全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&& 年 && 月
生"物"加"工"过"程
)8DEAJA+B=@EG>BC-DBU@BXAJJ0EFDEAA@DEF
fB>;! ,B;#
,Ba;$%&&
IBD%&%;!#!2P;DJJE;$ <#43;$%&&;%#;%%4
收稿日期%$%&& <%# <&1
基金项目%国家自然科学基金资助项目"$&&%$%&&#&常州市生物医药科技专项基金资助项目")0$%&&(%(&#&常州大学人才引进基金资助项目
"ZT]&%%$%%44#&常州大学大学生创新基金资助项目"&%*化*L*&&#
作者简介%周"琼"&!33#$女$江苏宿迁人$硕士研究生$研究方向%生物催化&何玉财"联系人#$博士$0*HGD>% V=XGD8A$%%4gVG8BB;XBH;XE
一种 Q 氰基吡啶水解酶产生菌的
高通量筛选策略及应用
周"琼$林春昕$蔡志强$何玉财$赵希岳$鲍"磊$鲍春芬
"常州大学 制药与生命科学学院 生物工程研究室$常州 $&
#
摘"要%利用改进的羟肟酸铁分光光度比色法建立了一种简单)快速)高通量的腈水解酶筛选方法( 应用该方法从
土壤中筛选获得 & 株具有 氰基吡啶水解酶活性的菌株))ZR&% &$经 &#Y @/,L序列分析$鉴定该菌为红球菌属
."$/$0$00),JUc&同时确定了最适反应温度)UN和金属离子添加剂分别为 % l)4c% 和 )G$j"%c& HHB>2.#( 在最
适催化反应条件下$催化转化 (% HHB>2.烟腈 # 8$烟酸的产率可达到 !c(h(
关键词% 氰基吡啶&羟肟酸铁&烟酸&腈水解酶&高通量筛选
中图分类号%5!& Q4%""""文献标志码%L""""文章编号%$ <#43"$%&&#%# <%%% <%(
".;-HF-423;-93F1:400/./; 724QH:L5/29L4.G./0H-LG426LS./;
0/SLI0942G3:./; 1F45./5/G.F15996.:5F.2/
ZN[R5DBEF$.O,)8=E D`E$)LOZ8D_DGEF$N0K=XGD$ZNL[QDV=A$-L[.AD$-L[)8=ECAE
".G6B@G?B@VBC-DBX8AHDXG>0EFDEAA@DEF$ )B>AFABC98G@HGXA=?DXG>GEI .DCAYXDAEXAJ$
)8GEF78B= REDaA@JD?V$ )8GEF78B= $&
$ )8DEG#
*J1F45:F%L8DF8*?8@B=F8U=?JX@AAEDEFHA?8BI CB@ED?@D>A*8VI@B>V7DEFAE7VHA\GJ=JAI 6GJAI BE GHBID*
CDAI CA@DX8VI@B`GHG?AJUAX?@BU8B?BHA?@V;RJDEF*XVGEBUV@DIDEAGJGJB>AED?@BFAE JB=@XA$ GED?@D>A*8V*
I@B>V7DEFJ?@GDE \GJDJB>G?AI C@BHJBD>;O?\GJDIAE?DCDAI GJ."$/$0$00),JU;6V&#Y @/,LJA_=AEXAGEG>V*
JDJ;TB@ABaA@$ ?8ABU?DH=H@AGX?DBE ?AHUA@G?=@A$ UNGEI HA?G>DBE GIID?DaA\A@A% l$ 4c% GEI )G
$j
"%c& HHB>2.#$ @AJUAX?DaA>V;LC?A@# 8 BC6DB?@GEJCB@HG?DBE$ ?8AVDA>I BCEDXB?DEDXGXDI C@BH?8A8VI@B>*
VJDJBC*XVGEBUV@DIDEA"(% HHB>2.# @AGX8AI !c(h;
K0L M24G1% *XVGEBUV@DIDEA& CA@DX8VI@B`GHG?A& EDXB?DEDXGXDI& ED?@D>A*8VI@B>V7DEFAE7VHA& 8DF8*
?8@B=F8U=?JX@AAEDEF
""烟酸$又名尼克酸$俗称维生素 -
(
*& <$+
$是一种
结构简单)理化性质稳定的维生素$具有增强细胞
新陈代谢)扩张血管)促进人体和动物生长发育的
功能*+ ( 工业上$生产烟酸主要通过化学方法"包
括化学氧化法)空气氧化法和氨氧化法等#合成$通
常需要在强酸或强碱)高温)高压等反应条件下进
行( 而腈水解酶法水解转化 氰基吡啶和烟酸的
高效合成$该工艺具有反应条件温和)污染小)环境
友好)副产物少等优点*1 <(+ ( 因此$筛选高活性的腈
水解酶实现烟酸的高效合成具有重要的现实意义(
在筛选腈水解酶的传统方法中$薄板层析法*#+
方法简单快速$但是通量较低( /AYGE?DJ等*4+报道
一种金属基方法能检测小于 (c% HHB>2.的产物$然
而这种方法不能应用于含有蛋白质等复杂体系中
腈水解酶活力的测定( YGE?BJ8W=HG@等*3+用平板法
测定产酶菌株催化脂肪族腈反应中释放出氨所导
致的 UN变化$以此进行腈水解酶的筛选$由于体系
中有缓冲溶液$反应中生成的弱酸或弱碱对 UN变
化影响小$因此该法检测不敏感( )A?DE 等*!+分别利
用水溶液中羧酸可以在羟胺和?$? 二环己基碳二
亚胺"/))#的存在下反应生成羟肟酸$羟肟酸和过
量高氯酸铁反应生成紫红色的羟肟酸铁络合物$此
法用分光光度法就可测定$但需要的显色的温度较
高"q(% l#( 因此$建立简单)快速)准确的羧酸分
析方法是非常必要的*&%+ (
笔者利用改进的羟肟酸铁比色法建立腈水解
酶的高通量筛选方法$从土壤中获得具有烟腈水解
酶活性的菌株 ."$/$0$00),JU;))ZR&% &$同时考
察温度)UN和金属离子对酶催化活性的影响(
D?材料与方法
DND?主要仪器
Rf $&%% 型紫外 可见分光光度计$上海精密
科学仪器有限公司&NN $QYZ M型恒温水浴锅$
金坛市虹盛仪器厂&bM. &#M型高速台式离心机$
上海安亭科学仪器厂&.) &%Lbf9型高效液相色
谱仪$岛津公司(
DNB?化学试剂
蛋白胨)酵母膏为生物级"上海国药集团化学
试剂有限公司#$其他试剂为市售分析纯( 用于羟
肟酸铁比色法显色的溶液配制(
高氯酸羟胺 "NL9# 溶液 "%c%4% HB>2.#%将
&c3# FNL9溶解于 $%% H.无水乙醇中得到NL9溶
液&?$ ? 二 环 己 基 碳 二 亚 胺 "/))# 溶 液
"%c#% HB>2.#%将 $1c4# F/))溶解于 $%% H.无水
乙醇得到/))溶液&高氯酸铁溶液"%c%4% HB>2.#%
将 1c!# F高氯酸铁溶解到 $%% H.的高氯酸中
"%c4% HB>2.#(
DNQ?土样采集
土壤试样采集于常州大学白云校区和武进校
区附近(
DNV?培养基
富集培养基"& .#%甘油 &% F$ N^
$
9[
1
$ F$,G)>
& F$TFY[
1
!4N
$
[%c$ F$]AY[
1
!4N
$
[%c%%$ F$维生
素母液 & H.*&&+ $ 氰基吡啶 $% HHB>( UN4c%(
发酵培养基"& .#%葡萄糖 &% F$蛋白胨 &% F$酵
母膏 ( F$ N^
$
9[
1
$ F$,G)>& F$TFY[
1
!4N
$
[%c$ F(
UN4c%(
以上培养基都在 &&( l灭菌 $% HDE(
DNW?目标菌株的筛选
将采集的土样 %c& F分别制备成 $ H.土壤悬
液$取 %c& H.土壤悬液加入到 H.富集培养基
"以 氰基吡啶为唯一 ,源#中$% l)&#% @2HDE
摇床上培养 13 8 后$取 $%%
$
.培养液$进行离心
"&% %%%*$( HDE#$然后取上清液 3%
$
.至 $1 孔板
中$利用羟肟酸铁比色法进行有机羧酸的检测(
DN@?菌株的培养及转化反应
利用发酵培养基对 ))ZR&% & 在 % l)&#%
@2HDE恒温摇床中振荡培养 13 8 后$离心"&% %%%*$(
HDE#培养液得到静息细胞$利用生理盐水将静息细胞
洗涤 次$然后将 %c$ F湿细胞重新悬浮于$ H.磷酸
缓冲溶液"UN4c%)&%% HHB>2.#中$加入 氰基吡啶
终浓度为 (% HHB>2.$在 % l)&#% @2HDE的恒温摇床
振荡反应( 反应过程中不同反应时间取样&(%
$
.$立
即加入 (%
$
.的 $ HB>2.N)>终止反应$充分振荡混
匀$离心取上清液$进行产物分析(
DN\?检测方法
羟肟酸铁比色法分析是利用紫外 可见分光光
度计测定水溶液中有机羧酸含量的分析( 将 & H.
%c%4% HB>2.NL9和 %c( H.%c#% HB>2./))溶液
加入到 3%
$
.的羧酸溶液中$混匀后在室温反应 &(
HDE$然后加入 4%%
$
.高氯酸铁溶液"%c%4% HB>2.#
进程显色$混匀后检测[/(
为了验证羟肟酸铁比色法的准确性$对烟酸样
品进行N9.)分析( )
&3
柱"Y8DH*UGXW f9*[/Y$ Y8D*
HGI7= )B;$ +GUGE#用于检测烟酸的浓度$流动相为
$% HHB>2. N^
$
9[
1
"UN$c(#$流速为 %c( H.2HDE$
检测波长为 $&( EH(
DN^?D@!4U$*序列分析法
采用 &#Y @/,L序列分析法进行菌种鉴
定*&& <&$+ ( 将测定的 &#Y @/,L序列用 -.LYb,与
MAE-GEW中已知的 &#Y @/,L序列进行同源性比较(
B?结果与讨论
BND?高通量筛选策略的建立
据文献 *!+显色反应机制$选择高氯酸羟胺
&"第 # 期 周"琼等%一种 氰基吡啶水解酶产生菌的高通量筛选策略及应用
"NL9#代替氯化羟胺"NL#$改进后显色反应可在
常温"$( k( l#下进行( 烟酸可与 /))和 NL9
溶液反应生成羟肟酸$而羟肟酸遇高氯酸铁生成紫
红色的羟肟酸铁( 基于这种改进的羟肟酸铁比色
法$可建立 氰基吡啶水解酶高通量筛选策略$反
应机制如图 & 所示(
图 D?羟肟酸铁比色法测定烟腈水解酶活性显色反应机制
O.;=D?,2624H;0/045F./; 405:F.2/1:-0I07245115L./; F-0QH:L5/29L4.G./0H-LG426LS./; 5:F.A.FL
JL 7044.:-LG42Z5I5F0190:F429-2F2I0F4L
""首先$对烟酸与显色剂形成的紫红色化合物溶
液进行 1%% k#(% EH的扫描$以确定合适的检测波
长$结果如图 $ 所示( 由图 $ 可知%在扫描光谱中可
观察到在 ($% EH处达到最大吸收峰&而对显色剂分
别与 氰基吡啶)烟酰胺形成的混合液进行扫描$
在 ($% EH处就无明显吸收峰( 故选择波长 ($% EH
用于烟酸的检测( 由于显色时间)显色温度以及
NL9)/))和 ]Aj的浓度对显色有较大的影响$因
此笔者对改进的羟肟酸铁比色法*&%+进行了优化"数
据未列出#$获得最佳显色条件%%c( H./))"%c#%
HB>2.# 和 &c% H.NL9"%c%4% HB>2.# 分别添加到
3%
$
.待测试样中$混合物在室温"$( k( l#条件
下恒温 &( HDE 之后$ 4%%
$
.高氯酸铁溶液"%c%4%
HB>2.#立即加入到混合液中$混匀后在 ($% EH处
进行检测分析(
图 B?Q 氰基吡啶)烟酰胺及烟酸吸收光谱
O.;=B?*J1249F.2/190:F43I27QH:L5/29L4.G./0$
/.5:./5I.G05/G/.:2F./.:5:.G
然后$以吸光度 C
($%
为横坐标$烟酸浓度
"HHB>2.#为纵坐标进行烟酸标准曲线的绘制$经线
性回归分析$得羟肟酸铁比色法回归方程 0m
3%c$C
($%
$相关系数.$ m%c!!( 3( 其浓度 吸光度
呈现良好的线性关系$吸收符合朗伯 比尔定律( 进
一步利用N9.)验证$羟肟酸铁比色法测定的结果
与高效液相色谱法测定结果基本一致"数据未列
出#$并且羟肟酸铁比色法可用试管或 $1 孔板中在
室温条件下"$( k( l#就可进行显色反应( 以上
表明$改进的羟肟酸铁比色法操作简单)快速)准
确$可以用来建立腈水解的筛选策略及分析烟酸的
含量(
BNB?活性菌株筛选
以 氰基吡啶为唯一 ,源$利用富集培养技
术*&&+从土壤中筛选 氰基吡啶水解酶产生菌( 显
色反应是在 $1 孔板中进行的$取 3%
$
.反应上清液
加入 & H.%c%4% HB>2.的 NL9和 %c( H.%c#%
HB>2.的 /))溶液$室温反应 &( HDE$再加入
4%%
$
.的高氯酸铁溶液混匀( 若反应液中存在烟
酸$加入显色剂后则立即出现颜色变化"图 #( 由
图 可知$该菌株具有降解 氰基吡啶合成烟酸的
能力( 经过初筛和复筛后$获得 & 株 氰基吡啶水
解活力较高的菌株 ))ZR&% &( 对该菌株 &#Y
@/,L进行测定$并用 &#Y @/,L序列分析法进行同
源性比较$序列进行-.LYb比对后$利用T0ML1c&
软件构建系统进化树$结果如图 1 所示( 由图 1 可
""""
$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
初步断定 ))ZR&% & 为红球菌属 "."$/$0$00),
JUc#$命名该菌株为."$/$0$00),JUc))ZR&% &(
图 Q?显色照片
O.;=Q?X.:F34027:2624H;0/045F.2/405:F.2/
BNQ?0"$1$2$22),19=,,aDC D 催化烟腈水解
特性初步研究
$cc&"催化反应温度及 UN对水解活力的影响
催化反应温度及反应 UN对 ."$/$0$00),JU;))*
ZR&% &催化 氰基吡啶水解的活性有着明显的影
响"图 (#( 由图 (可知%随着温度的升高$水解活力也
随之增大$在 1( l时达到最大值$继续提高反应温度$
水解活性快速下降( 由此可见$最佳反应温度为1( l$
但是考虑生物催化剂的热稳定性及易操作性$选择
% l为最适反应温度( 由图 ("6#可知%在反应条件过
酸或过碱时$ 氰基吡啶水解活力明显降低$在 UN4c%
时$酶活达到最大值( 由此确定$最适反应 UN为 4c%(
图 V?,,aDC D 菌株的系统进化树
O.;=V?X-L62;0/0F.:F40027,,aDCHD
图 W?反应温度和9"对 Q 氰基吡啶水解活力的影响
O.;=W?#70:F127405:F.2/F0I9045F3405/G405:F.2/9"2/QH:L5/29L4.G./0H-LG426LS./; 5:F.A.FL
$cc$"金属离子对酶活力的影响
金属离子对."$/$0$00),JU;))ZR&% & 细胞水
解 氰基吡啶活性是有影响的$考察金属离子的浓
度均为 %c& HHB>2.$所用的金属盐分别为 )G)&
$
)
)B)&
$
))=Y[
1
)]AY[
1
!4N
$
[)TFY[
1
)TE)&
$
!$N
$
[)
,G
$
TB[
1
!$N
$
[和 ZEY[
1
等$并与不加任何金属离
子的空白作对照$结果如图 # 所示( 由图 # 可知%
TE
$ j
)TB
#j和ZE$ j等对催化活力具有明显的抑制$
而)G$j)]A$j和 TF$j等对催化活性则具有较明显
的促进作用( )G$j"%c& HHB>2.#为最适的金属离
"第 # 期 周"琼等%一种 氰基吡啶水解酶产生菌的高通量筛选策略及应用
子添加剂(
图 @?金属离子对 Q 氰基吡啶水解活力的影响
O.;=@?#70:F127A54.231I0F56.2/12/QH:L5/29L4.G./0H
-LG426LS./; 5:F.A.FL
$cc"))ZR&% & 催化 氰基吡啶反应
在最适反应条件下$考察 ."$/$0$00),JU;))*
ZR&% & 催化水解 氰基吡啶的反应进程( 称取
&c% F))ZR&% &静息细胞$加入底物 氰基吡啶于
&% H.磷酸盐缓冲溶液体系"UN4c%)&%% HHB>2.#$
底物终浓度为 (% HHB>2.$水解转化反应在 % l)&#%
@2HDE条件下进行$结果如图 4所示( 由图 4可知%反
应 3 8 内$水解速度较快$3 8烟酸产率为 (3c1h(
&4 8后$烟酸产率为 44c$h( 进一步延长反应时间$
烟酸的产率变化不明显$反应 # 8 后$烟酸产率达到
!c(h$并且在反应过程中未发现烟酰胺生成( 提高
."$/$0$00),JUc))ZR&% & 催化活性及烟酸产量的
相关研究仍在进行中(
图 \?,,aDC D 静息细胞催化 Q 氰基吡啶反应进程
O.;=\?E.I0:234101724F-0-LG426L1.127QH:L5/29L4.G./0
JL 401F./; :06127,,aDCHD
Q?结论
利用一种改进的羟肟酸铁比色法建立了简单)
""""
快速及高通量的筛选策略( 利用该策略及分析方
法$从土壤中筛选获得 & 株催化 氰基吡啶合水解
产酶菌株."$/$0$00),JUc))ZR&% &$同时对其催
化特性进行了初步考察$得到最适催化反应条件%
反应温度为 % l$UN为 4c%$金属离子添加剂为
)G
$j
"%c& HHB>2.#( 在最适催化反应条件下$催化
(% HHB>2.的烟腈$烟酸的产率可达到 !c(h(
参考文献%
* & +"路百程;烟酸的合成与应用*++;辽宁化工$&!!1"#%!*&$;
* $ +"王之德;烟酸和烟酰胺的现状与前景*++;广东化工$&!!1
"$#%&&*&1;
* +"李艳云$尹振晏$宫彩红$等;烟酸的研究进展*++;北京石油
化工学院学报$$%%#$&1"&#%(!*#1;
* 1 +"何玉财$许建和;腈水解酶在羧酸合成中的研究进展*++;生
物加工过程$$%%!$4"&#%4*&$;
* ( +"许建和$何玉财$张志钧;一种产碱杆菌的培养及其于腈水解
制备羟基乙酸的方法%中国$&%&&3#!L*9+;$%%3*%(*%3;
* # +"NGUUA@/-;)8G@GX?A@D7G?DBE BCGED?@D>GJAC@BH?$0%/+ JU;
"."$/$0"%$),F@B=U# ,;);O;-;&&$&($=JDEF1*8VI@B`V*6AE7BED*
?@D>AGJJB>AXG@6BE JB=@XA*++;OE?+-DBX8AH$&!3($&4 "# #%
#44*#3;
* 4 +"/AYGE?DJM$Z8= Z$M@AAE6A@VSL;LE AE7VHA>D6@G@VGUU@BGX8
?B6DBXG?G>VJDJ%IAaA>BUHAE?BCED?@D>GJAJCB@AEGE?DBJA>AX?DaAU@B*
I=X?DBE BCXG@6B`V>DXGXDI IA@DaG?DaAJ*++;+LH)8AHYBX$$%%$$
&$1"&#%!%$1*!%$(;
* 3 +"YGE?BJ8W=HG@T$,GVGW LY$LEPGEAVG[$A?G>;LU>G?AHA?8BI
CB@JX@AAEDEFBC6GX?A@DGXGUG6>ABCIAF@GIDEFG>DU8G?DXED?@D>AJ
*++;+OEI TDX@B6DB>-DB?AX8EB>$$%&%$4"&#%&&&*&&(;
* ! +")A?DE M$Y=EF=@Y;LJUAX?@BU8B?BHA?@DXHA?8BI CB@?8AIA?A@HD*
EG?DBE BC>DJDEBU@D>DE ?G6>A?CB@H=>G?DBE*++;eAaLEG>)8AH$
$%%#$$("&#%&*&%;
*&%+"NAK)$TG).$Q= +N$A?G>;L8DF8*?8@B=F8U=?JX@AAEDEFJ?@G?*
AFVCB@ED?@D>A*8VI@B>V7DEFAE7VHAJ6GJAI BE CA@DX8VI@B`GHG?A
JUAX?@BU8B?BHA?@V*++;LUU>TDX@B6DB>-DB?AX8EB>$$%&&$3!"#%
3&4*3$;
*&&+"NAK)$Q= +N$Q= K$A?G>;-DBXG?G>V?DXJVE?8AJDJBC".#*HGE*
IA>DXGXDI C@BH@GXAHDXHGEIA>BED?@D>A6VGEA\>VDJB>G?AI ED*
?@D>GJA*U@BI=XA@C#0#+*&5&,JU;0)R%1%&*++;)8DE )8AH.A?$
$%%4$&3"##%#44*#3%;
*&$+"NAK)$Q= +N$Y= +N$A?G>;-DBU@BI=X?DBE BCF>VXB>DXGXDI C@BH
F>VXB>BED?@D>A\D?8 GEA\ 6GX?A@DG>DJB>G?ABCC#0#+*&5&,JU;
0)R%1%&*++;LUU> -DBX8AH -DB?AX8EB>$ $%&%$ &#%"(#%
&1$3*&11%;
1 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"