全 文 ：第９卷第１期
２０１１年１月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．９Ｎｏ．１
Ｊａｎ．２０１１
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－３６７８．２０１１．０１．００９
收稿日期：２０１０－０６－２９
基金项目：浙江省大学生科技成果推广项目（２００９）；浙江树人大学人才引进科研项目（２００８Ｒ００１）
作者简介：张建芬（１９７９—），女，浙江杭州人，博士，讲师，研究方向：微生物制药，Ｅｍａｉｌ：ｇｒａｃｅ＿ｚｊｆ＠１２６．ｃｏｍ
葡萄糖３ 脱氢酶产生菌的筛选和产酶培养
张建芬，沈明杰，曾为锋，季 佳，连振静
（浙江树人大学 生物与环境工程学院，杭州 ３１００１５）
摘 要：从土壤中筛选分离得到１株葡萄糖３脱氢酶产生菌，经生理生化初步鉴定为产酸克雷伯菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙ
ｔｏｃａ）。将菌株Ｄ８进行产酶优化培养，经过单因素法确定优化培养条件：乳糖为Ｃ源，酵母膏为Ｎ源，２５０ｍＬ摇瓶
装液量为５０ｍＬ，培养基的初始ｐＨ为７，３３℃培养时Ｇ３ＤＨ酶比活力最高，达到１４５Ｕ。
关键词：葡萄糖３脱氢酶；产酶培养；Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ
中图分类号：Ｑ８１４ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２０１１）０１－００４１－０５
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｇｌｕｃｏｓｉｄｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎｓａｎｄ
ｉｔｓｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧＪｉａｎｆｅｎ，ＳＨＥＮＭｉｎｇｊｉｅ，ＺＥＮＧＷｅｉｆｅｎｇ，ＪＩＪｉａ，ＬＩＡＮＺｈｅｎｊｉｎｇ
（ＣｏｌｅｇｅｏｆＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＺｈｅｊｉａｎｇＳｈｕｒｅｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ３１００１５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｇｌｕｃｏｓｉｄｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓ
Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ．Ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎ．Ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙ
ｏｆｇｌｕｃｏｓｉｄｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｔｈｉｓｓｔｒａｉｎｗａｓ１４５Ｕｕｎｄｅｒｌｉｑｕｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ：
ｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅ，ｌａｃｔｏｓｅ，ｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅ，ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ，５０ｍＬｃｕｌｔｕｒｅｍｅｄｉｕｍｉｎ２５０ｍＬｓｈａｋｉｎｇｆｌａｓｋａｔ
３３℃，ｐＨ７０．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ｆｅｒｍｅｎｔａｂｌｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎ；Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ
葡萄糖 ３ 脱氢酶（ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，
ｇｌｕｃｏｓｅ３ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，Ｇ３ＤＨ，ＥＣ１．１．９９．１）是１
种以黄素腺嘌呤二核苷酸（ＦＡＤ）为辅酶的氧化还
原酶，能氧化单糖和双糖及其衍生物葡萄糖环上的
Ｃ ３羟基，并将它们转化为 ３ 酮糖及其衍生
物［１－２］。以３ 酮糖为前体，通过一些简单的化学反
应能合成许多具有高附加值的药物或化工产品，包
括氨基糖抗体、去垢剂、糖聚合体、食品添加剂、抗
氧化剂等，具有广阔的发展前景［３－６］。目前，国外对
Ｇ３ＤＨ的研究报道较多，能生产 Ｇ３ＤＨ的微生物有
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ［７］、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓａｃｃｈａｒ
ｏｐｈｉｌｕｍ［１］、Ｈａｌｏｍｏｎａｓ（Ｄｅｌｅｙａ）ｓｐ．Ａ １５［８］、Ｃｙｔｏ
ｐｈａｇｅｍａｒｉｎｏｆｌａｖａ［９］、Ａｇａｒｉｃｕｓｂｉｓｐｏｒｕｓ［１０］等。而国内
对Ｇ３ＤＨ的研究报道较少，能生产 Ｇ３ＤＨ的微生物
仅有笔者所在课题组报道的 Ｓｔｅｎｏｔｒｏｐｈｏｍｏｎａｓｍａｌ
ｔｒｏｐｈｉｌｉａ［１１］。本文从土壤中筛选得到葡萄糖３ 脱
氢酶产生菌，并对其进行初步的菌种鉴定和产酶优
化培养。
１ 材料与方法
１．１ 材料
富集培养基：乳糖 ５ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４５ｇ，ＮａＣｌ
０２５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４０２５ｇ，ＭｇＳＯ４０１５ｇ，水 ５００ｍＬ。
ｐＨ７０，１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ。
分离培养基：按富集培养基配方配制５００ｍＬ，
琼脂质量分数为２０ｇ／Ｌ。
产酶Ｃ源培养基：牛肉浸膏 ４０ｇ，蛋白胨 ８０
ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４４０ｇ，ＮａＣｌ４０ｇ，水８００ｍＬ。每三角瓶
（２５０ｍＬ）分装５０ｍＬ，每瓶中加不同 Ｃ源０１５ｇ。
１２１℃下灭菌２０ｍｉｎ。
产酶 Ｎ源培养基：乳糖 ３０ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４４０ｇ，
ＮａＣｌ４０ｇ，水８００ｍＬ。每三角瓶（２５０ｍＬ）分装５０
ｍＬ，每瓶中加不同 Ｎ源 ０５ｇ。１２１℃下灭菌
２０ｍｉｎ。
本实验所用到的试剂除有机 Ｎ源外，其他试剂
均为分析纯。
１２ 菌种筛选方法
采集土样：采集浙江树人大学校园内，杭州玉
皇山等地的土壤作为筛选菌种的试样。取离地面
５～１５ｃｍ处的土样少许，用保鲜膜包好，储存至冰
箱４℃内。１周内完成菌种的筛选工作。
富集：称取１ｇ土样于三角瓶中，加入１０ｍＬ无
菌水振荡，取 ５ｍＬ上清液至乳糖培养基，３０℃、
１５０ｒ／ｍｉｎ培养２ｄ，重复富集２次。
菌种初筛：将富集培养液稀释后在固体培养基
平板上涂布，３０℃培养２４～４８ｈ。将０１ｍｏｌ／Ｌ蔗
糖溶液５ｍＬ和１０ｍｍｏｌ／Ｌ的２，６ 二氯酚靛酚溶液
（ＤＣＰＩＰ）０５ｍＬ于烧杯中混合，用移液枪取０２ｍＬ
混合液至９６孔板的小孔中。将平板上的菌落做好
记号，挑取少量至９６孔板上混匀，观察颜色变化。
如果颜色退去，说明具有 Ｇ３ＤＨ活力。将初筛具有
活力的菌株接种到试管斜面上培养２４ｈ，于４℃冰
箱内保存。
菌种复筛：将具有 Ｇ３ＤＨ酶活力的菌株进行摇
瓶液态培养，于３０℃、１５０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ。发
酵液于４℃下、５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，弃上清，沉
淀的菌体经生理盐水洗涤后分别加入 １ｍＬ０１
ｍｏｌ／Ｌ的蔗糖溶液，２ｍＬ０１ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７０的磷酸
盐缓冲溶液（ＰＢＳ），混匀后于３０℃水浴摇床反应
６ｈ。反应液于４℃下、５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取
上清液１ｍＬ，分别加入２ｍＬ０１５ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ溶
液，室温反应３ｍｉｎ，３００～３８０ｎｍ波长下扫描（ＤＵ
８００分光光度计），如在３４０ｎｍ下出现特征吸收峰，
证实有３ 酮蔗糖的生成，即该菌株能产生Ｇ３ＤＨ。
１３ 菌种生理生化鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》（第８版），鉴定项目
包括：形态观察、革兰氏染色、生理生化项目，其中
生理生化项目送至浙江工业大学生物工程研究所
进行ＡＢＩ细菌鉴定系统鉴定。
１４ 检测方法
１４１ Ｇ３ＤＨ酶活力测定
将发酵液离心（１００００ｒ／ｍｉｎ、４℃）５ｍｉｎ得到
湿菌体，加入ｐＨ６０的ＰＢＳ溶液１０ｍＬ。超声波破
碎（３００Ｗ，５ｓ，间隔１０ｓ），在冰浴中破壁１０ｍｉｎ，
４℃下抽提３０ｍｉｎ。离心，取上清液即为粗酶液。
在比色皿中加入２６ｍＬ、ｐＨ６０的０１ｍｏｌ／Ｌ
的ＰＢＳ溶液，０１ｍＬ０１ｍｏｌ／Ｌ的蔗糖溶液，０２ｍＬ
０４ｍｍｏｌ／Ｌ的 ＤＣＰＩＰ溶液，０１ｍＬ粗酶液，混匀。
以蒸馏水做空白调零，在 ６００ｎｍ下测吸光度减少
值。每隔３０ｓ测定，共测３ｍｉｎ。
脱氢酶酶活力单位定义：一个酶活力单位相当
于在上述条件下，２５℃、ｐＨ６０、１ｍｉｎ还原１μｍｏｌ
２，６ 二氯酚靛酚所需的酶量。
１４２ 生物量的测定
以未接种的稀释相同倍数的培养基液为空白
对照，将发酵液稀释 ５倍后，在 ６００ｎｍ下测定吸
光度。
１４３ 蛋白质浓度的测定
蛋白质浓度测定采用考马斯亮蓝染色法。取
１０ｍＬ经稀释的试样液，加 ５０ｍＬ考马斯亮蓝
Ｇ ２５０溶液，室温静置 ２ｍｉｎ，在 ５９５ｎｍ下测吸
光度。
１５ 产Ｇ３ＤＨ酶培养条件的优化
按１４１节酶活力测定方法来优化产Ｇ３ＤＨ酶
的培养条件。分别以麦芽糖、蔗糖、半乳糖、甘露
糖、乳糖、葡萄糖、淀粉、果糖作为 Ｃ源；酵母膏、
ＮＨ４Ｃｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、酵母粉、草酸、蛋白胨、尿素、
ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、胰蛋白胨、牛肉膏为Ｎ源，在ｐＨ为５０、
６０、７０、８０、９０和２７、３０、３３、３６℃下，筛选最佳产
酶培养条件。
２ 结果与讨论
２．１ 产Ｇ３ＤＨ菌种的筛选
菌种的筛选结果，如图１所示。从图１可以看
出：在９６孔板微反应体系中，反应５ｍｉｎ，菌株Ｄ８由
蓝色退为无色或黄色，而其他菌株没有退色或者退
色不明显。将菌株 Ｄ８进行摇瓶液态复筛，将发酵
２４ 生 物 加 工 过 程 第９卷
菌体以蔗糖为底物进行细胞转化反应，转化液碱法
处理后在３００～３８０ｎｍ波长下扫描，结果如图２所
示。从图２可以看出：菌株 Ｄ８的蔗糖转化液经碱
法处理后在３４０ｎｍ下出现特征吸收峰，而葡萄糖转
化液没有出现明显的吸收峰，从而证实了菌株 Ｄ８
能产生Ｇ３ＤＨ酶。
图１ 产Ｇ３ＤＨ菌株的筛选
Ｆｉｇ．１ ＳｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆＧ３ＤＨｐｒｏｄｕｃｉｎｇｓｔｒａｉｎ
图２ 细胞转化液的碱法分析
Ｆｉｇ．２ Ａｌｋａｌｉｎｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｅｌｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ
２．２ 菌种的鉴定
菌落的形态特征：从平皿菌落形态上看，Ｄ８菌
株菌落较小，边缘规则，表面光滑湿润，颜色呈乳白
色，有一定臭味。简单染色后，可以观察到 Ｄ８菌株
呈短杆状，菌株较小，确定 Ｄ８菌株为短杆状细菌。
经革兰氏染色后，可以观察到 Ｄ８菌株菌体都已被
染上紫色，因此筛选得到的 Ｄ８菌株是革兰氏阴
性菌。
生理生化鉴定：通过对菌种 Ｄ８的生理生化鉴
定该菌为产酸克雷伯菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ），其中 ＩＤ
为９５７％，Ｔ值为０１７，鉴定结果如表１所示。
表１ 菌株Ｄ８的生理生化鉴定
Ｔａｂｌｅ１ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌａｎｄｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｔｒａｉｎＤ８
生化项目 结果 生化项目 结果
脂酶 ＋ 鸟氨酸脱氢酶 －
β Ｎ 乙酰葡萄糖胺 ＋ 肌醇 －
Ｄ 麦芽糖 ＋ Ｄ 甘露醇 ＋
Ｄ 葡萄糖 ＋ 酚红 －
蔗糖 ＋ ５酮基葡糖酸盐 －
Ｄ 半乳糖酸盐同化 ＋ Ｌ阿拉伯醇 ＋
尿素酶 ＋ 赖氨酸脱羧酶 ＋
精氨酸双水解酶 － β葡萄糖苷酶 ＋
肌醇 ＋ 丙二酸盐 ＋
α 麦芽糖 － Ｄ 山梨醇 ＋
Ｄ 纤维二糖 ＋ β葡萄糖醛酸酶 －
β半乳糖苷酶 ＋ 侧金盏花醇 ＋
Ｌ天冬氨酸芳胺酶 ＋ Ｌ鼠李糖 ＋
Ｄ 海藻糖 ＋ α 半乳酸苷酶 ＋
α 葡萄糖苷酶 ＋ Ｄ 阿拉伯醇 ＋
Ｌ阿拉伯糖 ＋ 古老糖 ＋
注：＋表示阳性，－表示阴性。
由于生理生化项目鉴定并不能最终确定菌株
的种属，在今后的实验中，还需对此菌株进行 １６Ｓ
ｒＲＮＡ的分子鉴定。
２３ Ｃ源的优化
Ｃ源的优化结果如图 ３所示。从图 ３可以看
出：以淀粉为 Ｃ源时，菌体的生长情况较差，而其他
的Ｃ源，菌体的生长情况均较好。这说明 Ｄ８菌株
利用多糖为Ｃ源的效果较差，而对于单糖或双糖的
利用较好。以果糖为 Ｃ源时，Ｇ３ＤＨ酶活力和比酶
活达到最大，以葡萄糖、半乳糖、麦芽糖和乳糖为 Ｃ
源时，Ｇ３ＤＨ的酶活力和比酶活均较高，而以蔗糖和
甘露糖为Ｃ源时，Ｇ３ＤＨ酶比活力较小。考虑到果
糖的价格较高，选择乳糖为菌株产 Ｇ３ＤＨ的培养
Ｃ源。
２．４ Ｎ源的优化
Ｎ源的优化结果如图４所示。由图４可知：对
于Ｄ８菌株，以酵母膏为Ｎ源时，菌体的生长情况非
常好，而以尿素为 Ｎ源时，微生物几乎不生长。此
３４ 第１期 张建芬等：葡萄糖３脱氢酶产生菌的筛选和产酶培养
１—葡萄糖；２—半乳糖；３—淀粉；４—甘露糖；
５—蔗糖；６—果糖；７—麦芽糖；８—乳糖
图３ Ｃ源对菌株酶活力的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｃａｒｂｏｎｓｏｕｒｃｅｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
外，以有机Ｎ源培养时，微生物的生长情况要明显
好于以无机 Ｎ培养的效果。以（ＮＨ４）２ＳＯ４为 Ｎ源
时，Ｇ３ＤＨ的酶比活力达到最高，其次为酵母膏，而
以尿素、ＮＨ４Ｃｌ为Ｎ源时，Ｇ３ＤＨ的酶活力和比酶活
均很低。综合考虑菌体的生长和 Ｇ３ＤＨ的酶活力，
在以后的实验中，以酵母膏为 Ｎ源进行菌株的产酶
培养。
１—酵母膏；２—酵母粉；３—牛肉膏；４—蛋白胨；
５—胰蛋白胨；６—尿素；７—草酸；８— ＮＨ４Ｃｌ；
９— （ＮＨ４）２ＳＯ４；１０—ＮＨ４Ｈ２ＰＯ４
图４ Ｎ源对菌株酶活力的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
２．５ 初始ｐＨ的确定
选择最佳Ｃ源为乳糖，最佳Ｎ源为酵母膏来重
新配制培养基，分别调节 ｐＨ为５、６、７、８、９，培养结
果见图５。从图５可以看出：在初始ｐＨ为５～７时，
菌体生长情况均较好，而当培养基初始 ｐＨ＞７时，
微生物的生长受到限制。当培养基的初始 ｐＨ为７
时，Ｄ８菌株Ｇ３ＤＨ的酶比活力达到最高。
２．６ 温度的确定
将Ｄ８菌株分别于２７、３０、３３、３６℃的摇床下培
养，转速为１５０ｒ／ｍｉｎ，培养结果见图６。从图６可以
图５ 初始ｐＨ对菌株酶活力的影响
Ｆｉｇ．５ ＥｆｅｃｔｓｏｆｍｅｄｉｕｍｏｒｉｇｉｎａｌｐＨｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
看出：在２７～３６℃时，温度对于菌体的生长影响不
大。当培养温度为３３℃时，Ｄ８菌株 Ｇ３ＤＨ的酶活
达到最高。
图６ 温度对菌株酶活力的影响
Ｆｉｇ．６ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｅｒａｔｕｒｅｏｎｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙ
３ 结 论
１）利用建立的 Ｇ３ＤＨ高通量筛选模型从不同
的土壤中筛选得到１株具有Ｇ３ＤＨ产生能力的菌株
Ｄ８。该菌株虽然具有Ｇ３ＤＨ产生能力，但是酶活力
不高，离工业化大规模生产还有一定的距离。由于
时间关系，本项目只能止步于此，在今后的实验中，
将继续扩大菌种筛选范围，希望能得到高活力的菌
株。此外，也可以利用菌种诱变处理和基因工程手
段提高已有菌株的酶活力，以期为３ 酮糖的工业化
生产，Ｇ３ＤＨ的实际应用打下坚实的基础。
２）对筛选得到的菌株 Ｄ８进行菌种鉴定，鉴定
为产酸克雷伯菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌａｏｘｙｔｏｃａ），为首次发现该
菌株能生产Ｇ３ＤＨ酶。由于生理生化项目鉴定并不
能最终确定菌株的种属，在今后的实验中，还需对
此菌株进行１６ＳｒＲＮＡ的分子鉴定。
３）对本实验筛选到的菌株进行产酶培养条件
优化，在单因素实验中对培养基的Ｃ、Ｎ源，ｐＨ和培
４４ 生 物 加 工 过 程 第９卷
养温度进行研究，初步确定当 Ｃ源为乳糖，Ｎ源为
酵母膏，２５０ｍＬ摇瓶装液量为５０ｍＬ时，培养基的
初始ｐＨ为７、３３℃培养时，Ｇ３ＤＨ酶活力最高，达到
１４５Ｕ。
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ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００６，７１：
櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒櫒
６３８６４５．
国外动态
酵母细胞“生物电路”研制成功
瑞典和西班牙科学家使用转基因酵母细胞制造出了能够互相交流的“生物电路”，未来，科学家有望使
用人体细胞构建出更复杂的系统，用以检测人体健康状况。作为欧盟“分子计算机”项目的一部分，瑞典哥
德堡大学和西班牙巴塞罗那庞培法布拉大学的科学家在哥德堡大学施特芬·霍曼教授的领导下，进行了该
项研究。该研究团队使用酵母细胞制造出了合成电路，细胞之间可通过基因调控进行连接。他们对这些酵
母细胞进行了基因修饰，使它们能够基于设定的标准来感应周遭环境，并通过分泌出的分子向其他酵母细
胞发送信号。因此，这些不同的细胞能像乐高玩具的积木块一样连接在一起，产生更复杂的电路。与使用
一种转基因酵母细胞制成的结构相比，这种由不同转基因酵母细胞组成的结构能完成更复杂的“电子功
能”。
（文伟河）
５４ 第１期 张建芬等：葡萄糖３脱氢酶产生菌的筛选和产酶培养