全 文 ：第 ! 卷第 # 期
#$%% 年 & 月
生"物"加"工"过"程
9=QCJ(JTDIOCBEDN\QD)ODHJ((@CMQCJJOQCM
2DE*! -D*#
B`O*#$%%
KDQ"%$*&!7!:e*Q((C*%78# 6&783*#$%%*$#*$%#
收稿日期"#$%$ 6$3 6#
基金项目"上海市自然科学基金资助项目#%%Vb%0#00$$$(上海高校选拔培养优秀青年教师科研专项基金资助项目#4EM$3$&$$
作者简介"曹"慧#%!87%$&女&江苏盐城人&博士&讲师&研究方向"功能性配料及添加剂&@FPBQE"HBD=IQBCfXB=DD*HDP*HC
!
型胶原 硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建
曹"慧%&许时婴#
#%j上海理工大学 医疗器械与食品学院&上海 #$$$!&(#j江南大学 食品学院&无锡 #%0%##$
摘"要"研究经乙基 #& 二甲基氨基丙基$碳化二亚胺盐酸盐#@^ 9$处理的
!
型胶原 硫酸软骨素支架材料的性
能特点&并在体外构建组织工程软骨 从鸡软骨中提取
!
型胶原&以不同浓度的 @^ 9为交联剂通过冷冻干燥的方
法制备
!
型胶原与硫酸软骨素复合支架并测定其理化性质 将体外培养的新生兔关节软骨细胞接种在
!
型胶原
与硫酸软骨素复合支架上&观察软骨细胞在支架上的生长形态并检测支架上软骨细胞分泌的糖胺聚糖含量及
!
型
胶原含量 结果表明"采用 @^ 9与硫酸软骨素交联增加了支架的稳定性&最适的交联剂质量浓度为 8 PM:PU 软
骨细胞在复合支架上增殖分化良好&并保持软骨细胞特异分化的表型&分泌
!
型胶原与蛋白多糖#WYW$ 培养
%0 K后已有软骨样组织形成
关键词"
!
型胶原 硫酸软骨素支架(@^ 9交联(软骨细胞(组织工程
中图分类号"b&%3*$3""""文献标志码"Y""""文章编号"%78# 6&783##$%%$$# 6$$3 6$7
X409545E.2/27EM90
!
:265;0/F,!1:57726H15/H5996.:5E.2/
./E.11300/;./004./; :54E.65;0
9Y5.IQ
%
&1S4=QXQCM
#
#%j4H=DDEDN` JKQHBE,C(AOIPJCABCK [DDK @CMQCJJOQCM&SCQZJO(QAXDN4=BCM=BQNDO4HQJCHJBCK dJH=CDEDMX&4=BCM=BQ#$$$!&&9=QCB(
#j4H=DDEDN[DDK 4HQJCHJBCK dJH=CDEDMX&TQBCMCBC SCQZJO(QAX&RIGQ#%0%##&9=QCB$
*K1E45:E"d=J)OJ)BOBAQDC BCK H=BOBHAJOBAQDC DNAX)J,HDEBMJCFH=DCKODQAQC (IENBAJ#94$ (HBNDEK(BCK
A=JB))EQHBAQDC QC AQ((IJJCMQCJJOQCMHBOAQEBMJLJOJ(AIKQJK*>DODI(AX)J,HDEBMJCF94 (HBNDEK(LJOJ)OJF
)BOJK I(QCMZBOQB;EJHDCHJCAOBAQDC DN%FJA=XEF& #&FKQPJA=XEBPQCD)OD)XE$ HBO;DKQPQKJ# @^ 9$*d=J
)=X(QHDFH=JPQHBE)OD)JOAQJ(DNA=JHDEBMJC (HBNDEK(LJOJJZBEIBAJK*d=JC&Q(DEBAJK H=DCKODHXAJ(NODPA=J
OB;;QABOAQHIEBOHBOAQEBMJLJOJHIEAIOJK QC )DODI(AX)J,HDEBMJC (HBNDEK(QC A=J)OJ(JCHJDNHDZBEJCAEX
BABH=JK 94 I) AD%0 K*9JE)ODEQNJOBAQDC&A=JADABEBPDICADN)ODAJDMEXHBC(BCK AX)J,HDEBMJC OJABQCJK
QC A=J(HBNDEK BCK H=DCKODHXAJ(PDO)=DEDMXLJOJJZBEIBAJK*bJ(IEA((IMMJ(AJK A=BA@^ 9FHOD((EQCcQCMLB(
)ODZJK AD;JPJH=BCQHBEX(AB;EJNDO(HBNDEK(LQA= QCHOJB(QCM@^ 9HDCHJCAOBAQDC*5C HDCHJCAOBAQDC DN
@^ 9=QM=JOA=BC 8 PM:PU& A=JHOD((EQCcQCM(AB;QEQAXLB(D;ABQCJK*9JE)ODEQNJOBAQDC BCK A=JADABEBPDICA
DN)ODAJDMEXHBC(BCK AX)J,HDEBMJC OJABQCJK QC A=J(HBNDEK(LJOJ=QM=JOQC AX)J,HDEBMJCF94
(HBNDEK(*4HBCCQCMJEJHAODC PQHOD(HD)XOJZJBEJK BH=DCKODHXAJKQ(AOQ;IAJK A=ODIM=DIAA=J)DODI((IONBHJ
DN(HBNDEK(LQA= JEQ)(J*
L0M I24H1"AX)J,HDEBMJCF94 (HBNDEK(@^ 9HOD((EQCcQCM(H=DCKODHXAJ((AQ((IJJCMQCJJOQCM
""关节软骨是无血管)单一的结缔组织&损伤后
自我修复能力很弱 制备生物相容性良好)性质稳
定的生物支架并在其上培养软骨细胞&从而构建成
可移植的细胞生物材料复合物为软骨修复提供了
新的途径*%+ 近年来&许多不同的支架材料已经被
研究&包括聚乳酸)聚乙醇酸)壳聚糖等*#+
!
型胶
原与硫酸软骨素是关节软骨的主要成分&细胞亲和
性强&能为软骨细胞生长增殖)分化及功能发挥提
供近似体内组织发生发育的细胞外基质支架条件&
具有人工合成支架材料不可比拟的优点 由于
!
型胶原与硫酸软骨素在体内很容易降解&不宜直接
使用&故需采用一些预处理方法来解决这些问
题*&+ 预处理的目的就是在移植生物材料之前&降
低其抗原性)提高其抗酶降解能力&较长时间地保
持其良好的力学性能和组织结构 戊二醛已广泛
用于生物材料的预处理&但处理后的材料存在细胞
毒性大)质地僵硬及远期变性等缺点&使其应用受
到限制 乙基 #& 二甲基氨基丙基$碳化二亚胺盐
酸盐#@^ 9$的出现可望解决这个问题*0 6+ 本研究
采用鸡关节软骨为原料提取
!
型胶原&以 @^ 9为交
联剂增加
!
型胶原与硫酸软骨素复合支架的稳定
性(在体外将扩增的胎兔关节软骨细胞接种在
!
型
胶原与硫酸软骨素复合支架上&检测其组织学)形
态学及生物化学指标
C?材料与方法
CNC?材料与仪器
从鸡关节软骨表面剔除鸡皮)残肉)鸡腱及其
他非软骨成分&脱脂&冷冻粉碎 鸡关节软骨中高
纯度的
!
型胶原的制备按文献*7+的方法进行
@^ 9&上海延长生物公司(%&! 二甲基亚甲蓝)
木瓜蛋白酶)
!
型胶原酶)胰蛋白酶&,CZQAODMJC 公
司(^` @` :[%# 混合培养基&加拿大 WQ;HD公司(其
余化学试剂 #分析纯$&国药集团化学试剂有限
公司
95
#
培养箱&德国.JOJI(公司(9U#$ \型冷冻
离心机&上海安亭科学仪器厂(倒置显微镜及照相
系统&日本 5EXP)I(公司(+SY-dY #$$ 扫描电镜
#4@` $&荷兰菲利普公司
CN@?
!
型胶原 硫酸软骨素复合支架的制备及性能
测定
%j#j%"
!
型胶原 硫酸软骨素复合支架的制备
将 #$ PM纯化后的
!
型胶原溶解在 $ PU)
$j PDE:U的醋酸#.YH$溶液中&& $$$ O:PQC)0 k
离心 % PQC&除去气泡&离心后的胶原上清溶液置于
7$ PP的培养皿中&在60 k下冷冻干燥 #0 =后形
成大约# PP厚的胶原膜
取 # PM的胶原膜在体积分数 0$g的乙醇溶
液中平衡 &$ PQC#含有 $ PPDE:U# 吗啉乙磺酸&
).j$$&接着在 %$ PU0$g的乙醇溶液中进行交
联反应#其中 @^ 9的质量浓度分别为 %)&))8)%$)
% PM:PU&@^ 9与G 羟基琥珀酰亚胺#-.4$的质
量比为 0i%&硫酸软骨素质量分数为 #g$&反应 0 =
后用 $j% PDE:U的-B
#
.>5
0
溶液清洗 % =&再用去离
子水反复清洗 & 次&冷冻干燥后备用*8+
%j#j#"
!
型胶原 硫酸软骨素复合支架性能的测定
%$变性温度"采用 >JOcQCF@EPJO^ 49 8 差示
扫描量热仪测定支架的变性温度 取 0 PM支架在
去离子水中平衡 #0 =&测定前用滤纸除去过量的水
测定温度范围为 #$ h!$ k&升温速率为 k:PQC
#$游离氨基的含量"采用 #&0&7 三硝基苯
% 磺酸法测定游离氨基的含量&结果表达为每
% $$$个氨基酸残基中游离氨基的含量*3+
&$被交联的硫酸软骨素的质量分数"支架用 7
PDE:U.9E水解后&采用对 # 甲氨基苯甲醛法测定
硫酸软骨素的含量 结果表达为每克支架上硫酸
软骨素的质量分数*!+
0$
!
型胶原酶对支架的降解"取大约 PM支
架置于含有 #$$ S
!
型胶原酶 #@9&j0*#0*&&
,CZQAODMJC$ 的 $j% PDE:UdOQ(F.9E缓冲液中反应
0j =#&8 k&).8j0$ 反应完毕后添加 $j# PU)
$j# PDE:U@^ dY&%$ $$$ O:PQC)0 k离心 % PQC&
所得沉淀进行冷冻干燥 支架的降解率表达为冷
冻干燥后的支架质量占起始质量的百分比
$形态学观察"采用+SY-dY #$$ 扫描电镜
观察支架的孔径结构
CNO?体外组织工程软骨的构建
%j&*%"软骨细胞的分离
采用手术刀于新生兔关节软骨表面削取软骨&
并切细至 # PPp# PP颗粒&磷酸盐缓冲液#>\4$
清洗 # 次后加入质量分数为 $j#g的胰蛋白酶&放
入&8 k)g95
#
细胞培养箱中培养 #$ PQC&再用
>\4洗 & 次&加入质量分数为 $j$#g
!
型胶原酶消
化0 =&吸取细胞悬液 % #$$ O:PQC 离心 PQC&加入
%g血清培养基&调整细胞浓度为 %$个:PU&加入
培养瓶&放入 &8 k)g95
#
细胞培养箱中培养
!"第 # 期 曹"慧等"
!
型胶原 硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建
%j&*#"软骨细胞在支架上的接种
细胞培养至第二代&用质量分数为 $j#g的胰
酶消化&离心&细胞计数&加入 %g血清培养基&调
整细胞浓度为 %$8个:PU 将支架剪成 PPp PP
大小&环氧乙烷灭菌&使用前用培养基润洗 每个
支架滴加 %$8个:PU细胞悬液 $
"
U&放入 &8 k)
g95
#
细胞培养箱 # =&将支架用无菌镊子翻转&每
个支架再次滴加 %$8个:PU细胞悬液 $
"
U 最后
加入 %g血清培养基&放入 &8 k)g95
#
细胞培养
箱 8# =后第一次换液&之后 03 =换液 % 次
%j&*&"软骨细胞培养指标的测定
%$ -^Y及 WYW的测定"将培养到第 %)8)%0
天的细胞支架取出测定 -^Y及WYW的含量 -^Y
的测定采用.DJH=(A& 荧光分光光度法进行&激
发波长为 &7 CP&发射波长为 03 CP&小牛胸腺
-^Y为标准品 WYW的测定采用 %&! 二甲基亚甲
蓝法进行&硫酸软骨素为标准品*%$+
#$
!
型胶原的测定"将培养到第 %0 天的细胞
支架置于 %$$
"
U0 PDE:U盐酸胍溶液中 3 =&
%$ $$$ O:PQC离心 %$ PQC&在沉淀中加入 %$$
"
U质
量分数为 $jg的胃蛋白酶溶液&反应 7 = 后&
%$ $$$ O:PQC 离心 %$ PQC&取上清液立即进行反相
高效液相色谱#b>F.>U9$的测定 条件"色谱柱&
V5b\Y1&$$ 4\#0j7 PPp#$ PP$(流动相&Y为
g乙腈)$j$gd[Y&\为 3$g乙腈&采用线性梯度
洗脱(检测波长 ##$ CP(流速 % PU:PQC
&$组织切片观察"将培养到第 8 天和第 %0 天
的细胞支架用 #g的戊二醛固定 #0 =&石蜡包埋&切
片##
"
P$&再进行苏木素 伊红染色#.@$染色和阿
辛蓝染色
0$扫描电镜观察"采用 +SY-dY #$$ 扫描
电镜观察培养到第 %0 天的细胞在支架上的形态
及分布
@?结果与讨论
@NC?
!
型胶原的总氨基酸分析
对鸡软骨中提取的
!
型胶原的总氨基酸进行
分析&结果如表 % 所示 由表 % 可见"甘氨酸约占总
氨基酸的 %:&&脯氨酸和羟脯氨酸约占 %:0&此外还
含有较多的丙氨酸&酪氨酸)组氨酸和蛋氨酸含量
低&缺乏色氨酸&此为典型的动物胶原的氨基酸组
成*%%+ 本文所提取的
!
型胶原的氨基酸组成符合
典型的动物胶原特征*%#+
表 C?
!
型胶原的氨基酸组成
D5K60C?*J./2 5:.H:2J921.E.2/27EM90
!
:265;0/
氨基酸 数量 氨基酸 数量
天冬氨酸 08 胱氨酸 %8
谷氨酸 !0 缬氨酸 ##
丝氨酸 # 蛋氨酸 #
组氨酸 0 苯丙氨酸 %
甘氨酸 &%& 异亮氨酸 %&
苏氨酸 &$ 亮氨酸 &%
丙氨酸 %$# 赖氨酸 %
精氨酸 & 脯氨酸 !0
酪氨酸 羟脯氨酸 %%3
"注"氨基酸的数量为每 % $$$ 个氨基酸残基中游离氨基酸的个数
@N@?
!
型胶原支架的性质
本文采用不同浓度的 @^ 9对
!
型胶原及硫酸
软骨素进行交联&并对交联后的支架进行理化性质
的测定&结果如表 # 所示 由表 # 可见"随着 @^ 9
浓度的增加&复合支架的热稳定性增加 当 @^ 9的
质量浓度从 % PM:PU增加到 % PM:PU时&变性温
度从平均 00j# k增加到 87j k @^ 9交联增加
了复合支架中被交联的硫酸软骨素含量&降低了支
架游离氨基的浓度及膨胀率 当 @^ 9质量浓度为
8 PM:PU时&硫酸软骨素的交联量达到较高值
%#3j& PM 支架的游离氨基的数量从最初的 & 降
低到 %3 @^ 9交联也增加了支架对
!
型胶原酶的
抗性&随着 @^ 9浓度的增加&
!
型胶原支架显著增
加了对
!
型胶原酶的抗性&当 @^ 9质量浓度为
% PM:PU时&支架完全被降解&而当 @^ 9质量浓度
增加到 %$ PM:PU时&支架在实验条件下完全不被
降解 因此&考虑到交联后支架的稳定性及生产成
本&比较合适的 @^ 9添加量为 8 PM:PU
@^ 9增加了
!
型胶原 硫酸软骨素支架的稳
定性&可能是由于交联剂的增加使分子间的交联
增加&大分子链的运动被阻碍&从而使酶分子的作
用降低 此外&@^ 9交联也可能增加聚合物的结
晶度和取向度&从而增加了 & 股螺旋的稳定性*%&+
@^ 9还能够使胶原的氨基与硫酸软骨素的羧基发
生交联&因此&@^ 9交联在增加支架上被交联的硫
酸软骨素的同时也降低了胶原支架上游离氨基的
含量
$7 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
表 @?不同#a,浓度下胶原支架的生化特征
D5K60@?X-M1.:2F:-0J.:56:-545:E04.1E.:127:265;0/1:5726H1I.E-H.7040/E#a,:2/:0/E45E.2/
"
#@^ 9$:
#PM!PU
6%
$
变性温度:k 游离氨基酸数量
硫酸软骨素
交联量:#PM!M6%$
胶原酶抗性:g 膨胀率:g
% 00j# l$j0 & l& $j% l&j# $ j8 l$j!
& 03j$ l$j& #0 l# 7!j0 lj0 j& l#j% j l$j&
7j# l#j% #$ l# !8j0 l&j8 0$j0 lj& &j3 l$j&
8 77j$ l$j# %3 l% %#3j& l%j0 !#j% l0j7 &j0 l$j#
%$ 8$j# l%j% %8 l& %#8j l&j3 %$$ &j l%j%
% 87j l$j! %7 l# %&3j l7j0 %$$ #j! l$j#
""
!
型胶原经过交联后采用扫描电镜对支架结
构进行观察&结果如图 % 所示 由图 % 可知"与未经
交联的
!
型胶原相比#图 %#B$$&经过交联的
!
型
胶原 硫酸软骨素支架呈现比较均匀的多孔三维网
状结构&孔径达 3$ h#$$
"
P#图 %#;$$ 胶原被制
成多孔海绵状的三维结构支架材料&使得细胞能进
行有效的气体交换)营养吸收)废物排出&因而更有
利于细胞基质的分泌
图 C?试样的扫描电镜照片
U.;=C?!#A 190:E43J2715J9601
@NO?软骨细胞在支架上的培养
#j&*%"生化功能检测
采用三维立体培养&将软骨细胞接种于
!
型胶
原与硫酸软骨素的复合支架上&单独的
!
型胶原支
架作为对比 结果表明细胞在支架上增殖)分化活
跃&并分泌较多WYW 图 # 显示了随培养时间的变
化
!
型胶原 硫酸软骨素支架上 -^Y和 WYW含量
的变化 由图 # 可知"随着培养时间的延长&
!
型胶
原与硫酸软骨素的复合支架上细胞的 -^Y含量从
第 % 天的 7j
"
M增加到第 %0 天的 %j0
"
M&WYW的
含量从第 % 天的 %#j8
"
M增加到第 %0 天的 3j3
"
M -^Y及WYW含量显示软骨细胞在复合支架材
料上逐渐扩增&培养 %0 K 后达到高峰&增殖明显高
于单纯的
!
型胶原支架
软骨细胞在
!
型胶原 硫酸软骨素支架上培养到第
8天和第 %0 天后按常规方法切片并进行.@染色和阿
辛蓝染色&结果分别见图&)图0 由图&可知".@染色
显示了随培养时间的延长&支架上细胞密度逐渐增大&
图 @?
!
型胶原 硫酸软骨素支架上a$*和%*%含量
U.;=@?a$*5/H%*%:2/E0/E./E-0EM90
!
:265;0/F,!1:5726H1
培养到第 %0 天后软骨细胞在支架上的密度明显高
%7"第 # 期 曹"慧等"
!
型胶原 硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建
于第 8 天&且在支架上分布均匀&并在支架的表面形
成软骨样的结构&这与 -^Y的测定结果是一致的
由图 0 可见"培养 %0 K的软骨细胞在支架上分泌大
量WYW&其染色面积显著高于培养 8 K的细胞支架
图 O?细胞种植支架的"#染色
U.;=O?"0J5E2GM6./5/H021./1E5././; 27:-2/H42:ME0127:06F100H0H1:5726H1
图 P?细胞种植支架的阿辛蓝染色
U.;=P?*6:.5/86301E5././; 27:-2/H42:ME0127:06F100H0H1:5726H1
#j&j#"复合支架上软骨细胞
!
型胶原的分泌
软骨组织工程研究中一个重要的问题是细胞
单层培养时出现反分化现象&随着传代次数增加或
培养时间延长软骨细胞由圆形变扁&软骨的主要成
分
!
)
%
型胶原合成减少&而
&
型)
型胶原增加&
逐渐产生金属蛋白酶抑制因子)细胞自溶素 \等抑
制软骨细胞生长)分泌胶原和氨基多糖的物质*%0+
笔者采用三维立体培养&将软骨细胞接种于
!
型胶
原和硫酸软骨素支架上&并采用b>F.>U9鉴定了软
骨细胞在支架上分泌的胶原类型#图 $ 由图 可
见"培养到第 %0 天的软骨细胞支架经过处理后在
%$j PQC处出现与标样相同的
!
型胶原峰&且
!
型
胶原 硫酸软骨素的
!
型胶原峰面积明显高于
!
型
胶原支架&这表明在培养的时间点内&大多数细胞
在复合支架材料中保持软骨分化表型
#j&j&"复合支架上软骨细胞扫描电镜观察
细胞在支架上培养到第 %0 天后进行扫描电镜观
察&结果如图 7所示 由图 7可见" 在支架表面有大量
图 Q?细胞分泌
!
型胶原的"XS,图谱
U.;=Q? X`F"XS,190:E43J27EM90)):265;0/
./E-01:5726H
#7 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
软骨细胞分布&软骨细胞呈球形生长&仍维持天然
软骨中的椭圆形态&软骨细胞在增殖的同时分泌大
量细胞外基质&细胞自身逐渐被这些基质包绕 因
此可认为
!
型胶原和硫酸软骨素构成的支架能稳
定地维持软骨细胞的表型表达&适合作为软骨组织
工程研究的细胞载体材料
图 R?软骨细胞在
!
型胶原 硫酸软骨
素支架上扫描电镜显微照片
U.;=R?!#A 190:E43J27:-2/H42:ME01./E-0
:06F100H0HEM90)):265;0/F:-2/H42.E./
13675E01:5726H1
O?结论
@^ 9处理增加了
!
型胶原 硫酸软骨素支架的稳
定性&最适的交联剂质量浓度为 8 PM:PU
!
型胶原
与硫酸软骨素复合后&细胞亲和性大大提高&软骨细
胞能很好地在其上黏附)生长和增殖&并保持软骨细
胞特异分化的表型&分泌
!
型胶原与蛋白多糖#WYW$
培养 %0 K后已有软骨样组织形成 本实验的结果表
明
!
型胶原与硫酸软骨素复合的支架材料在软骨组织
工程材料领域有很大的应用前景
参考文献"
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&7"第 # 期 曹"慧等"
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型胶原 硫酸软骨素支架的制备及组织工程软骨的构建