全 文 ：自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵耦合废液
全循环工艺的研究
李 宁!，葛旭萌，谢 健，白凤武
（大连理工大学 生物科学与工程系，大连 !!"#$%）
摘 要：在以 &’$ 为驱动力的单级悬浮床生物反应器中，进行了自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵耦合废液全循环实
验研究。以双酶法制备的玉米粉糖化液为底物，系统连续运行了 $( )，每隔 * ) 将收集到的发酵液集中精馏处理，
得到的废糟液直接用于玉米粉调浆制糖。实验数据表明，在稀释率为 # +#* , - !条件下，发酵液中乙醇、残还原糖、残
总糖质量浓度基本稳定，其平均值为 ($ +./，%# +#$ 和 0# +(/ 1·2 - !。对废液循环工艺过程中，发酵液中的 ( 种高沸点
有机酸进行了定量分析，发现发酵液中仅丙酮酸有明显积累，并最终在 # +! 3 # +% 456·2 - !范围内波动。实验结果表
明：系统中存在的高沸点副产物不对乙醇发酵产生明显抑制作用，乙醇连续发酵能够在废液全循环条件下良好运
行。
关键词：自絮凝酵母；乙醇连续发酵；废糟液全循环；高沸点有机酸
中图分类号：78.$ 文献标识码：9 文章编号：!"/$ - %"/(（$##"）#0 - ##!/ - #0
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基金项目：国家 ("% 高科技研究发展计划项目（$##$99"0/#"#）
作者简介：李 宁（!."0B），女，湖南长沙人，工程师，硕士，研究方向为生物化工。
联系人：白凤武，教授，博士生导师，?B4E<6：MHSE<[ )6AL T C)A T O=
第 0 卷第 0 期
$##" 年 !! 月
生 物 加 工 过 程
&,<=CNC D5AK=E6 5M F<5JK5OCNN ?=1<=CCK<=1
;5Q T $##"
·!/·
万方数据
精馏废液直接循环使用是解决乙醇发酵工业严
重环境污染问题简单、经济和彻底的途径。然而，目
前普遍采用的带渣发酵的技术，使得精馏废液含有
大量糟渣和酵母细胞，严重干扰废糟液的直接循环
使用［!"#］。以酵母细胞自絮凝形成颗粒作为细胞固
定化方法，发酵过程实现了清液发酵，发酵液精馏后
排出的废液不仅没有原料残渣，基本不含酵母细胞，
!"# 总量减少 $%&，为乙醇发酵耦合废糟液直接全
循环使用创造了十分有利的条件［’"(］。
对于采用的废糟液循环工艺，发酵产生的高沸
点有机酸在发酵过程中可能不断积累。关于有机酸
对酵母细胞生长和乙醇发酵的影响很早就引起了学
者的关注［)］。然而，迄今为止，对于这种新的废液
“全循环”工艺过程中高沸点有机酸积累规律的研究
还未见报道。本实验在单级悬浮床生物反应器中进
行了以 *+,为驱动力，蒸馏废糟液全部循环回用的
自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵实验，研究了该工艺
条件下发酵过程中高沸点有机酸的积累规律，为该
工艺在工业中的应用奠定了基础。
! 实验材料和方法
! -! 菌 种
自絮凝颗粒酵母（ ./.*%!）是粟酒裂殖酵母
（ $%&’()*+%%&+,+)-.%/* 0)-1/）变异株和酿酒酵母
（$+%%&+,)-.%/* %/,/2’*’+/）变异株通过原生质体融合
而得到的融合株。该菌株具有两亲株的优点，乙醇
发酵性能优良且具有良好自絮凝特性，大连理工大
学生物工程系保藏。
! -, 主要原材料与试剂
干法脱皮脱胚玉米粉由铁岭市玉米综合加工厂
赠送；!"淀粉酶和糖化酶由诺维信中国（012134567
*89:;）公司赠送。
! -) 培养基
·? @ !）：酵母粉 ) -A’，蛋白胨
) -%，葡萄糖 )%；
低糖流加培养基（>·? @ !）：酵母粉 #，蛋白胨 )，
葡萄糖 !’%（于 !!% B下灭菌 ,% 59:）；
高糖流加培养基（>·? @ !）：玉米粉糖化液（总糖
在 ,’% C ,D% 之间，还原糖 ,#%）；于 !!% B下灭菌 ,%
59:，加入已灭菌的无机盐溶液（每升糖化液加
（0E#）,E/+# ! -’ >，FE,/+# % -’ >）。
! -# 培养及发酵方法
! -# -! 自絮凝酵母的摇瓶培养
取一环新鲜斜面菌体接入装有 !%% 5? 长培养基的 ,’% 5? 摇瓶中，在旋转式摇床上，!’%
G·59: @ !，)% B的条件下培养 ,# 8。
! -# -, 絮凝颗粒酵母的反应器扩大培养
摇瓶培养的絮凝酵母接入装有 基的 ! ,%% 5?悬浮床生物反应器［’"(］中。间歇培养
至反应器中残糖约 ! >·? @ !时，采用低糖流加培养基
进行连续流加培养，调节流加速率，维持残糖水平在
! >·? @ !左右，培养温度控制在 )% B左右，直到反应
器内的生物量（细胞干重）达到 )% C #% >·? @ !。
! -# -) 絮凝颗粒酵母酒精连续发酵
流加高糖培养基，进行乙醇连续发酵。以 *+,
作为反应器循环驱动力，发酵罐温度控制在（)! H
% -)）B，IE 控制在 # -, C # -’。实验过程中每隔 ’ J
将收集的发酵废液经过降膜浓缩蒸去酒精等轻组
分，蒸馏后的高沸点组分废液全部直接用于调浆，制
备新鲜的进料玉米糖化液，用于酒精连续发酵。系
统连续运行了 ,A J，共进行了 ’ 批次实验。
! -’ 分析方法
乙醇由气相色谱仪 K>9L6:M $A(% 系统测定。还
原糖直接由斐林反滴定法测定，总糖经酸水解后，由
斐林反滴定法测定［!%］。生物量的测量采用干重法，
即取样后置于预先烘干称重的滤纸上过滤，并用蒸
馏水洗涤菌体 , C ) 次，然后置 A’ B的恒温箱中烘
干至恒重后称重。
有机酸的分析采用高效液相色谱法，具体条件
如下：
N;M6G7 $%%O 高效液相色谱仪，苯乙烯"二乙烯基
苯离子排斥柱（F*"A!!，A 55PQ R )%% 55?）；流动相：
体积分数为 % -!& E) /+#，! -% 5?·59: @ !；柱温：’%
B；#!% 型示差检测器，检测器温度 ’’ B。A 种有机
酸标准品的保留时间如表 ! 所示。
表 ! A 种高沸点有机酸标准品的保留时间
S;TL6 ! U6M6:M91: M956 1V 69>8M 1G>;:9W ;W9J 7M;:J;GJ 7;5IL6
标准品 保留时间 X 59: @ !
酒石酸 $ -D%
丙酮酸 $ -A’
苹果酸 D -,!
乌头酸 D -’(
丁二酸 A -)A
乳酸 A -AD
反丁烯二酸 ( -’#
戊二酸 !% -,!
·!A· 生物加工过程 第 # 卷第 # 期
万方数据
! 结果与讨论
图 ! 为生物反应器系统完全进入发酵状态后，
连续运行 "# $反应器中残还原糖、残总糖和乙醇质
量浓度变化情况。
实验从第 % $开始废液全循环，如图 !所示，废液
全循环开始后（第 % $之后），残还原糖、残总糖质量浓
度随之升高，发酵液中酒精质量浓度略有下降；第 & $
之后，随着循环次数的增加，残总糖、残还原糖在一定
范围的波动，其平均值为 ’()#& *·+ , !和 -()(" *·+ , !，
而酒精质量浓度基本稳定，其平均值为 #").& *·+ , !。
实验结果表明，该实验过程中废液循环对乙醇发酵没
有产生明显的抑制作用，发酵仍能够正常进行，说明
了该菌种对环境的适应能力较强。
图 "（/）、（0）分别为第 ! 次废液循环和第 % 次
废液循环时期发酵液中高沸点组分的高效液相色谱
图。
—!—残还原糖；—"—残总糖；—#—酒精
图 ! 酒精、残总糖和残还原糖随时间的变化
12* )! 3456789，48469 :;$<=42>; ?<*6: 67$ :;?2$<69
:;$<=42>; ?<*6: >6:264287 @245 45; 42A;
图 " 第 ! 次废液循环回用（/）与第 % 次废液回用（0）酒精发酵副产物的高效液相色谱图
12* )" B5:8A648*:6A 8C DEFG:8$<=4? 27 ;456789 C;:A;7464287 27 C2:?4 67$ C2>; $2?42996*; :;=E=927*
由表 " 可知，废液循环工艺发酵后期丙酮酸的
浓度明显高于第 ! 次废液循环时期的浓度，其他有
机酸的积累现象不明显。本工艺条件下，发酵液中
积累的高沸点有机酸主要为丙酮酸。
表 " 第 !，% 次废液循环回用丙酮酸和乳酸比较
H6D9; " B8AG6:2?87 GE:<>2= 6=2$ 67$ 96=42= 6=2$ 27 ;456789
C;:A;7464287 27 C2:?4 67$ C2>; $2?42996*; :;=E=927*
!（丙酮酸）I
A89·+ , !
!（乳酸）I
A89·+ , !
第 ! 次废液循环回用 , ( )(’% (
第 % 次废液回用 ( )!(’ # ( )(-( .
, ：含量过低，无法精确定量。
图 - 为发酵液中丙酮酸浓度随时间的变化情
况。从图 - 可以看出，循环初期，丙酮酸的浓度呈上
升趋势，表明高沸点副产物———丙酮酸发生了积累。
发酵液中丙酮酸的浓度在第 !( $ 积累至 ( )"% A89·
+ , !左右，此后随着发酵的进行，其浓度在 ( )! J
( )- A89·+ , !范围内波动。
图 - 丙酮酸浓度随时间的变化
12* )- H5; >6:264287 8C =87=;74:64287 8C GE:<>2= 6=2$ @245 42A;
"((K 年 !! 月 李 宁等：自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵耦合废液全循环工艺的研究 ·!.·
万方数据
! 结论及展望
整个实验装置运行近一个月，酒精质量浓度基
本稳定，平均值为 !" #$% &·’ ( )，残总糖、残还原糖在
一定范围内波动，平均值分别为 *+ #!%，,+ #+" &·
’ ( )。废液全循环工艺能够正常进行。在以 -."为
驱动力的自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵并耦合废液
全循环工艺工程中，大多数高沸点有机酸没有积累
的现象，仅丙酮酸产生了明显的积累，而后随着发酵
的进行，其浓度在 + #) / + #, 012·’ ( )范围内波动，丙
酮酸浓度的大小对酒精发酵没有产生影响。
从 3次循环实验所测定参数来看，废液蒸馏高沸
点副产物在短期废液循环内对乙醇连续发酵没有产
生抑制现象，自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵耦合废液
全循环使用的工艺在技术上是可行的，为这一新的乙
醇发酵技术实现污染物源头减废、清洁生产奠定了良
好基础。至于长期废液循环副产物能否对酒精连续
发酵产生的抑制有待于进一步的实验验证。
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国 内 简 讯
首项生物柴油国家标准进入报批程序
由中国石油化工股份有限公司提出，石油化工科学研究院起草的我国第一项生物柴油国家标准《柴油机燃料调和用生物
柴油》已进入报批程序。
据标准起草人，石油化工科学研究院张永光教授介绍，与矿物柴油相比，生物柴油具有以下 3 个方面的优势：
一是生物柴油的硫含量低，可减少约 ,+Z（有催化剂时为 %+Z）的 7." 和硫化物的排放，)+Z（有催化剂时为 $3Z）的 -.
排放以及 3+Z的 -." 排放，且不含有对环境造成污染的芳烃，生物柴油可降低 $+Z的空气毒性，采用生物柴油的发动机废气
排放可以满足欧洲!号排放标准。
二是生物柴油具有较好润滑性能，可以降低喷油泵，发动机缸体和连杆的磨损，这些部件的使用寿命可比普通柴油长。
三是生物柴油的闪点高于普通柴油，不属于危险品，在运界限，储存，使用等方面的安全性均好于普通柴油。
四是生物柴油的十六烷值高。十六烷值是衡量柴油点火性能的重要指标，十六烷值高，说明生物柴油具有良好的燃料性能。
五是生物柴油的原料不同于普通柴油的原料矿物质石油。生物柴油是一种可再生能源，也是一种降解性较高的能源。
据介绍，生物柴油是由动植物油脂与醇（例如甲醇或乙醇）经酯交换反应制得的脂肪酸单烷基酯，最典型的生物柴油是脂
肪酸甲酯。原料来源主要有油料作用，油料林木果实，油料水生植物以及动物油脂，废餐饮油等。生物柴油于 )$!! 年诞生于
德国，我国从 "++) 年开始生产生物柴油。目前全国生产生物柴油的企业有数十家，年产量超过 )+ 万 <。
据国家发改委能源研究所可再生能源发展中心副主任东明博士预测，"+)+ 年，我国生物柴油生产能力可达 "+ 万 <；到 "+"+
年，我国生物柴油生产能力要达到 "++ 万 <。我国生物柴油的原料来源十分丰富，据中国林业科学研究院副院长储富祥介绍，
我国常见的林本油料植物有 L++ 多种，其中种仁含油量超过 3+Z的就有数十种，总面积超过 LLL 万公顷，年产种仁 "++ 万 < 以
上。据了解，我国生物柴油国家标准共包括 )% 项技术要求，如密度 + #!" / + #$+ Y& [ 0,；闪点 ),+ \以上；冷滤点采用报告方式；
硫质量分数设定两个指标，即不大于 + #+3Z和 + #++3Z；硫酸盐灰分不大于 + #+"Z；水 + #+3Z；铜片腐蚀不大于 ) 级；十六烷值
不小于 *$；氧化安定性不小于 L #+；酸值不大于 + #!+；游离甘油不超过 + #+"Z；总甘油不超过 + #"*Z等。张永光教授认为，我国
生物柴油国家标准是一项相对比较高的标准，也是我国大部分生物柴油生产企业须踮起脚尖才能达到的标准。 （李 晖）
·"+· 生物加工过程 第 * 卷第 * 期
万方数据