全 文 ：利用 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$. !"!"从马来酸
转化制备 !#苹果酸
吴俊清，何冰芳!，欧阳平凯
（南京工业大学 制药与生命科学学院，南京 $%&&&’）
摘 要：利用 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$. !"%(从马来酸高效制备 !#苹果酸，优化了菌株 !"%(的发酵条件，最佳发酵培养
基组成为（) * +）：柠康酸，$,-；葡萄糖，.；磷酸二氢钾，%&,-；硝酸铵，$,&；硫酸镁，&,$-；七水硫酸亚铁，&,&%-；酵母膏，
$,(；玉米浆 -；/0值 1,$。在最适培养基中 .& 2培养 .& 3，菌体 /044&可达到 5 6 5,-，酶活达到 %5 ) *（+·3）（反应菌
液 /044&为 %&）。采用间歇添加马来酸钠反应 .$ 3，!#苹果酸质量浓度为 %-.,’ ) * +，!#苹果酸的收率达到 ’4,417。，
经离子配位体色谱分析，产物 !#苹果酸光学纯度为 ’4,’(7。
关键词：!"#$%&’()*$+ ,"#-%$. !"%(；马来酸；!#苹果酸；发酵条件优化
中图分类号：8(%- 文献标识码：9 文章编号：%41$ : .41(（$&&5）&5 : &&55 : &1
#$%&’()*$% $+ ,-.’-/’ /$ 01,-.-/’ 23 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$. 04%(
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!#苹果酸（!#TENEYO、!#TENAQ EQAR），别名羟基丁
二酸、羟基琥珀酸，是一种自然界中稀少的有机酸。
随着医药工业的发展以及对手性药物规则的进一步
严格，手性前体的生产得到极大的关注。!#苹果酸
主要应用于手性药物合成、手性添加剂、手性助剂等
领域，如：抗生素［%#5］、药物信息素［-］、抗病毒药
物［4］、抗癌药物［1#’］、12345&6 还原酶抑制剂［%&］、抗
组胺药［%%］、!#和 +#肉毒碱［%$，%.］、维生素（b）#泛酸［%5］
等合成，此外也可合成一些可生物降解的光学网状
聚酯［%-］、有利于神经通道再生可降解聚酯［%4］及药
! 收稿日期：$&&5#&-#.%
基金项目：江苏省自然科学基金（C\$&&$&%5）
作者简介：吴俊清（%’41#）男，河南人，硕士生，工程师，研究方向：应用微生物。
联系人：何冰芳，教授，ZON：&$-#(.-(1..4；B#TEAN：_A?)DE?)3Oc?V>Y, OR>, Q?
HMWd $&&5
·55·
生 物 加 工 过 程
L3A?OXO =M>S?EN MD CAM/SMQOXX B?)A?OOSA?)
第 $卷第 5期
$&&5年 %%月
万方数据
物拆分试剂和不对称合成的配体。
!"苹果酸合成方法主要有化学拆分法、生物拆
分法（或生物降解法）、生物转化法（酶法）等。化学
拆分法成本高，国内进行了消旋体苹果酸的生物拆
分研究工作，但 !"苹果酸对菌体生长有抑制作用，
!"苹果酸的生产浓度极低［#$］。国内还没有生物转
化法制备 !"苹果酸的研究报道。国外 %&’() *+
等［#,］，-’( ./0 1’02 3+ 4+ 等［#5］及 6/ 7+ "8+ 等［9:］报
道了从马来酸生物转化制备 !"苹果酸的研究，其中
后两者筛选的菌种酶活较高。
本文首次在国内报道从马来酸酶法制备 !"苹
果酸的研究，对菌株 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$.!3#, 的发
酵条件及酶反应进行优化，得到了高活力菌体，其转
化率等接近于国际报道的最高水平。
! 材料和方法
#+# 菌株
!"#$%&’()*$+ ,"#-%$. !3#,，6; 7"8 自行筛选所
得通过分析 #<& 0!=%，并采用 7>)?)@仪器鉴定的一
株 !"苹果酸高产菌［9#］。
特殊试剂：柠康酸（%A），购于日本东京化成株
式会社；!"苹果酸（7A），购于 8?BC’ D)0E)0’F>)(。
#+9 培养基
#+9+# 平板培养基（@ G H）
柠康酸 I+:；葡萄糖 9+:；磷酸二氢钾 #:+:；硝酸
铵 9+:；硫酸镁 :+9J；七水硫酸亚铁 :+:#J；酵母膏
:+9；琼脂 #J K 9:；E6值 $+9。
#+9+9 种子培养基（@ G H）
柠康酸 9；葡萄糖 L；酵母膏 9+,；玉米浆 J；磷酸
二氢钾，硝酸铵，硫酸镁，七水硫酸亚铁等含量同
#+9+#；E6值 $+9。
#+9+L 发酵培养基（@ G H）
柠康酸 9+J；磷酸二氢钾 #:+J；其它组分同
#+9+9。
#+L 培养条件
平板培养：L: M，9I K L: N；种子液发酵条件：
L: M，99 K 9I N，9:: 0 G O>(；发酵条件：L: M，9, K L9
N，9:: 0 G O>(。
#+I 酶活力测定
发酵液在 #: ::: 0 G O>(离心 9: O>(，所得菌泥悬浮
在 :+# O)? G H磷酸缓冲液（E6 $+9）中，调整反应液终
/0<<:至 #:，用 #P（体积分数）甲苯破壁，加入底物，在
L9 M下振摇反应，反应结束时煮沸终止反应。检测因
底物消耗而产生吸光值的变化，换算成酶活（@ G（H·N））。
#+J 定量分析
马来酸含量分析采用紫外分光光度法［9#］；苹果
酸含量的定量分析采用 6QHR法［9:］（色谱柱：%O>(/S
6QT",$6，7>)"A’. H’U)0’F)0>/&，6/0DB?/&，VW%）；!"苹
果酸的光学纯度分析使用 6QHR，色谱条件：配位体
交换柱 WV3XR6XA%H Y%"J:::（WBO>C’ RN/O>D’? %(’?"
Z&>& W/0[>D/，Y&’C’，4%Q%=）；柱温：L9 M；移动相：
# OO)? G H醋酸铜，:+# O)? G H 醋酸铵，E6I+J；流速：
# OH G O>(；检测波长：9,: (O。
" 结果与讨论
9+# !"#$%&’()*$+ 1"#-%$. !3#,的发酵条件优化
9+#+# 溶氧量对菌体酶活和生长的影响
不同装液量对菌体生长及马来酸水合酶酶活的
影响见图 #，从图 # 可见菌体生长随着瓶装量（9J:
OH摇瓶）增加而降低，即氧气供应量越高，菌体生长
越好，说明该菌体的生长需要较高溶氧。瓶装量在
I: OH到 <: OH之间，发酵所得菌体的酶活相对较
高，但马来酸水合酶的活力与菌体生长并非成正比，
这可能是柠康酸的消耗诱导及反应液 E6变化的综
合因素影响所致，其中 J: OH G 9J: OH的发酵菌体酶
活最高，因此 9J: OH摇瓶的装液量选择在 J: OH。
图 # 溶氧量对菌体的酶活和生长的影响
8>@+# ;22/DF& )2 .>&&)?[>(@ )SZ@/( )( FN/ O’?/’&/’DF>[>FZ ’(.
@0)\FN )2 &F0’>(
9+#+9 接种量对菌体酶活和生长的影响
图 9中显示接种量在 #P K #:P范围内接种量
越大，菌体生长越差，但酶活的最高峰出现在接种量
IP处，说明酶活与菌体生长不成正比。大量的实验
表明（数据未列出）该酶往往在菌体生长适中的情况
9::I年 ##月 吴俊清等：利用 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$. !3#,从马来酸转化制备 !"苹果酸 ·IJ·
万方数据
下才出现较高的酶活。
—!—!"
图 # 接种量对菌体酶活和生长的影响
$%&’# ())*+,- .) %/.+012,%./ -+2123 ./ ,4* 521*2-* 2+,%6%,7 2/8
&3.9,4 .) -,32%/
#’:’; 碳源对菌体酶活和生长的影响
#’:’;’: 不同碳源对菌体酶活和生长的影响
各种碳源：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、山梨糖、山梨
醇、乳糖、可溶淀粉、果糖各 # & < =，不同碳源对菌体
生长和酶活的影响见图 ;。从图 ;可见以乳糖为碳
源时尽管酶活最高，但菌体生长较差。以麦芽糖、葡
萄糖、山梨醇为碳源时菌体生长及酶活均比较高，其
中麦芽糖最佳，考虑成本等因素本研究全过程用葡
萄糖作碳源。
:—-0+3.-*，#—&10+.-*，—521,.-*，>—-.3?%/，
@—&10+%,.1，!—12+,.-*，A—-.10?1* -,23+4，B—)30+,.-*
图 ; 不同碳源对菌体酶活和生长的影响
$%&’; ())*+,- .) 623%.0- +23?./ -.03+*- ./ ,4* 521*2-* 2+,%6%,7 2/8
&3.9,4 .) -,32%/
#’:’;’# 葡萄糖量对菌体酶活和生长的影响
葡萄糖质量浓度为 #’"、#’@、;’"、;’@、>’"、>’@
& < =时，菌体生长和酶活的变化见图 >：随着葡萄糖
添加量的增加，，菌浓度有所升高，但酶活在葡萄糖
质量浓度高于 ; & < =时反而下降，可能是碳源与诱
导剂（是一种较难利用的碳源）的比例改变时，不能
在菌体生长的最适宜阶段产生诱导，从而影响了诱
导效果，葡萄糖的最适质量浓度定为 ; & < =。
图 > 葡萄糖量对菌体酶活和生长的影响
$%&’> ())*+,- .) &10+.-* +./+*/,32,%./ ./ ,4* 521*2-* 2+,%6%,7 2/8
&3.9,4 .) -,32%/
#’:’> 氮源对菌体的酶活和生长的影响
#’:’>’: 无机氮源
考察无机氮源（# & < =）：硝酸铵、硝酸钠、氯化
铵、脲、硫酸铵、碳酸氢铵对菌体发酵的影响结果如
表 :，从表 : 中可见各种无机氮源对菌体的生长和
酶活均有一定的促进作用，其中硝酸铵的影响较显
著。
表 : 无机氮源对菌体酶活和生长的影响
C2?1* : ())*+,- .) %/.3&2/%+ /%,3.&*/ -.03+*- ./ ,4* 521*2-* 2+,%6%D
,7 2/8 &3.9,4 .) -,32%/
EFG FH>FI;FH>HJI; F2FI; FH>J1 JI（FH#）#（FH>）#GI>
!"!!" ;’@K ;’;K ;’@" ;’!; ;’@" ;’!#
#$ :>’! :>’@ :>’@ :>’# :>’" :;’B
注：EFG代表 %/.3&2/%+ /%,3.&*/ -.03+*；#$代表 521*2-* 2+,%6%,7
#’:’>’# 有机氮源
有机氮源选以下几种（用量 & < =）：酵母膏 ;；酵
母膏（L%)+.）#’@；玉米浆 :@；棉粉蛋白 ;；蛋白胨 #’@；
牛肉膏 #’@；各种有机氮源对菌体生长和酶活的影
响见表 #。
·>!· 生物加工过程 第 #卷第 >期
万方数据
表 ! 有机氮源对菌体的酶活和生长的影响
"#$%& ! ’((&)*+ ,( ,-.#/0) /0*-,.&/ +,1-)&+ ,/ *2& 3#%&#+& #)*040*5
#/6 .-,7*2 ,( +*-#0/
89: ;’ <:= ><> > ?’
!"@@A BC@@ DCEB DCAF !CGE BC!!
#$ EDCH EDC! EBC! EECE EBC@
注：89:代表 ,-.#/0) /0*-,.&/ +,1-)&；#$ 代表 3#%&#+& #)*040*5；
;’代表 5&#+* &I*-#)*；<:=代表 ),-/ +*&&J %0K1,-；><>代表 J1%L
4&-,1+ ),**,/ J-,*&0/；>代表 J&J*,/&；?’代表 $&&( &I*-#)*
酵母膏与玉米浆均具有良好的效果。酵母膏对
酶活的促进较明显，玉米浆既有利于菌体的生长，同
时又能提高酶活，因此考虑采用这两种氮源作为复
合有机氮源从而进一步确定最佳的氮源量。不同比
例复合氮源对发酵菌体酶活和菌体生长的影响见图
H、@。分别是以玉米浆和酵母膏为纵轴和横轴，菌体
的酶活和生物量 !"@@A为 M轴的三维图和投影图。
图 H 玉米浆和酵母膏双因素对菌体酶活的影响
N0.CH ’((&)*+ ,( ),-/ +*&&J %0K1,- #/6 5&#+* &I*-#)* ,/ *2& 3#%&#+&
#)*040*5 ,( +*-#0/
图 @ 玉米浆和酵母膏双因素对菌体生长的影响
N0.C@ ’((&)*+ ,( ),-/ +*&&J %0K1,- #/6 5&#+* &I*-#)* ,/ *2& .-,7*2
,( +*-#0/
从图中可以发现酵母膏 !C@ . O =，玉米浆 H . O =
时，酶活最好，而菌体生物量随两种有机氮源增加而
增加，因此最佳条件的选取应综合考虑两方面的影
响，故选用酵母膏 !CG . O =、玉米浆 H . O =做氮源时，
酶活比较高、且生物量相对较好。
!CECH 缓冲体系对菌体酶活和生长的影响
!CECHCE 缓冲能力对菌体酶活和生长的影响
发酵液的缓冲体系主要用来缓冲因诱导物（柠
康酸）的利用而产生的 JP变化，因柠康酸为较难利
用的碳源，因此适当地延长发酵时间也是增加诱导
物的利用时间，有利于酶活的诱导。磷酸盐含量即
缓冲能力与发酵时间对菌体生长及酶活均有影响，
本实验同时考察磷酸盐添加量与发酵时间对菌体生
长和酶活的影响，图 F，G是以磷酸盐添加量与发酵
时间为纵轴和横轴，菌体的酶活和生物量为 M轴的
三维图和投影图。
图 F 磷酸二氢钾和发酵时间双因素对菌体酶活的影响
N0.CF ’((&)*+ ,( J,*#++013 60256-,.&/ J2,+J2#*& #/6 (&-3&/*#*0,/
*03& ,/ *2& 3#%&#+& #)*040*5 ,( +*-#0/
图 G 磷酸二氢钾和发酵时间双因素对菌体生长的影响
N0.CG ’((&)*+ ,( J,*#++013 60256-,.&/ J2,+J2#*& #/6 (&-3&/*#*0,/
*03& ,/ *2& .-,7*2 ,( +*-#0/
!AAD年 EE月 吴俊清等：利用 %&’()*+,-.(/ 0&’1)(2 QREG从马来酸转化制备 QL苹果酸 ·DF·
万方数据
从图 !、"可见菌体的生物量随发酵时间的增加
而减小，这主要是菌体优先利用葡萄糖，葡萄糖基本
用完后，才缓慢利用较难代谢的诱导剂柠康酸，导致
生物量下降，而酶活在 #$ %内却逐渐上升，结果表
明磷酸二氢钾含量在 &$’( ) * +时，发酵时间在 #$ %
有较高的酶活，且菌浓度相对较高，也证实了该发酵
需要较强的缓冲能力才能有效地诱导出高活性的
酶。
,’&’(’, 培养基初始 -.对菌体酶活和生长的影响
发酵培养基初始 -. 值分别为 /’"、!’$、!’&、
!’,、!’#、!’0、!’/、!’"，磷酸二氢钾含量均为 &$’( ) *
+，初始 -.值对菌体的生长及酶活的影响较小（数
据不再罗列），-.值在 !’$ 到 !’0 之间菌体浓度和
酶活相对较高，这说明酶活的高低主要由诱导状况
及发酵后的终 -.所致，而发酵液的 -.又由诱导物
的利用程度与发酵液的缓冲能力所定，受起始 -.
的影响较小。
,’&’/ 生长曲线
采用优化发酵培养基测定菌体生长曲线及酶活
的变化曲线，图 1表明摇瓶培养开始后较快进入对
数生长期，到 &0 %达最高生物量，其 !"//$为 (’1(，
然后逐渐进入衰亡期，而酶活则从 &/ % 后快速上
升，,, %后转为缓慢上升，一直到 ," 2 #, % 酶活达
到最高，这主要是因为菌体首先利用葡萄糖、玉米浆
和酵母膏，此时菌体生长旺盛，随着葡萄糖等逐渐消
耗，菌体开始利用难代谢的诱导剂柠康酸，随着柠康
酸的消耗，马来酸水合酶才逐渐诱导出来。
—!—!"
图 1 生长曲线
34)’1 5%6 789:6 ;< )9;=>%
,’, 酶转化反应条件的优化
,’,’& 破壁剂对酶活的影响
表 0表明了不同破壁剂对酶活影响的结果，破
壁剂的影响有菌体破碎对胞内酶的释放的正面影
响，也有破壁剂引起酶蛋白变性的负面影响，破壁剂
甲苯、?@? 和 A5BC 均有一定的破壁效果，其中
A5BC的效果最佳，其最佳破壁浓度为 #’!(D。
表 0 破壁剂对酶活的影响
5EFG6 0 H<<67>I ;< -69J6EF4G4KE>4;L 96E)6L> ;L >%6 JEG6EI6 E7>4:4>M
=4>% ;< I>9E4L
NO
&P
5
!’(D
5
,’(D
A5BC
#’!(D
A5BC
(D
A5BC
/’,(D
A5BC
,D
?@?
#$ &,’, &0’# &(’# &/’( &(’" &(’ ! &0’"
注：NO代表 N69J6EF4G4KE>4;L 96E)6L>；#$代表 QEG6EI6 B7>4:4>M R 5
代表 5;G86L6
,’,’, 温度对酶活初速度的影响
温度对酶活初速度的影响见图 &$，在所选温度
范围内随着温度的升高，马来酸水合酶的酶活初速
度也升高。升高温度增加底物分子的热能，可以提
高反应的速率，但较高温度也会引起酶蛋白变性，考
虑到两方面的影响，且酶转化反应所需时间较长不
利于酶稳定性，通过长时间转化的转化率测定结果
（未列出），本研究最适反应温度定为 #/ S。
图 &$ 温度对酶活影响
34)’&$ H<<67>I ;< >6J-69E>896 >; ;L >%6 JEG6EI6 E7>4:4>M ;< I>9E4L
,’,’# 缓冲液 -.值对酶活的影响
表 (表明磷酸缓冲液的 -.值对酶活无明显影
响，说明此酶在较宽的 -.范围内均有较高的活力，
-.值在 !到 !’,之间的酶活为最高。
表 ( 反应液 -.值对酶活的影响
5EFG6 ( H<<67>I ;< -. ;L >%6 JEG6EI6 E7>4:4>M ;< ;< I>9E4L
-. /’! !’$ !’,( !’( !’!( "’$
#$ &(’"" &/’&$ &(’11 &(’0$ &(’#$ &(’,0
备注：#$代表 QEG6EI6 B7>4:4>M
·0"· 生物加工过程 第 ,卷第 0期
万方数据
!"!"# 底物质量浓度对酶活的影响
底物质量浓度对酶活的影响见图 $$，马来酸浓
度在 %& ’ ( )以下时，酶活随底物浓度的升高有所上
升，但超过 %& ’ ( )时，产生了明显的抑制现象，说明
高底物质量浓度对菌体的马来酸水合酶有显著的抑
制作用。因此转化反应的马来酸浓度应控制在 %&
’ ( )以下。
图 $$ 底物质量浓度对酶活的影响
*+’"$$ ,--./01 2- 13410560. /27/.70560+27 27 08. 96:.61. 6/0+;+0< 2-
1056+7
!"!"= 间歇添加马来酸制备 >?苹果酸
采用间歇添加马来酸钠，将反应液中马来酸浓
度控制在 %& ’ ( )以下，具体反应过程中底物质量消
耗及产物生成情况见图 $!。反应 @! 8后，>?苹果酸
浓度达到 $=@"A ’ ( )，>?苹果酸摩尔产率达到
AB"BCD。
图 $! 间歇添加马来酸制备 >?苹果酸
*+’"$! F+9. /2351. 2- 08. /27;.51+7 2- 96:.60. 02 96:60. +7 +70.5?
9+00.70:< 6GG.G H+08 I6?96:.60.
!"!"B 产物检测
反应上清液用 = 92: ( )硫酸
调节溶液至 JK 达 $"& 后，加入
硫酸铵至饱和，用乙酸乙酯抽提
两次后浓缩得产品，产品经 ILM
分析确定产物结构，并用高效液
相分析检测产物的光学纯度，产物核磁共振分析结
果（参照 > E苹果酸结构）：$K?ILM（=&&LKN，>!O），
!!"%#（!K，PK!），!#"=C（$K，PK）；$@ P?ILM：!$CB"&%
（P Q O，羧酸），!$C#"&A（P Q O），!BB"#!（PK），!@%"&=
（PK!），因产品在 >O!中溶解，故醇羟基和羧羟基上
的 K被 >取代，在氢谱上不出峰，根据以上化学位
移值与标准品对照完全一致，证实该物质是苹果酸。
采用手性分离柱层析进行产物的光学纯度分
析，高效液相分析结果如图 $@。
图 $@ 苹果酸标准品与产物的 KR)P色谱图
*+’"$@ KR)P /8529602’5691 2- 96:+/ 6/+G 1067G65G 67G 08. J52G?
3/0
由于 )?苹果酸与 >?苹果酸在 !%& 79处的吸收
系数相近，故直接用 KR)P图谱的面积来换算两者
的含量，换算所得 >?苹果酸光学纯度为 AB"A%D。
! 结论
本文优化了 !"#$%&’()*$+ ,"#-%$. >L$%发酵条件
!&&#年 $$月 吴俊清等：利用 !"#$%&’()*$+ /"#-%$. >L$%从马来酸转化制备 >?苹果酸 ·#A·
万方数据
及酶转化条件，优化后的发酵液的最高生物量
!"!!"达 #$%，远大于 &’()*+, -$ .’/ 0+( 1+(2 报道的
#$%&’()(*+$ ,$%&’(+-.+-/0%*%$ 345&678!9 菌浓度（发
酵液的 !"!!"约 "$8），本研究发酵所获菌体的酶活
也较高，高于 :;’/< =$ 报道的 12342(5+.3%2 ;>
&45?!@?，接近于 A+ 6$ BC$ 报道的 12342(5+.3%2 #+$6
.%*$ D&D4@?的酶活水平。
综合菌体生物量和酶活水平，本研究的 DB苹果
酸生产菌 #/)%-(5+.3%2 7/),-%8 D&@8达到了国际先进
水平，同时填补了国内酶法高效转化制备 DB苹果酸
研究的空白，具有很大的产业化前景。
参考文献：
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)>;0)+/;+/O+(［-］$ X+,(’O+0(［!］ 6’)E+J H，&’V0+/ &_，-’(.+;, _Z，+, ’E$ HJ/,O+;); ’/0 ’/,).)(’E ’NB
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