全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ０１０
收稿日期：２０１３－０３－１８
基金项目：国家重点基础研究发展计划（９７３计划）（２００９ＣＢ７２４７０１）；国家自然科学基金（２１０７６１０５）；江苏省“青蓝工程”资助项目及江苏省优
势学科；高等学校博士学科点专项基金（２００９３２２１１１０００５）
作者简介：梁丽亚（１９８７—），女，河南商丘人，博士研究生，研究方向：发酵工程及代谢工程；姜 　 岷（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｂｉｏｅｎｇｉｎｅ＠
ｎｊｔｅｃｈ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸
羧化酶对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１产丁二酸的影响
梁丽亚，刘嵘明，苟冬梅，陈　 旭，马江锋，陈可泉，姜　 岷，韦　 萍
（南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 ２１１８００）
摘　 要：构建了共表达烟酸转磷酸核糖激酶（ＮＡＰＲＴａｓｅ）和丙酮酸羧化酶（ＰＹＣ）的重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ，
并考察了重组菌 Ｅ． ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ 生产丁二酸的能力。 结果表明：重组菌 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ
ｐｎｃＢ ｐｙｃ的 ＮＡＰＲＴａｓｅ 和 ＰＹＣ 的比酶活达到最高，分别为 ２０􀆰 ７５ 和 １􀆰 ０４ Ｕ ／ ｍｇ，同时，辅酶 ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋及 ＮＡＤ
（Ｈ）总量达到最高。 厌氧摇瓶发酵结果：４８ ｈ能够消耗 １７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖生成 １４􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ的丁二酸，而丙酮酸的产
量大幅度降低，仅为 ０􀆰 １１ ｇ ／ Ｌ。 本研究为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生产丁二酸提供了一定的基础。
关键词：厌氧发酵；大肠杆菌；烟酸转磷酸核糖激酶；丙酮酸羧化酶；丁二酸
中图分类号：ＴＱ９２１􀆰 ４　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００４９－０６
Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１
ＬＩＡＮＧ Ｌｉｙａ，ＬＩＵ Ｒｏｎｇｍｉｎｇ，ＧＯＵ Ｄｏｎｇｍｅｉ，ＣＨＥＮ Ｘｕ，
ＭＡ Ｊｉａｎｇｆｅｎｇ，ＣＨＥＮ Ｋｅｑｕａｎ，ＪＩＡＮＧ Ｍｉｎ，ＷＥＩ Ｐｉｎｇ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１１８００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ， ｃｏ⁃ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙ
ｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ （ ＮＡＰＲＴａｓｅ） ａｎｄ ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ （ ＰＹＣ）， ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ
ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＮＡＰＲＴａｓｅ ａｎｄ ＰＹＣ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ， ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ２０􀆰 ７５ ａｎｄ １􀆰 ０４ Ｕ ／ ｍｇ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ， ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＡＤＨ，
ＮＡＤ＋， ａｎｄ ＮＡＤ（Ｈ） ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅａｌｅｄ ｂｏｔｔｌｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
１７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ ｇｌｕｃｏｓｅ ｗａｓ ｃｏｎｓｕｍｅｄ ａｎｄ １４􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｔ ４８ ｈ ａｎｄ ｔｈｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｙｒｕｖｉｃ
ａｃｉｄ ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ０􀆰 １１ ｇ ／ Ｌ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ｔｈｅ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅ．ｃｏｌｉ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ； Ｅ．ｃｏｌｉ； ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ； ｐｙｒｕｖａｔｅ
ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ
　 　 丁二酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ），又称琥珀酸，是一种常见
的天然有机酸，广泛存在于人体、动植物和微生物中。
作为一种优秀的 Ｃ４平台化合物，丁二酸可被广泛应
用于制备药物、精细化工产品以及生物可降解聚合物
等。 传统的化学法合成丁二酸以不可再生资源石油
为原料，成本高，环境污染严重。 生物转化法生产丁
二酸具有能利用可再生资源和固定温室气体 ＣＯ２等
优点，越来越引起人们的关注［１－３］。
大肠杆菌 ＮＺＮ１１１是失活了乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）
及丙酮酸甲酸裂解酶（ＰＦＬ）的丁二酸生产菌株。 但
由于 ＮＡＤＨ依赖的乳酸脱氢酶 （ＬＤＨ） 和丙酮酸甲
酸裂解酶（ＰＦＬ）的失活，限制了葡萄糖代谢过程中
ＮＡＤＨ再生为 ＮＡＤ＋的过程，造成 ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋比例
不平衡，从而使该菌株无法在厌氧条件下进行细胞
生长及代谢葡萄糖生产丁二酸［４－５］。 能过量表达辅
酶 ＮＡＤ（Ｈ）合成途径中关键酶烟酸转磷酸核糖激
酶（ＮＡＰＲＴａｓｅ）的重组菌Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ
ｐｎｃＢ，可提高 ＮＡＤ＋的生成，恢复平衡菌株 ＮＡＤＨ ／
ＮＡＤ＋比例，虽能够在厌氧条件下利用葡萄糖进行细
胞生长，提高关键酶酶活和丁二酸的产量，但是生
成了大量的丙酮酸［６］。 丙酮酸羧化酶（ＰＹＣ）可以
催化丙酮酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）转化为草酰乙酸（ＯＡＡ），可
减少丙酮酸的生成。 图 １是大肠杆菌的厌氧混合酸
发酵代谢途径［７］。
图 １　 大肠杆菌厌氧混合酸发酵代谢途径［７］
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｍｉｘｅｄ ａｃｉｄ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［７］
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ能够恢复厌
氧条件下的细胞生长及代谢葡萄糖的能力，从而提
高丁二酸的生成并大幅减少丙酮酸的积累。 本研
究构建共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化
酶的重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ，并考察重组菌
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ生产丁二酸的能
力，以期为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生
产丁二酸提供一定的基础。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌种
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ （ ｌｄｈＡ：：Ｋａｎ Ｐｆｌ：：ｃａｍ） 是 Ｃｌａｒｋ
教授（南伊利诺伊卡本代尔大学）赠送，作为宿主菌
和对照菌；质粒 ｐＴｒｃ９９ａ是由邵蔚蓝教授（南京师范
大学）赠送；Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２ 由笔者所在实验室保藏；
Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ为笔者所在实验室自
主构建［６］。
１􀆰 ２　 主要试剂
氯霉素、氨苄青霉素和硫酸卡那霉素，购自上
海生工生物工程有限公司；基因组提取试剂盒购自
北京天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶 ＤＮＡ回收
试剂盒购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；质粒
小量快速提取试剂盒购自北京拜尔迪代理 Ｂｉｏｍｉｇａ
公司； 限制性内切酶、 Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶和
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ快速连接酶均购自宝生物工程（大连）有
限公司；酵母提取物和胰蛋白胨购自 Ｏｘｏｉｄ 公司；
ＣＯ２气体购自南京三乐集团有限公司气体供应中
心；其他试剂均为国产分析纯。
１􀆰 ３　 方法
１􀆰 ３􀆰 １　 ｐｙｃ基因和 ｐｎｃＢ基因的扩增
引物 设 计： 参 照 ｐｙｃ 基 因 序 列 （来 源 于
Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ． ｃｒｅｍｏｒｉｓ ＬＡＢＣＣ ＩＭＡＵ６００２４
（ＸＺ６３０７）基因组，购买于中国微生物菌种网）设计，
在上下游引物的 ５′端分别加入 Ｎｃｏ Ｉ和 Ｐｓｔ Ｉ限制性
酶切位点（下划线标示）；参照 ｐｎｃＢ 基因序列 （来源
于 Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ 基因组，ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ０００９４３５） 设
计，在上下游引物的 ５′端分别加入 Ｎｃｏ Ｉ 限制性酶切
位点（下划线标示）；引物均由金斯瑞生物科技合成，
引物序列分别为 ｐｙｃ Ｆ：ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＧＡ⁃
ＴＧＡＧＡＡＡＣＧＴＣＧＡＧＡＡＧ，ｐｙｃ Ｒ：ＡＡＡＡＣＴＧＣＡＧ⁃
ＡＧＧＴＣＡＴＣＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＧ； ｐｎｃＢ ｐｙｃ
Ｆ： ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＡＡＡＧＧＴＧＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧＴＧＡＴ⁃
ＣＧＧ；ｐｎｃＢ ｐｙｃ Ｒ： ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＣＧＧＣＴＡＣＡＧＧ⁃
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
ＣＡＣＡＡＣＧＣＴＣＡＴＡＡＴ。
ＰＣＲ 反应体系 （ ５０ μＬ）：上下游引物 （ ５０
ｐｍｏｌ ／ μＬ）各 １ μＬ；模板 ＤＮＡ（１００ ｎｇ ／ μＬ） １ μＬ；１０ｘ
ｐｙｒｏｂｅｓｔ ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ； ｄＮＴＰｓ （ １０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ） ４ μＬ；
Ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ 聚合酶 （２􀆰 ５ Ｕ ／ μＬ） ０􀆰 ５ μＬ；ｄｄＨ２Ｏ
３７􀆰 ５ μＬ。
反应条件：９４ ℃，５ ｍｉｎ；９４ ℃ ３０ ｓ，５５ ℃ ４５ ｓ，
７２ ℃ ７２ ｓ，３５个循环；７２ ℃，１０ ｍｉｎ。
１􀆰 ３􀆰 ２　 重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ的构建
ｐｙｃ基因片段进行纯化后与质粒 ｐＴｒｃ９９ａ 分别进
行 Ｎｃｏ Ｉ和 Ｐｓｔ Ｉ双酶切反应，双酶切反应后的片段在
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ快速连接酶的作用下 １６ ℃连接 ２ ｈ，构建重
组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ，然后转化于 ＮＺＮ１１１ ＣａＣｌ２ 法感
受态。 涂布于含氯霉素、氨苄青霉素和硫酸卡那霉素
平板，挑选克隆菌落，提质粒并进行 Ｐｓｔ Ｉ 单酶切鉴
定。 ｐｎｃＢ 基因片段进行纯化后与构建完成的
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ进行 Ｎｃｏ Ｉ 酶切，酶切后得到的片段在
Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ快速连接酶的作用下 １６ ℃连接 ２ ｈ，构建重
组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ，并转化入 ＮＺＮ１１１ ＣａＣｌ２
法感受态。 涂布含上述 ３种抗生素平板后挑选克隆
菌落，提质粒后进行 Ｎｃｏ Ｉ酶切鉴定。
１􀆰 ３􀆰 ３　 重组丙酮酸羧化酶的诱导表达
菌体转化：ＣａＣｌ２法［８］。
有氧诱导表达：接 １％过夜培养的 ５ ｍＬ 试管培
养液于装有 １００ ｍＬ ＬＢ 培养基的 ５００ ｍＬ 三角瓶，
３７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ培养菌体 ＯＤ６００到 ０􀆰 ７，加入异丙基
硫代 β Ｄ 半乳糖苷（ＩＰＴＧ）和烟酸 （ＮＡ）分别至
终浓度为 ０􀆰 ３和 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，于 ３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ低
温低速诱导表达 ８ ｈ。
１􀆰 ３􀆰 ４　 培养基
种子培养基（ＬＢ 培养基） （ ｇ ／ Ｌ）：酵母粉 ５，蛋
白胨 １０，ＮａＣｌ ５。 ｐＨ ７􀆰 ０，氯霉素、硫酸卡那霉素和
氨苄青霉素的终质量浓度分别为 ２５、 ３０ 和 １００
μｇ ／ ｍＬ。
发酵培养基：在上述种子培养基基础 ＭｇＣＯ３ 上
加入终质量浓度为 ２０ ｇ ／ Ｌ 葡萄糖及 １６ ｇ ／ Ｌ 碱式
ＭｇＣＯ３，加入终浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的 ＮＡ 和 ０􀆰 ３
ｍｍｏｌ ／ Ｌ的诱导剂 ＩＰＴＧ。
１􀆰 ３􀆰 ５　 培养方法
种子培养：将保存于－８０ ℃的菌种在加有上述
３种抗生素的平板上活化，挑单菌落到 １００ ｍＬ种子
培养基中，于 ３７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ培养 ６ ｈ。
发酵培养：以 １０％的接种量将种子液接入装有
３０ ｍＬ 发酵培养基的 １００ ｍＬ血清瓶中， ３０ ℃、
１７０ ｒ ／ ｍｉｎ，厌氧发酵 ４８ ｈ。
１􀆰 ４　 分析方法
１􀆰 ４􀆰 １　 发酵及代谢产物分析
用紫外分光光度计测定菌体细胞在 ６００ ｎｍ波长
下的吸光值 ＯＤ６００，代表菌体浓度，细胞干质量
（ＤＣＷ） 是由 ＤＣＷ 与 ＯＤ６００测定的标准曲线换算得
到，换算公式为 ρ（ＤＣＷ） ＝ ０􀆰 ４ＯＤ６００。 葡萄糖使用
ＳＢＡ４０Ｃ生物传感仪 （购买自山东省科学院生物研究
所） 检测，发酵液中的有机酸用高效液相色谱 ＨＰＬＣ
检测，泵型号为 Ｄｉｏｎｅｘ Ｐ６８０，紫外检测器型号为
Ｄｉｏｎｅｘ ＵＶＤ１７０Ｕ，色谱柱为 Ａｌｌｔｅｃｈ Ｐｒｅｖａｉｌ Ｃ１８ ５ μ；
流动相采用 ２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＫＨ２ＰＯ４（ｐＨ ２􀆰 ５），流速和紫
外检测波长分别为 １􀆰 ０ ｍＬ ／ ｍｉｎ和 ２１５ ｎｍ。
１􀆰 ４􀆰 ２　 酶活测定
试样处理：采取超声破碎的方法超声 ３ ｓ 停 ５ ｓ
处理 ３ ｍｉｎ，于 ４ ℃、１２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 １５ ｍｉｎ，取上
清即粗酶液，测定酶活。
总蛋白浓度测定按照 Ｂｒａｄｆｏｒｄ 法［９］，以牛血清
白蛋白（ＢＳＡ）为标准。
ＮＡＰＲＴａｓｅ 酶活测定采用文献 ［ １０］ 所述的
方法。
ＮＡＰＲＴａｓｅ酶活定义：３０ ℃和 １ ｍｉｎ 时间内催
化 １ ｍｍｏｌ的烟酸生成烟酸单核苷酸所需要的酶量，
即 １ Ｕ。 比酶活定义为每毫克蛋白含有的酶活
（Ｕ ／ ｍｇ）。
ＰＹＣ标准反应体系如下［１１］：１􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｔｒｉｓ
ＨＣｌ （ ｐＨ ８􀆰 ０ ）， ０􀆰 ５ ｍｏｌ ／ Ｌ ＮａＨＣＯ３， ０􀆰 １ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ＭｇＣｌ２，１􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 乙酰辅酶，０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ 丙酮酸，
０􀆰 １ ｍｏｌ ／ Ｌ ＡＴＰ，０􀆰 ０３９ ｇ 二硫代二硝基苯甲酸于
１􀆰 ０ ｍＬ １００％ 乙醇，柠檬酸合酶 （１ ０００ Ｕ ／ ｍＬ）。 采
用联机紫外可见分光光度计连续监测 ４１２ ｎｍ 处吸
光值的变化，根据测定的标准曲线换算成底物浓度。
酶活定义：２５ ℃和 １ ｍｉｎ 时间内催化丙酮酸生
成 １ μｍｏｌ 草酰乙酸（ＯＡＡ）所需要的酶量，即１ Ｕ。
比酶活定义为每毫克蛋白中含有的丙酮酸羧化酶
活力（Ｕ ／ ｍｇ）。
辅酶 ＮＡＤＨ 与 ＮＡＤ＋ 浓度的测定采用李建
等［１２］所述的方法 。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ的构建
质粒构建流程如图 ２ 所示。 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ 经
１５　 第 ４期 　 梁丽亚等：共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１产丁二酸的影响
ＰｓｔＩ单酶切后的条带大小应为 ８ ０３７ ｂｐ，由图 ３可以
看出与预期条带大小一致，经过测序后，目的基因
序列与公布的序列完全匹配。
图 ２　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ的构建图谱
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｙｃ
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１—质粒经 Ｐｓｔ Ｉ酶切鉴定
图 ３　 重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ单酶切鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ３　 ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｙｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｉｎｇｌｅ
ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
２􀆰 ２　 重组质粒 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ的构建
ＰＣＲ 扩增后的目的基因片段 ｐｎｃＢ 和载体
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ分别进行 Ｐｓｔ Ｉ 酶切，纯化后的酶切产
物用 ＴＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ 快速连接酶进行连接， ｐＴｒｃ９９ａ
ｐｎｃＢ ｐｙｃ构建流程如图 ４ 所示。 重组质粒经单酶
切 Ｎｃｏ Ｉ鉴定的条带大小应分别为 ８ ０３７ 和 １ ３３７
ｂｐ，由图 ５可以看出与预期条带大小一致，经过测序
后目的基因序列与公布的序列完全匹配。
图 ４　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ的构建图谱
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍａｐ ｏｆ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ
Ｍ—标准 ＤＮＡ；１、１′—质粒经 Ｎｃｏ Ｉ酶切鉴定
图 ５　 ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ酶切鉴定
Ｆｉｇ􀆰 ５　 ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ｔｈｅ
ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
２􀆰 ３　 重组菌 ＮＺＮ１１１／ ｐＴｒｃ９９ａ⁃ｐｎｃＢ⁃ｐｙｃ的诱导表达
　 　 ３７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ培养菌体到 ＯＤ６００为 ０􀆰 ７左右，
分别加入终浓度为 ０􀆰 ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的诱导剂 ＩＰＴＧ和终
浓度为 ０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ的底物烟酸，于 ３０ ℃、１７０ ｒ ／ ｍｉｎ
低温低速条件下诱导表达 ８ ｈ，对对照菌株和
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ进行酶活测定，结果如
２５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
表 １所示。
由表 １可以看出：共表达ＮＡＰＲＴａｓｅ和 ＰＹＣ的重
组菌 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ 的 ＮＡＰＲＴａｓｅ 和
ＰＹＣ的比酶活达到最高，分别为 ２０􀆰 ７５ 和 １􀆰 ０４ Ｕ ／
ｍｇ，同时辅酶 ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋及 ＮＡＤ（Ｈ）总量达到最
高。 单一性表达烟酸转磷酸核糖激酶后，菌株比酶活
与 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ相比相差不大，但是
由于未表达外源基因 ｐｙｃ，故未能检测到 ＰＹＣ 的酶
活。 而单一性表达 ＰＹＣ的菌株，ＮＡＰＲＴａｓｅ的酶活远
远低 于 重 组 菌 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ 中
ＮＡＰＲＴａｓｅ的酶活，故该菌株的辅酶 ＮＡＤＨ、ＮＡＤ＋及
ＮＡＤ（Ｈ）总量均较低。
表 １　 １００ ｍＬ ＬＢ培养基有氧诱导后的结果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｅｒｏｂｉｃ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｉｎ １００ ｍＬ ＬＢ ｍｅｄｉａ
菌　 株 ＰＹＣ比酶活 ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＰＲＴａｓｅ比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＤＨ含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ＋含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ（Ｈ）含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ １􀆰 ９７±０􀆰 ０１ １􀆰 ２７±０􀆰 ０３ ８􀆰 ７２±０􀆰 ０８ ９􀆰 ９９±０􀆰 １１
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ １９􀆰 ４５±０􀆰 ０２ ３􀆰 ５１±０􀆰 ０２ １６􀆰 ９１±０􀆰 １１ ２０􀆰 ４２±０􀆰 １３
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ ０􀆰 ４１±０􀆰 ０１ ２􀆰 ０６±０􀆰 ０２ ２􀆰 ５１±０􀆰 ０４ ９􀆰 ５８±０􀆰 ０７ １２􀆰 ０９±０􀆰 １２
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ １􀆰 ０４±０􀆰 ０２ ２０􀆰 ７５±０􀆰 １２ ２􀆰 ２４±０􀆰 ０３ １９􀆰 ０５±０􀆰 １２ ２１􀆰 ２８±０􀆰 １５
　 注：所有实验值都是 ３个平等样的平均值。
　 　
２􀆰 ４　 重组菌株的厌氧血清瓶发酵
接 １０％有氧三角瓶菌液至厌氧血清瓶，使初始
ＯＤ６００为 ０􀆰 ７，添加 ＩＰＴＧ和 ＮＡ终浓度分别为 ０􀆰 ３ 和
０􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，发酵 ４８ ｈ 后测定各参数，结果如表 ２
和表 ３所示。
表 ２　 厌氧血清瓶发酵结果
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｅａｌｅｄ ｂｏｔｔｌｅｓ ｕｎｄｅｒ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
菌　 株 ＯＤ６００
ρ（消耗葡萄糖） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（丁二酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（丙酮酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ρ（苹果酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ １􀆰 ３３±０􀆰 ０３ ２􀆰 ３±０􀆰 ４ １􀆰 ５７±０􀆰 １２ １􀆰 ９０±０􀆰 １１
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ４􀆰 ３２±０􀆰 ０５ １４􀆰 ０±０􀆰 ５ ７􀆰 ０６±０􀆰 ２３ ７􀆰 ２４±０􀆰 １８
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ ２􀆰 ２７±０􀆰 ０７ ３􀆰 ５±０􀆰 ４ ２􀆰 ７７±０􀆰 １６ ０􀆰 １８±０􀆰 １２
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ ５􀆰 ２５±０􀆰 ０３ １７􀆰 ５±０􀆰 ６ １４􀆰 ０８±０􀆰 ４５ ０􀆰 １１±０􀆰 ２３ １􀆰 ３７±０􀆰 １０
　 注：所有实验值都是 ３个平等样的平均值。
表 ３　 菌株细胞提取物中 ＰＹＣ和 ＮＡＰＲＴａｓｅ的比酶活及辅酶 ＮＡＤ（Ｈ）的含量测定
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＰＹＣ ａｎｄ ＮＡＰＲＴａｓｅ ｉｎ ｃｒｕｄｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ
ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ＮＡＤ（Ｈ）
菌株 ＰＹＣ比酶活 ／（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＰＲＴａｓｅ
比酶活 ／
（Ｕ·ｍｇ－１）
ＮＡＤＨ含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ＋含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ＮＡＤ（Ｈ）含量 ／
（μｍｏｌ·ｇ－１）
ｎ（ＮＡＤＨ） ／
ｎ（ＮＡＤ＋）
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ０􀆰 ７０±０􀆰 ０２ １􀆰 ４１±０􀆰 ０２ ２􀆰 ３４±０􀆰 ０６ ３􀆰 ７５±０􀆰 ０１ ０􀆰 ６０±０􀆰 ０２
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ １０􀆰 ５４±０􀆰 ０３ １􀆰 ９９±０􀆰 ０３ １３􀆰 ６２±０􀆰 １２ １５􀆰 ６１±０􀆰 １４ ０􀆰 １５±０􀆰 ０２
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ ０􀆰 ８７±０􀆰 ０２ １􀆰 ０１±０􀆰 ０２ １􀆰 ４６±０􀆰 ０２ ２􀆰 ８２±０􀆰 ０７ ４􀆰 ２７±０􀆰 ２１ ０􀆰 ５４±０􀆰 ０２
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ １􀆰 ７２±０􀆰 ０３ １８􀆰 ７４±０􀆰 ０５ １􀆰 ６７±０􀆰 ０４ ３８􀆰 ８９±０􀆰 ２４ ４０􀆰 ５６±０􀆰 １１ ０􀆰 ０４±０􀆰 ０１
　 　 充足的 ＮＡＤ＋进行葡萄糖氧化可以满足细胞的 生长需求，大肠杆菌 ＮＺＮ１１１ 由于敲除了丙酮酸甲
３５　 第 ４期 　 梁丽亚等：共表达烟酸转磷酸核糖激酶和丙酮酸羧化酶对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１产丁二酸的影响
酸裂解酶基因（ｐｆｌ）与乳酸脱氢酶基因（ ｌｄｈ），ＮＡＤ＋
不能及时再生，从而导致胞内辅酶 ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋比
例的不平衡，以至于该菌株厌氧条件下不能代谢葡
萄糖进行细胞生长和产酸［１ ３］。 由表 ２ 可以看出，
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ的 ＯＤ６００是对照菌 ＮＺＮ１１１ ／
ｐＴｒｃ９９ａ的 ３􀆰 ２５ 倍。 由表 ３ 可知：重组菌 ＮＺＮ１１１ ／
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ 的 ＮＡＰＲＴａｓｅ 比酶活比对照菌
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ提高了 １４􀆰 ０６ 倍，ＮＡＤ＋的浓度提
高了 ４􀆰 ８２ 倍， ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋ 的 比 例 由 对 照 菌
ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ的 ０􀆰 ６０ 下降到了 ０􀆰 １５，表明单一
性表达 ＮＡＰＲＴａｓｅ提高了辅酶 ＮＡＤ＋的含量，恢复了
ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋比例平衡，一定程度上恢复了该菌株
厌氧条件细胞生长及代谢葡萄糖的能力。 而单一
性表达 ＰＹＣ、ＮＡＤＨ ／ ＮＡＤ＋的比例为 ０􀆰 ５４，故辅酶仍
然不平衡，所以重组菌株 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ 几
乎没有恢复生长及代谢葡萄糖生成丁二酸的能力。
由表 ２ 还 可 以 看 出： 虽 然 单 一 性 表 达
ＮＡＰＲＴａｓｅ，重组菌 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ 与对照
菌相比，４８ ｈ 消耗了 １４􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ 的葡萄糖，并积累了
７􀆰 ０６ ｇ ／ Ｌ 的丁二酸，但是副产物丙酮酸的产量也达
到了 ７􀆰 ２４ ｇ ／ Ｌ。 为了进一步减少丙酮酸的生成，构
建了共表达 ＮＡＰＲＴａｓｅ 和 ＰＹＣ 的重组菌 ＮＺＮ１１１ ／
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ，该菌株的发酵性能进一步得到
优化，４８ ｈ能够消耗 １７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖，生成 １４􀆰 ０８
ｇ ／ Ｌ 的丁二酸，而丙酮酸的产量大幅度降低仅为
０􀆰 １１ ｇ ／ Ｌ （表 ２）。 丙酮酸通过 ＰＹＣ 催化生成了
ＯＡＡ。 由于 ＯＡＡ的快速生成使一部分 ＯＡＡ转化成
了苹果酸，故重组菌 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ 发
酵后得到了 １􀆰 ３７ ｇ ／ Ｌ的苹果酸。
３　 结　 论
通过考察单一性表达烟酸转磷酸核糖激酶的菌
株 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ，单一性表达丙酮酸羧化
酶的菌株 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ 以及共表达烟酸转
磷酸核糖激酶与丙酮酸羧化酶的重组菌株 ＮＺＮ１１１ ／
ｐＴｒｃ９９ａ ｐｎｃＢ ｐｙｃ，发现单一性表达 ＮＡＰＲＴａｓｅ 提
高了胞内 ＮＡＤ（Ｈ）的总量，降低了 ＮＡＤＨ／ ＮＡＤ＋比
例，恢复了菌株厌氧条件下生长及代谢葡萄糖的能
力，而单一性表达丙酮酸羧化酶，并未恢复辅酶的平
衡，所以重组菌株 ＮＺＮ１１１ ／ ｐＴｒｃ９９ａ ｐｙｃ几乎没有恢
复生长及代谢葡萄糖生成丁二酸的能力。 通过共表
达烟酸转磷酸核糖激酶与丙酮酸羧化酶，重组菌株的
发酵性能进一步得到了优化，厌氧摇瓶发酵结果：４８
ｈ能够消耗 １７􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ的葡萄糖，生成 １４􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ的丁
二酸，而丙酮酸的产量大幅度降低，仅为 ０􀆰 １１ ｇ ／ Ｌ。
本研究为基因工程菌大肠杆菌厌氧条件下发酵生产
丁二酸提供了一定的基础。
参考文献：
［ １ ］ 　 ＭｃＫｉｎｌａｙ Ｊ Ｂ，Ｖｉｅｉｌｌｅ Ｃ，Ｚｅｉｋｕｓ Ｇ Ｊ． Ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ｆｏｒ ａ ｂｉｏ⁃ｂａｓｅｄ
ｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｉｎｄｕｓｔｒｙ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ２００７， ７６ （ ４）：
７２７⁃７４０．
［ ２ ］ 　 Ｗｉｌｌｋｅ Ｔ， Ｖｏｒｌｏｐ Ｋ Ｄ． Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｂｉｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｎｅｗａｂｌｅ
ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｓ ａｎ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｔｏ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００４，６６：１３１⁃１４２．
［ ３ ］ 　 Ｈｏｎｇ Ｓ Ｈ，Ｌｅｅ Ｓ Ｙ．Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｒｅｄｏｘ ｂａｌａｎｃｅ ｏｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｅ． ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ． Ａｐｐｌ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００２，５８：２８６⁃２９０．
［ ４ ］ 　 Ｗｕ Ｈ，Ｌｉ Ｚ Ｍ，Ｚｈｏｕ Ｌ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｔｈｅ ａｎａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＰｆｌＢ ｌｄｈＡ ｄｏｕｂｌｅ
ｍｕｔａｎｔ ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｅｎｈａｎｃｅｄ ａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｒｅｃｅｄｉｎｇ ａｅｒｏｂｉｃ ｃｕｌｔｕｒｅ［ Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００７，７３
（２４）：７８３７⁃７８４３．
［ ５ ］ 　 Ｖｅｍｕｒｉ Ｇ Ｎ，Ｅｉｔｅｍａｎ Ｍ Ａ，Ａｌｔｍａｎ Ｅ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｍｏｄｅ ａｎｄ
ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｏｎ ｓｕｃｃｉｎｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ
ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］ ．Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，
２００２，６８（４）：１７１５⁃１７２７．
［ ６ ］ 　 刘嵘明，马江锋，梁丽亚，等．过量表达烟酸转磷酸核糖激酶
对大肠杆菌 ＮＺＮ１１１ 产丁二酸的影响［ Ｊ］ ．生物工程学报，
２０１１，２７（１０）：１⁃１０．
［ ７ ］ 　 Ｃｌａｒｋ Ｄ Ｐ． Ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ［ Ｊ］ ．
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ，１９８９，６３：２２３⁃２３４．
［ ８ ］ 　 Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ，Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ
［ Ｍ ］． ３ｒｄ ｅｄ． Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，２００１．
［ ９ ］ 　 Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ Ｍ，Ｂｒｅｎｔ Ｒ，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ Ｒ Ｅ．Ｓｈｏｒｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｂｉｏｌｏｇｙ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ，１９９９：２４０⁃２５１．
［１０］ 　 Ｖｉｎｉｔｓｋｙ Ａ，Ｇｒｕｂｍｅｙｅｒ Ｃ．Ａ ｎｅｗ ｐａｒａｄｉｇｍ ｆｏｒ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｅｎｅｒｇｙ
ｃｏｕｐｌｉｎｇ： Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ｎｉｃｏｔｉｎａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌ⁃
ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ［Ｊ］ ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，１９９３，２６８（３４）：２６００４⁃２６０１０．
［１１］ 　 Ｐａｙｎｅ Ｊ，Ｍｏｒｒｉｓ Ｊ Ｇ． Ｐｙｒｕｖａｔｅ ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
ｓｐｈｅｒｏｉｄｅｓ［Ｊ］ ．Ｊ Ｇｅｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９６９，５９：９７⁃１０１．
［１２］ 　 李建，陈可泉，黄秀梅，等．厌氧发酵有机酸体系中 ＮＡＤ＋和
ＮＡＤＨ 测定方法的建立 ［ Ｊ］ ．食品科技， ２００８， ３３ （ １２ ）：
２５４⁃２５７．
［１３］ 　 Ｓｉｎｇｈ Ａ，Ｌｙｎｃｈ Ｍ Ｄ，Ｇｉｌｌ Ｒ Ｔ．Ｇｅｎｅｓ ｒｅｓｔｏｒｉｎｇ ｒｅｄｏｘ ｂａｌａｎｃｅ ｉｎ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ⁃ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ＮＺＮ１１１［ Ｊ］ ． Ｍｅｔａｂ Ｅｎｇ，２００９，１１
（６）：３４７⁃３５４．
（责任编辑　 荀志金）
４５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷