 粗酶液的制备
粗酶液的制备采用超声波细胞破碎法。发酵
液于６０００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心５ｍｉｎ，收集菌体。菌体
用去离子水洗涤 ２次。将洗涤后的湿菌体悬浮于
ＨＥＰＥＳ缓冲液（ｐＨ９０、５０ｍｍｏｌ／Ｌ、ＯＤ６００调整到
１２），置于冰浴，超声探头置于液面下１／３处，超声
功率为３００Ｗ，间歇时间５ｓ，超声时间５ｓ，８０个循
环。超声后的悬浮液于１００００ｒ／ｍｉｎ、４℃离心 １５
ｍｉｎ，上清液即为粗酶液。
１２６ 酰基转移酶ＬｏｖＤ表达检测和含量测定
采用 ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳法检测 ＬｏｖＤ表达情
况参照文献［１４］进行。考马斯亮蓝 Ｒ ２５０染色，
脱色后用生物电泳图像分析系统分析蛋白含量。
ＬｏｖＤ蛋白的浓度＝菌体总蛋白浓度 ×ＬｏｖＤ蛋白占
菌体总蛋白的比例。蛋白浓度测定采用 Ｂｒａｄｆｏｒｄ
法［１５］，以牛血清白蛋白作为标准蛋白作标准曲线，
５９５ｎｍ处测定吸光值来确定。
１２７ 酶活测定方法
反应体系为 １ｍＬ，内含 ９３０μＬ粗酶液，１０％
ＤＭＳＯ，５ｍｍｏｌＭｏｎｃｏｎｌｉｎＪ和１０ｍｍｏｌＤＭＢＳＭＭＰ。
在２５℃、２５０ｒ／ｍｉｎ条件下进行酶催化反应。在酶
催化反应速率的线性范围内（３ｈ以内）每隔１５ｍｉｎ
取样。用甲醇稀释 ６倍后，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心 １０
ｍｉｎ。上清用于ＨＰＬＣ分析。酶活力单位（Ｕ）定义：
每小时催化合成１μｍｏｌ辛伐他汀的酶量。
１２８ ＨＰＬＣ法测定辛伐他汀含量
色谱柱 ＺＯＲＢＡＸＳＢＣ１８（４６ｍｍ×２５０ｍｍ，
５μｍ）；流动相为甲醇／水（梯度：７５％甲醇升至
９５％甲醇，１５ｍｉｎ），流速１０ｍＬ／ｍｉｎ；检测波长２３８
ｎｍ；柱温３０℃。以ＭｏｎｃｏｌｉｎＪ、ＤＭＢＳＭＭＰ和辛伐
他汀标准品为对照。
２ 结果与讨论
２１ 酰基转移酶发酵条件的优化
２１１ 发酵培养基的确定
将活化后的种子液分别接入 ＬＢ培养基、ＴＢ培
养基、ＥＢ培养基和Ｍ９培养基中，３７℃培养至ＯＤ６００
为０７时加入０２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，２０℃进行诱导表
达，培养后测定粗酶液酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力（图
２）。由图２可知：ＬＢ培养基和 ＥＢ培养基的粗酶液
酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力最低，Ｍ９培养基较高，而
ＴＢ培养基的酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力最高。因此，
最佳发酵培养基为ＴＢ培养基。
图２ 不同培养基对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｅｒｅｎｔｍｅｄｉａｏｎ
ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２１２ 诱导温度的确定
将活化后的种子液接入ＴＢ培养基，３７℃培养
至ＯＤ６００为 ０７时加入 ０２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，分别在
２０、２５、２８、３０和３７℃进行诱导表达，培养２０ｈ后测
定粗酶液酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力，结果见图３。由
图３可知：酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力在２０℃时最高；
随着温度的上升，酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力急剧下
降，在３７℃基本没有酶比活力。由此可见，诱导温
度显著影响酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力，降低诱导温
度有利于酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力的提高。
图３ 温度对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎ
ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２１３ 接种量的确定
分别按照１％、２５％、４％、５５％和７％（体积分
数）的接种水平，接种活化后的菌悬液于 ＴＢ培养基
中进行培养，测定粗酶液酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力，
３１ 第５期 朱丽平等：生物法合成辛伐他汀
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结果如图４所示。由图４可知：在接种量较低时，随
着接种量的加大，酶比活力呈逐渐上升趋势，接种
量在５５％时达到最大值，之后呈现下降趋势。这
可能是因为接种量过多，使培养基中的菌体生长过
快，导致营养成分不能满足菌体正常代谢，从而影
响菌体产酰基转移酶 ＬｏｖＤ的能力。由于接种量在
４０％和５５％时，粗酶液的酶比活力相差不大，因
而在实际实验中采用４０％作为最佳接种量。
图４ 接种量对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎｓｉｚｅｏｎ
ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２１４ 装液量的确定
２５０ｍＬ摇瓶中分别加入 ＴＢ培养基２０、５０、６５
和８０ｍＬ。在菌密度（ＯＤ６００）达到 ０７时加入 ０２
ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导表达，培养结束后测定粗酶
液酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力，结果如图５所示。由图
５可知：在装液量为２０ｍＬ时酰基转移酶ＬｏｖＤ比活
力最高，装液量为５０ｍＬ时的酰基转移酶 ＬｏｖＤ比
活力次之。之后随着装液量的上升，酰基转移酶
ＬｏｖＤ比活力呈急剧下降趋势。由于装液量为 ５０
ｍＬ时的酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力与装液量为２０ｍＬ
时酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力相差不大，考虑发酵成
本因素，最终选择５０ｍＬ为最佳装液量。
图５ 装液量对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｌｉｑｕｉｄｌｅｖｅｌｏｎ
ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２１５ 诱导起始菌密度的确定
设置５个实验组，在接种培养后，分别在菌密度
（ＯＤ６００）达到 ０３、０５、０７、１０和 １３时加入 ０２
ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，培养后测定粗酶液的酰基转移酶
ＬｏｖＤ比活力，结果如图６所示。由图６可知：随着
菌密度的增大，酰基转移酶 ＬｏｖＤ比活力逐渐增大，
在ＯＤ６００为０７时达到最大值，之后呈逐渐下降趋
势，可能是起始菌体密度过高，培养基中的营养和
Ｏ２供应不足，使菌体生理状态差，引起蛋白表达量
下降。由此可见，最佳加入 ＩＰＴＧ的时间为大肠杆
菌对数生长初期（ＯＤ６００为０６～０７），可以得到较
高的酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力。
图６ 诱导起始菌密度（ＯＤ６００）对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃｅｌｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ６００）ｂｅｆｏｒｅ
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｎａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
图７ ＩＰＴＧ浓度对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．７ ＥｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＩＰＴＧ
ｏｎａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２１６ ＩＰＴＧ浓度的确定
接种后，在初始菌密度（ＯＤ６００）达到０７时，分别
加入浓度为０１、０２、０４、０６和０８ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ
进行诱导表达，２０℃培养２０ｈ后测定粗酶液的酰基
转移酶ＬｏｖＤ比活力，结果如图７所示。由图７可知：
在ＩＰＴＧ浓度较低时，目标酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力随
着ＩＰＴＧ浓度的加大而提高，在０２ｍｍｏｌ／Ｌ时达到最
大值；浓度大于０２ｍｍｏｌ／Ｌ时，随着浓度的上升，酰
４１ 生 物 加 工 过 程 第９卷
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基转移酶 ＬｏｖＤ比活力急剧下降。因此选用 ０２
ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ诱导表达目的蛋白。
２１７ 诱导时间的确定
加入 ＩＰＴＧ诱导目标蛋白表达后，分别在４、８、
１６、２０和２４ｈ测定粗酶液酰基转移酶ＬｏｖＤ比活力，
结果见图８。由图８可知：当诱导时间为２０ｈ酶比
活力达到最高值；继续发酵，酶比活力下降，可能与
菌体生长已处在衰退期相关。
图８ 诱导时间对酶比活力的影响
Ｆｉｇ．８ Ｅｆｅｃｔｏｆｉｎｄｕｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎ
ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２２ 目的蛋白酰基转移酶ＬｏｖＤ的表达
取诱导后试样的全细胞、上清和沉淀处理后分别
进行ＳＤＳＰＡＧＥ凝胶电泳（图９）。由图９可知：在相
对分子质量约４６×１０４处均可见１条清晰的目的蛋
白条带，与预期的酰基转移酶 ＬｏｖＤ蛋白大小相
符［１３］。酰基转移酶ＬｏｖＤ的表达量和可溶性表达水
平直接影响粗酶液生物催化生成辛伐他汀的比活力。
１为标准蛋白；２为未经ＩＰＴＧ诱导的全细胞蛋白；
３为经ＩＰＴＧ诱导的全细胞蛋白；４为可溶性蛋白；５为不可溶性蛋白
图９ ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ．９ ＳＤＳＰＡＧＥａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｐｒｏｄｕｃｔ
由图９还可知：ＬｏｖＤ在表达过程中会发生错误
折叠和凝聚，导致部分以无生物活性的包涵体的形
式存在。为了提高蛋白表达量或者可溶性表达，一
些方法和策略已经建立［１６］，常用方法是溶解蛋白包
涵体成为可溶性蛋白［１７－１８］和基因突变去除半胱氨
酸残基进而增加蛋白可溶性表达［１９］。Ｘｉｅ等［２０］用
丙氨酸残基或极性天然氨基酸替换Ｃｙｓ４０和Ｃｙｓ６０，
显著提高 ＬｏｖＤ可溶性表达。笔者从多个方面对
Ｅｃｏｌｉ工程菌种发酵培养基和发酵条件进行优化，通
过Ｅｃｏｌｉ工程菌种发酵培养基和发酵条件优化，发
现可提高可溶性 ＬｏｖＤ蛋白的表达量。发酵条件优
化完毕后，用 ＳＤＳＰＡＧＥ和 Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测得全细胞
中目的蛋白表达量为１００ｍｇ／Ｌ，可溶性目的蛋白的
表达量为６６ｍｇ／Ｌ。
２３ 辛伐他汀的生物催化
从生物学角度出发，由洛伐他汀水解得到Ｍｏｎａ
ｃｏｎｌｉｎＪ，再利用ＬｏｖＤ催化转酰基反应便可以得到辛
伐他汀。但是粗酶液生物催化水平较低，得到的辛伐
他汀产量低（０４５ｇ／Ｌ）。通过提高酰基转移酶ＬｏｖＤ
表达量和可溶性表达水平，有助于提高粗酶液的生物
催化合成辛伐他汀的水平。经酰基转移酶ＬｏｖＤ的发
酵条件优化后，辛伐他汀产量提高到１２ｇ／Ｌ，转化率
为９０１％。其转化结果如图１０所示，由于酰基供体
ＤＭＢＳＭＭＰ可水解为ＤＭＢＳＭＰＡ，因此在反应中加
入过量的ＤＭＢＳＭＭＰ。
１为ＤＭＢＳＭＰＡ；２为ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ；３为ＤＭＢＳＭＭＰ；
４为ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ；ａ，ｂ，ｃ分别为反应０，１２，２４ｈ的ＨＰＬＣ分析；
ｄ，ｅ，ｆ分别为ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ，ＤＭＢＳＭＭＰ和ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ标准品对照
图１０ 生物催化的ＨＰＬＣ分析
Ｆｉｇ．１０ Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｆｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎａｃｉｄｆｒｏｍ
ｍｏｎａｃｏｌｉｎＪｓａｌｔａｎｄＤＭＢＳＭＭＰ
３ 结论
通过诱导工程菌种ＥｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＡＷ３１
过量表达酰基转移酶 ＬｏｖＤ，催化酰基供体 ＤＭＢＳ
ＭＭＰ及洛伐他汀水解产物 ＭｏｎａｃｏｌｉｎＪ进行转酰基
作用，从而经一步生物合成得到辛伐他汀。
５１ 第５期 朱丽平等：生物法合成辛伐他汀
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对工程菌种发酵培养基和发酵条件进行优化，确
定了最佳培养基为ＴＢ培养基。在２５０ｍＬ摇瓶的装
液量为 ５０ｍＬ，接种量为 ４％，３７℃培养到菌密度
（ＯＤ６００）为０７时加入０２ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ，２０℃诱导
２０ｈ，有利于酰基转移酶ＬｏｖＤ表达。最终全细胞中
目的蛋白表达量提高到１００ｍｇ／Ｌ，可溶性目的蛋白
的表达量提高到６６ｍｇ／Ｌ，辛伐他汀产量为１２ｇ／Ｌ。
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（１）：２０２８．
６１ 生 物 加 工 过 程 第９卷
＼＼ＤＺ１９＼Ｄ＼孙桂云＼生物加工２０１１＼第５期＼ＳＷ１１０５．ＰＳ ６校样 排版：孙桂云 修改日期：２０１１／０９／２８