全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 33 卷 第 6 期摇 摇 2013 年 3 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
专论与综述
基于遥感技术的森林健康研究综述 高广磊,信忠保,丁国栋,等 (1675)…………………………………………
Agent农业土地变化模型研究进展 余强毅,吴文斌,杨摇 鹏,等 (1690)…………………………………………
个体与基础生态
辽东湾北部近海沙蜇的动态分布 王摇 彬,秦宇博,董摇 婧,等 (1701)……………………………………………
口虾蛄 proPO基因全长 cDNA的克隆与组织表达 刘海映,刘连为,姜玉声,等 (1713)…………………………
中缅树鼩头骨及下臼齿几何形态与环境的关系 朱万龙,贾摇 婷,黄春梅,等 (1721)……………………………
亚热带 3 种树种凋落叶厚度对其分解速率及酶活性的影响 季晓燕,江摇 洪,洪江华,等 (1731)………………
浙北地区常见绿化树种光合固碳特征 张摇 娇,施拥军,朱月清,等 (1740)………………………………………
两种高质牧草不同生育期光合生理日变化及光响应特征 郭春燕,李晋川,岳建英,等 (1751)…………………
基于 WOFOST作物生长模型的冬小麦干旱影响评估技术 张建平,赵艳霞,王春乙,等 (1762)………………
基于线粒体 DNA控制区的斑翅草螽不同地理种群遗传分化研究 周志军,尚摇 娜,刘摇 静,等 (1770)………
圈养尖吻蝮雌体大小、窝卵数和卵大小之间的关系 胡明行,谭群英,杨道德 (1778)……………………………
应用寄生蜂和不育雄虫防控田间橘小实蝇 郑思宁,黄居昌,叶光禄,等 (1784)…………………………………
青蒿素对外生菌根真菌化感效应 李摇 倩,袁摇 玲,王明霞,等 (1791)……………………………………………
种群、群落和生态系统
海湾生态系统健康评价方法构建及在大亚湾的应用 李纯厚,林摇 琳,徐姗楠,等 (1798)………………………
上升流和水团对浙江中部近海浮游动物生态类群分布的影响 孙鲁峰,柯摇 昶,徐兆礼,等 (1811)……………
半干旱区生态恢复关键生态系统识别———以内蒙古自治区和林县为例
彭摇 羽,高摇 英,冯金朝,等 (1822)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
太岳山油松人工林土壤呼吸对强降雨的响应 金冠一,赵秀海,康峰峰,等 (1832)………………………………
重庆酸雨区马尾松林凋落物特征及对干旱胁迫的响应 王轶浩,王彦辉,于澎涛,等 (1842)……………………
景观、区域和全球生态
城市典型水域景观的热环境效应 岳文泽,徐丽华 (1852)…………………………………………………………
外来树种桉树引种的景观生态安全格局 赵筱青,和春兰 (1860)…………………………………………………
基于耕地生态足迹的重庆市耕地生态承载力供需平衡研究 施开放,刁承泰,孙秀锋,等 (1872)………………
大气 CO2 浓度升高对稻田根际土壤甲烷氧化细菌丰度的影响 严摇 陈,许摇 静,钟文辉,等 (1881)…………
资源与产业生态
基于可变模糊识别模型的海水环境质量评价 柯丽娜,王权明,孙新国,等 (1889)………………………………
亚热带养殖海湾皱瘤海鞘生物沉积的现场研究 闫家国,齐占会,田梓杨,等 (1900)……………………………
黄土高原典型苹果园地深层土壤氮磷钾养分含量与分布特征 张丽娜,李摇 军,范摇 鹏,等 (1907)……………
旱作农田不同耕作土壤呼吸及其对水热因子的响应 张丁辰,蔡典雄,代摇 快,等 (1916)………………………
商洛低山丘陵区农林复合生态系统中大豆与丹参的光合生理特性 彭晓邦,张硕新 (1926)……………………
外源油菜素内酯对镉胁迫下菊芋幼苗光合作用及镉富集的调控效应 高会玲,刘金隆,郑青松,等 (1935)……
基于侧柏液流的测定对 Granier原始公式系数进行校正 刘庆新,孟摇 平,张劲松,等 (1944)…………………
研究简报
湿地自然保护区保护价值评价方法 孙摇 锐,崔国发,雷摇 霆,等 (1952)…………………………………………
干热河谷印楝和大叶相思人工林根系生物量及其分布特征 高成杰,唐国勇,李摇 昆,等 (1964)………………
海滨沙滩单叶蔓荆对沙埋的生理响应特征 周瑞莲,王摇 进,杨淑琴,等 (1973)…………………………………
宁夏贺兰山、六盘山典型森林类型土壤主要肥力特征 姜摇 林,耿增超,张摇 雯,等 (1982)……………………
学术争鸣
小兴安岭十种典型森林群落凋落物生物量及其动态变化 侯玲玲,毛子军,孙摇 涛,等 (1994)…………………
中国生态学学会 2013 年学术年会征稿通知 (2002)………………………………………………………………
第七届现代生态学讲座、第四届国际青年生态学者论坛通知 (玉)………………………………………………
中、美生态学会联合招聘国际期刊主编 (印)………………………………………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*328*zh*P* ￥ 90郾 00*1510*34*
室室室室室室室室室室室室室室
2013鄄03
封面图说: 亭亭玉立的白桦树———白桦为落叶乔木,可高达 25m,胸径 50cm。 其树冠呈卵圆形,树皮白色,纸状分层剥离;叶三
角状、卵形或菱状卵形;花单性,雌雄同株。 白桦树喜光,耐严寒,对土壤适应性强,喜酸性土,沼泽地、干燥阳坡及湿
润阴坡都能生长。 常与红松、落叶松、山杨、蒙古栎混生。 白桦的天然更新好,生长较快,萌芽强,在人为的采伐迹地
或火灾、风灾等自然损毁的迹地里,往往由白桦首先进入,为先锋树种,而形成白桦次生林。 白桦分布甚广,我国大、
小兴安岭及长白山均有成片纯林,在华北平原和黄土高原山区、西南山地亦为阔叶落叶林及针叶阔叶混交林中的常
见树种。
彩图及图说提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 33 卷第 6 期
2013 年 3 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 33,No. 6
Mar. ,2013
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基金项目:国家海洋公益性行业科研专项经费项目(200905019);辽宁省科学技术计划项目(2008203002); 辽宁省自然科学基金项目项
(20052138)
收稿日期:2012鄄07鄄15; 摇 摇 修订日期:2013鄄01鄄21
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: hyliu@ dlou. edu. cn
DOI: 10. 5846 / stxb201207150997
刘海映,刘连为,姜玉声,隋宥珍,陈雷.口虾蛄 proPO基因全长 cDNA的克隆与组织表达.生态学报,2013,33(6):1713鄄1720.
Liu H Y, Liu L W, Jiang Y S, Sui Y Z,Chen L. Full length cDNA cloning and tissue expression of prophenoloxidase from Oratosquilla oratoria. Acta
Ecologica Sinica,2013,33(6):1713鄄1720.
口虾蛄 proPO基因全长 cDNA的克隆与组织表达
刘海映1,*,刘连为1,姜玉声2,隋宥珍2,陈摇 雷1
(1. 大连海洋大学辽宁省海洋牧场工程技术研究中心, 大连摇 116023;
2. 大连海洋大学 农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室, 大连摇 116023)
摘要:口虾蛄是海湾底拖网渔业中具有重要经济价值的种类,分布广泛。 其自然资源日渐衰退,人工育苗技术获得成功后,口虾
蛄养殖过程中病害问题及其防治应引起足够的重视。 为此,拟通过分子生物学手段研究口虾蛄免疫系统的核心酶———酚氧化
酶(PO)的分子结构及该基因的组织表达,从而在分子水平上深入探究其免疫机理。 采用反转录 PCR(RT鄄PCR)与 cDNA 末端
快速克隆(RACE)技术从口虾蛄血细胞中克隆了酚氧化酶原(O鄄proPO)基因,cDNA全长为 2436bp,其中开放阅读框为 2142bp,
编码 713 个氨基酸。 预测分子量为 82446Da,等电点(pI)为 8. 78。 该基因与 Genbank 上登录的斑节对虾、凡纳滨对虾、罗氏沼
虾、短沟对虾、日本对虾 proPO 基因序列具有较高的同源性,分别为 82% 、76% 、76% 、72% 、70% 。 序列分析表明O鄄proPO 为
proPO家族中的一个成员,其氨基酸序列中含有多个免疫调节作用位点。 系统进化分析显示 O鄄proPO 与十足目种类的 proPO
为同一分支的 2 个亚群,而后于丰年虫的 proPO形成一分支。 O鄄proPO 基因表达具有组织特异性,在血淋巴和肠中表达,但在
血淋巴中表达量明显高于肠。
关键词:口虾蛄;酚氧化酶原;分子克隆;表达分析
Full length cDNA cloning and tissue expression of prophenoloxidase from
Oratosquilla oratoria
LIU Haiying1,*, LIU Lianwei1, JIANG Yusheng2, SUI Youzhen2,CHEN Lei1
1 Center of Marine Ranching Engineering Science Research of Liaoning Province, Dalian Ocean University; Dalian 116023, China
2 Key Laboratory of North Mariculture, Ministry of Agriculture, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China
Abstract: Prophenoloxidase (proPO) is the terminal component of the proPO activating system, a defense and recognition
system in crustaceans and insects. It can be activated to generate the active enzyme phenoloxidase (PO) by a proteinase
cascade and some additional factors. PO can oxidize phenols to quinones that can then polymerize non鄄enzymatically to
melanin. Recently, molecular biology studies of proPO, such as gene expression, structure analysis, and real time
expression, have made great progress. However, these studies focused mainly on shrimps and crabs. To better understand
the phylogenetic relations and characteristics of the proPOs gene among crustaceans, it is necessary to study crustaceans
other than shrimp and crab. Oratosquilla oratoria belongs to order Stomatopoda in phylum Crustacea. O. oratoria is found
on muddy bottoms in the coastal waters of Russia, China, Korea, Japan, Vietnam, and Australia and is exploited
commercially in many regions. Its natural resources have degraded by degrees since fishing intensification increased and the
ecological environment of inshore areas deteriorated. Artificial breeding of O. oratoria is now practiced successfully.
However, just as the sustainability and development of shrimp aquaculture is increasingly threatened by significant
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ecological and pathological problems, it is likely that O. oratoria aquaculture will develop similar severe issues. To boost
the healthy development of O. oratoria aquaculture, much more attention should be paid to the PO enzyme which plays an
important part in the immune system of crustaceans. Research on the molecular structure and tissue expression of the proPO
gene may give us a more thorough understanding of the immunologic mechanisms in O. oratoria. In this paper, the cDNA of
the O. oratoria proPO (O鄄proPO) gene was cloned using reverse transcription PCR (RT鄄PCR) and rapid amplification of
cDNA ends (RACE). The full length cDNA of O鄄proPO consisted of 2, 436 base pairs ( bp) with a 2, 142 bp open
reading frame (ORF), which can encode a 713 amino acid protein with a predicted molecular mass of 82, 446 Daltons and
an estimated pI of 8. 78. The nucleotide sequence of O鄄proPO showed 82% , 76% , 76% , 72% , 70% and the deduced
amino acid sequence of O鄄proPO showed 51% , 51% , 48% , 51% , and 50% homology with the corresponding sequences
from Penaeus monodon, Litopenaeus vannamei, Macrobrachium rosenbergii, Penaeus semisulcatus and Marsupenaeus
japonicas respectively. Sequence analysis indicated that three tandem hemocyanin domains ( hemocyanin鄄N domains,
hemocyanin鄄C domains and hemocyanin鄄M domains) were present in the O鄄proPO amino acid sequence, confirming that
O鄄proPO is a member of the proPO family. The hemocyanin鄄M domains contained two conserved copper鄄binding sites
surrounded by six histidine residues that are highly conserved in other crustacean species. Five polyadenylation signal sites
were identified in the nucleotide sequence of O鄄proPO, suggesting that multiple shearing may occur at the 3忆 end. This
phenomenon has rarely been reported in crustaceans. Several immune modulatory sites were also detected in the amino acid
sequence of O鄄proPO; they include a putative cleavage site for zymogen activation by the proPO鄄activating enzyme (ppA),
five predicted N鄄linked glycosylation sites and an 琢2 鄄macroglobulin site, all of which might play a critical role in the
immunologic process. The sequence of the 琢2 鄄macroglobulin site, ACGWPQHV, was found to be conserved when the
O鄄proPO amino acid sequence was compared with proPO in other crustacean species. Phylogenetic analysis revealed that
O鄄proPO and proPO of decapod species formed two subgroups on the same branch of the tree. These subgroups then
clustered with proPO from Artemia franciscana. This finding is consistent with the taxonomic status of these species. Tissue
expression of the proPO gene was carried out in antenna, eyestalk, ovarian, intestine, muscle and hemolymph of
O. oratoria by semi鄄quantitative RT鄄PCR analysis. ProPO expression was detected in hemolymph and intestine, with the
higher expression level in hemolymph.
Key Words: Oratosquilla oratoria; prophenoloxidase; molecular cloning; expression analysis
随着对虾养殖过程中的生态和病害问题日益严重,对虾养殖业的可持续发展引起了广大学者的关
注[1鄄2],国内外围绕甲壳动物免疫机制开展了大量的研究[3鄄8]。 在甲壳动物的识别与防御系统中,酚氧化酶
(phenoloxidase, PO ) 作为核心酶起到关键性作用, 它一般以无活性的酶原形式—酚氧化酶原
(prophenoloxidase, proPO)存在[9鄄17]。 目前,越来越多的甲壳动物 proPO基因被克隆,它们的分子结构及组织
表达等方面也被深入地研究[18鄄24]。 然而,这些研究工作多以十足目中的虾蟹类为研究对象,proPO 基因在甲
壳动物中的进化关系至今尚不清楚。 因此,有必要对十足目以外种类的 proPO 基因特性进行研究,为探明这
一重要免疫相关基因的功能演化提供依据。
口虾蛄(Oratosquilla oratoria)广泛分布于俄罗斯、中国、日本、韩国、越南与澳大利亚近海,并且在许多海
域被商业性开发[25]。 由于捕捞强度的增大与近海生态环境的破坏,口虾蛄自然资源日渐衰退,有关其增养殖
技术的研究及资源保护与合理利用等备受关注[26鄄27]。 人工育苗技术获得成功后[28鄄30],口虾蛄养殖过程中病
害问题及其防治将显得尤为突出,从分子水平上深入探究其免疫机理具有深远的意义。 为此,本文采用反转
录 PCR(RT鄄PCR)与 cDNA 末端快速克隆(RACE)技术克隆了口虾蛄 proPO(O鄄proPO)基因全长 cDNA
(GenBank登陆号:HQ588346),对该基因及其编码的氨基酸序列进行了结构分析,并探讨该基因在不同组织
中的表达情况,以期为口虾蛄养殖的疾病防控提供理论基础。
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1摇 材料与方法
1. 1摇 实验材料
摇 摇 口虾蛄购自大连市黑石礁水产品市场,体长为 13. 5—16. 0 cm,于实验室循环水槽内暂养一周后抽取血
淋巴。 RNA simple Total RNA Kit 购自天根生化科技有限公司。 M鄄MLV reverse transcriptase、 Taq DNA
polymerase、Hind芋、BamH玉、DL2000 Maker、pMD19鄄T vector 购自宝生物工程(大连)有限公司。 DNA 回收和
质粒回收使用爱思进生物技术有限公司的 AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit 和 AxyPrepTM Plasmid Miniprep
Kit。 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit为 Clontech公司产品。 大肠杆菌 DH5琢 菌株购自上海生物工程
技术服务有限公司。 其它试剂均为国产分析纯。
1. 2摇 总 RNA提取与 cDNA合成
血淋巴的抽取参考文献[9],用 RNA simple Total RNA Kit提取血细胞总 RNA。 1%的琼脂糖凝胶电泳检测
所提取口虾蛄总 RNA的质量,M鄄MLV reverse transcriptase将 mRNA反转录成 cDNA。
1. 3摇 O鄄proPO基因 cDNA片段的克隆
以合成的血细胞 cDNA为模板进行 PCR扩增,扩增引物为:UPhF,5忆鄄CACCACTGGCACTGGCA鄄3忆;UPhRr,
5忆鄄TACCCGAAGGGCAAGCTAGC鄄3忆。 PCR反应条件:94 益预变性 2 min;94 益变性 30 s,56 益退火 30 s,72 益
延伸 90 s,35 个循环;72 益最后延伸 2 min。 PCR产物经过 1%琼脂糖凝胶电泳分离,切胶纯化目的片段,然
后连接至 pMD19鄄T载体并转化到 E. coli DH5琢菌株中。 PCR筛选阳性克隆,检测后测序。
1. 4摇 O鄄proPO基因 cDNA全长扩增
根据已获得的 O鄄proPO基因 cDNA片段设计 3忆RACE特异性引物 UPhRf和 5忆RACE 特异性引物 UPh5c,
接头引物分别为 AU和 NUP(引物序列见表 1)。 3忆RACE PCR反应条件:94 益预变性 2 min;94 益变性 30 s,
56 益退火 30 s,72 益延伸 30 s,35 个循环;72 益最后延伸 2 min。 5忆RACE PCR反应条件:94 益预变性 3 min;
94 益变性 45 s,55 益退火 45 s,72 益延伸 2 min,35 个循环;72 益最后延伸 4 min。 对所有序列进行拼接,获得
cDNA全长。
1. 5摇 序列分析
采用 BLAST程序对 O鄄proPO基因 cDNA 序列进行比对分析(http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov / blast / )。 使
用 Primer Premier version 5. 0 软件进行引物设计及 cDNA蛋白翻译,对推导出的氨基酸序列使用 Protparam软
件( http: / / au. expasy. org / tools / protparam. htm1)进行蛋白质理化特性预测,Smart 软件预测功能域。 采用
MEGA version 5. 0 软件对预计的 O鄄proPO氨基酸序列进行分子进化分析,通过 Neighbor鄄joining(NJ)方法构建
系统进化树。
1. 6摇 不同组织 proPO基因的表达分析
利用半定量 RT鄄PCR技术,检测 O鄄proPO基因在血细胞、肌肉、肠、卵巢、眼柄及触角中的表达情况。 目的
基因扩增引物 UPhF和 UPhRr如前所述,内标基因 茁鄄actin扩增引物为 Actinf和 Actinr(引物序列见表 1),每个
组织设 3 个平行组。 PCR反应条件:94 益预变性 2 min;94 益变性 30 s,55 益退火 60 s,72 益延伸 30 s,28 个
循环;72 益最后延伸 2min。
表 1摇 试验中所用引物及其序列
Table 1摇 primers used in this experiment
引物名称
Name of primers
序列
Sequences
引物名称
Name of primers
序列
Sequences
UPhRr 5忆TACCCGAAGGGCAAGCTAGC鄄3忆 UPh5c 5忆鄄CGGGGTCAAATCCGACGACAACG鄄3忆
NUP 5忆鄄AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT鄄3忆 AU 5忆鄄GGCCACGGTCGACTAGTAC鄄3忆
Actinf 5忆鄄CGATATGGAGAAGATCTGGCAT鄄3忆 Actinr 5忆鄄AGCTTCTCCTTGATGTCACG鄄3忆
5171摇 6 期 摇 摇 摇 刘海映摇 等:口虾蛄 proPO基因全长 cDNA的克隆与组织表达 摇
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2摇 结果
2. 1摇 O鄄proPO基因 cDNA特征及其蛋白结构预测
摇 摇 经拼接的 O鄄proPO cDNA全长为 2436bp, 包含一个 2142bp 开放阅读框(ORF),编码 713 个氨基酸(图
1)。 O鄄proPO分子量为 82446Da,等电点(pI)为 8. 78。 序列分析表明,O鄄proPO 为 proPO 家族中的一个成员,
该蛋白含有 3 个串联血蓝蛋白结构域:hemocyanin鄄N 结构域(残基 42 位—142 位)、hemocyanin鄄M(残基 144
位—421 位)结构域与 hemocyanin鄄C结构域(残基 427 位—686 位),它们被认为是 proPO的功能结构域[31](图
2)。 其中,hemocyanin鄄M结构域中存在铜离子结合位点 A(CuA)和 B(CuB)。 6 个组氨酸在 2 个铜结合位点
中的位置:210、214、238 为 A位点,372、376 和 412 为 B位点。 多序列比对表明,第 46(Arg)—47(Ser)位氨基
酸之间的肽键很可能是酚氧化酶活化时被切割的位点。 O鄄proPO含有 5 个 N鄄糖基化位点与 1 个 琢2 巨球蛋白
位点(ACGWPQHV)。
图 1摇 口虾蛄酚氧化酶原基因 cDNA及推测的氨基酸序列
Fig. 1摇 Nucleotide sequence of proPO cDNA from Oratosquilla oratoria and its deduced amino acid sequence
方框分别表示起始密码子(ATG)、琢2 巨球蛋白位点(ACGWPQHV)、终止密码子(TGA)、多聚 a 信号肽链序列( aataaa);划线标记区域为 3
个血蓝蛋白结构域,加粗字体表示铜离子结合位点内的 6 个组氨酸残基;三角形所示位置为酚氧化酶激活酶水解位点;灰色部分为 N鄄糖基
化位点
图 2摇 口虾蛄酚氧化酶原中的 3 个串联血蓝蛋白结构域位置
Fig. 2摇 Distribution of three tandem hemocyanin domains of proPO from Oratosquilla oratoria
2. 2摇 proPO同源序列及系统进化分析
O鄄proPO基因序列与 Genbank登录的斑节对虾(Penaeus monodon, AF099741. 1)、凡纳滨对虾(Litopenaeus
vannamei, EU373096. 1)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii, DQ182596. 1)、短沟对虾(Penaeus semisulcatus,
AF521949. 1)、日本对虾(Marsupenaeus japonicus, AB073223. 1)具有较高同源性,分别为 82% 、76% 、76% 、
6171 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 33 卷摇
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72% 、70% 。 推测的 O鄄proPO氨基酸序列与这些物种的同源性分别为 51% (AAM77689)、51% (AAW51360)、
48% (ABA60740)、51% (AAM77690)、50% (BAB83773)。 对它们的 proPO 2 个铜结合位点内氨基酸序列进行
比较(图 3),可以看出铜结合位点内的 6 个组氨酸及相邻氨基酸序列高度保守。 为了检验物种 proPO基因的
图 3摇 口虾蛄及其他甲壳动物 proPO铜结合位点内推测的氨基酸序列同源性比较
Fig. 3摇 Alignments of two copper binding sites of proPOs of Oratosquilla oratoria and other crustacean
阴影部分表示 6 个物种 proPO的保守区域,星号标记的部分为 6 个组氨酸残基
摇 图 4摇 基于口虾蛄与其它甲壳动物 proPO预测氨基酸序列构建的
系统发生树
Fig. 4 摇 NJ Phylogenetic tree based on deduced proPO amino
acids of Oratosquilla oratoria and other crustacean
Penaeus monodon ( AAM77689. 1 ), Penaeus semisulcatus
( AAM77690. 1 ), Litopenaeus vannamei ( AAW51360. 1 ),
Marsupenaeus japonicus ( BAB83773. 1 ), Macrobrachium rosenbergii
( ABA60740. 1 ), Eriocheir sinensis ( ABS19633. 1 ), Homarus
gammarus( CAE46724. 1 ), Fenneropenaeus chinensis ( ABV60265.
1), Nephrops norvegicus ( CCE46011. 1 ), Portunus trituberculatus
( ACI46633. 1 ), Homarus americanus ( AAT73697. 1 ), Cancer
pagurus( CBW54878. 1 ), Scylla serrata ( ABD90511. 1 ), Artemia
franciscana( CAO98768. 1 ), Procambarus clarkia ( ABR12412. 1 ),
Pacifastacus leniusculus(ABW16859. 1)
进化关系,17 种甲壳动物 proPO 氨基酸序列被用于 NJ
聚类分析。 图 4 显示,所分析的甲壳动物 proPO 存在 2
个分支,分支 1 包含 O鄄proPO 与十足目种类的 proPO,
分支 2 为无甲目类———丰年虫(Artemia franciscana)的
proPO。
2. 3摇 ProPO的组织表达分析
以 茁鄄actin 基因片段作为内参,采用 RT鄄PCR 技术
研究了 O鄄proPO 基因在各组织中的表达情况(图 5)。
结果表明,O鄄proPO 基因在各组织中表达差异较大,其
在血淋巴和肠中表达,而且在血淋巴中表达显著。 在触
角、眼柄、卵巢、肌肉中不表达。
3摇 讨论
采用 RT鄄PCR 和 RACE 技术从口虾蛄血淋巴中获
得了 O鄄proPO基因 cDNA全长,该基因及其编码的氨基
酸序列与其它甲壳动物具有较高的同源性。 O鄄proPO
基因含 5 个多聚 a加尾信号,表明该基因 3忆端有多种剪
切可能,这在甲壳动物中非常少见[32]。 该蛋白含有 3
个串联血蓝蛋白结构域,存在铜离子结合位点 A 和 B,
表明 O鄄proPO为 proPO家族中的一个成员。 在O鄄proPO
的氨基酸序列上,发现了一个酚氧化酶激活酶的水解位
点。 当病原菌进入宿主后,酚氧化酶激活酶会切断此位
点使酶原生成有活性的酚氧化酶[33]。 而 N鄄糖基化位
点是糖基化过程中调控蛋白质在组织和细胞中的定位、
7171摇 6 期 摇 摇 摇 刘海映摇 等:口虾蛄 proPO基因全长 cDNA的克隆与组织表达 摇
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图 5摇 口虾蛄 proPO基因的组织表达特异性 RT鄄PCR分析
摇 Fig. 5 摇 Semi鄄quantitative RT鄄PCR analysis of proPO gene in
different tissues of Oratosquilla oratoria
功能与活性的重要分子结构[34]。 在氨基酸序列同源性
比较的其它物种中,除了凡纳滨对虾的 proPO 中含有 5
个 N鄄糖基化位点,其它物种含有该位点个数均小于 5。
O鄄proPO 琢2 巨球蛋白位点氨基酸序列为 ACGWPQHV,
斑节对虾、凡纳滨对虾、日本对虾和短沟对虾的 琢2 巨球
蛋白位点氨基酸序列为 GCGWPQHM,而罗氏沼虾则为
GCGWPRHM。 可见,该位点内氨基酸序列非常保守。
琢2 巨球蛋白为酚氧化酶原激活系统中的蛋白酶抑制
剂,与该位点结合后可部分抑制酚氧化酶激酶的
作用[35]。
系统进化分析表明 O鄄proPO 与十足目种类的
proPO为同一分支的 2 个亚群,而后于丰年虫的 proPO
形成一分支。 由图 4 可知,十足目种类的 proPO又分为
游泳亚目和爬行亚目 2 个分支,游泳亚目种类的 proPO 分为 2 个亚群:对虾科(P. semisulcatus, F. chinensis,
P. monodon, L. vannamei,M. japonicus)、螯虾科(P. clarkia,P. leniusculus)、海螯虾科(N. norvegicus, H.
gammarus, H. americanus)的 proPO属于一个亚群,长臂虾科(M. rosenbergii)的 proPO属于另一个亚群,这些
物种 proPO基因的进化关系与它们的分类地位一致。 随着甲壳动物其它物种 proPO 基因的分子结构陆续被
报道,该基因在甲壳类动物中的进化关系将越来越明了。
O鄄proPO基因的表达具有组织特异性,在血淋巴和肠中表达,而且在血淋巴中表达显著。 其它虾蟹类的
proPO mRNA分布:凡纳滨对虾与斑节对虾的 proPO mRNA 是在血细胞中合成而不在肝胰腺中合成[36鄄37];克
氏原螯虾(Procambarus clarkii)proPO基因在血淋巴、肝胰腺、卵巢和精巢中转录水平较高,在肌肉、表皮和鳃
中有较弱表达,而在肠和胃中几乎无表达[38];锯缘青蟹(Scylla serrata)proPO基因在血细胞中显著表达,在心
脏、眼柄、鳃、肌肉、卵巢、肝胰腺、胃、肠中不表达[39];而中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)proPO mRNA转录及 PO
酶活力在肝胰腺、鳃、性腺、肌肉、心脏、眼睛和血细胞中都被检测到,特别在肝胰腺中检测到高水平[40]。 由此
可见,这些种类的 proPO 基因均在血细胞中表达。 甲壳动物细胞免疫是依靠血细胞来完成的,3 种不同类型
的血细胞,即透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞,分别参与不同的机体防御反应[4]。 此种组织表达特性可能
与 proPO在机体生命活动过程中的功能有关,在较高等的无脊椎动物如节肢动物中,PO具有多种功能。 它不
仅参与黑色素形成、角质的硬化和伤口愈合,而且在宿主的防御反应中还作为非自身识别系统发挥功能[41]。
因此,深入研究 PO在口虾蛄免疫系统中的作用机理有助于促进口虾蛄养殖的健康发展。
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0271 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 33 卷摇
ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 33,No. 6 March,2013(Semimonthly)
CONTENTS
Review and Monograph
Forest health studies based on remote sensing: a review GAO Guanglei, XIN Zhongbao, DING Guodong, et al (1675)……………
Progress of agent鄄based agricultural land change modeling: a review YU Qiangyi,WU Wenbin,YANG Peng,et al (1690)……………
Autecology & Fundamentals
Dynamic distribution of Nemopilema nomurai in inshore waters of the northern Liaodong Bay, Bohai Sea
WANG Bin,QIN Yubo, DONG Jing, et al (1701)
……………………………
…………………………………………………………………………………
Full length cDNA cloning and tissue expression of prophenoloxidase from Oratosquilla oratoria
LIU Haiying, LIU Lianwei, JIANG Yusheng, et al (1713)
………………………………………
…………………………………………………………………………
Morphometrics investigation of the skulls, mandibles and molar in Tupaia belangeri from Yunnan, Guizhou, Guangxi
ZHU Wanlong, JIA Ting, HUANG Chunmei, et al (1721)
………………
…………………………………………………………………………
Effects of litter thickness on leaf litter decomposition and enzyme activity of three trees in the subtropical forests
JI Xiaoyan,JIANG Hong,HONG Jianghua,et al (1731)
……………………
……………………………………………………………………………
The photosynthetic carbon fixation characteristics of common tree species in northern Zhejiang
ZHANG Jiao,SHI Yongjun,ZHU Yueqing,et al (1740)
………………………………………
……………………………………………………………………………
Diurnal changes in the photosynthetic characteristics of two high yield and high quality grasses during different stages of growth
and their response to changes in light intensity GUO Chunyan, LI Jinchuan, YUE Jianying, et al (1751)………………………
Evaluation technology on drought disaster to yields of winter wheat based on WOFOST crop growth model
ZHANG Jianping, ZHAO Yanxia,WANG Chunyi, et al (1762)
……………………………
……………………………………………………………………
Genetic diversity of Conocephalus maculatus of different geographic populations based on mitochondrial DNA control region analysis
ZHOU Zhijun, SHANG Na, LIU Jing, et al (1770)
…
………………………………………………………………………………
Relationships among female body size, clutch size, and egg size in captive Deinagkistrodon acutus
HU Minghang, TAN Qunying, YANG Daode (1778)
……………………………………
………………………………………………………………………………
The field control of Bactrocera dorsalis (Hendel) with parasitoid and sterile male
ZHENG Sining, HUANG Juchang,YE Guanglu, et al (1784)
……………………………………………………
………………………………………………………………………
Allelopathic effects of artemisinin on ectomycorrhizal fungi LI Qian, YUAN Ling, WANG Mingxia, et al (1791)……………………
Population, Community and Ecosystem
Establishment of integrated methodology for bay ecosystem health assessment and its application in Daya Bay
LI Chunhou, LIN Lin, XU Shannan, et al (1798)
…………………………
…………………………………………………………………………………
The influence of upwelling and water mass on the ecological group distribution of zooplankton in Zhejiang coastal waters
SUN Lufeng, KE Chang,XU Zhaoli,et al (1811)
……………
……………………………………………………………………………………
Identification of key ecosystem for ecological restoration in semi鄄arid areas: a case study in Helin County, Inner Mongolia
PENG Yu, GAO Ying, FENG Jinzhao, et al (1822)
…………
………………………………………………………………………………
The great rainfall effect on soil respiration of Pinus tabulaeformis plantation in Taiyue Mountain
JIN Guanyi, ZHAO Xiuhai, KANG Fengfeng, et al (1832)
………………………………………
………………………………………………………………………
The litter鄄fall characteristics and their response to drought stress in the Masson pins forests damaged by acid rain at Chongqing,
China WANG Yihao, WANG Yanhui, YU Pengtao, et al (1842)…………………………………………………………………
Landscape, Regional and Global Ecology
Thermal environment effect of urban water landscape YUE Wenze, XU Lihua (1852)…………………………………………………
Landscape ecological security pattern associated with the introduction of exotic tree species Eucalyptus
ZHAO Xiaoqing, HE Chunlan (1860)
………………………………
………………………………………………………………………………………………
Ecological balance between supply and demand in Chongqing City based on cultivated land ecological footprint method
SHI Kaifang,DIAO Chengtai,SUN Xiufeng,et al (1872)
………………
……………………………………………………………………………
Effect of elevated CO2 on methanotrophs in the rhizosphere of rice plant YAN Chen, XU Jing,ZHONG Wenhui,et al (1881)………
Resource and Industrial Ecology
The seawater environment quality evaluation research base on variable fuzzy pattern recognition model
KE Lina, WANG Quanming,SUN Xinguo, et al (1889)
………………………………
……………………………………………………………………………
An in situ study on biodeposition of ascidian (Styela plicata) in a subtropical aquaculture bay, southern China
YAN Jiaguo, QI Zhanhui, TIAN Ziyang, et al (1900)
………………………
……………………………………………………………………………
Distribution of soil NPK nutrient content in deep soil profile of typical apple orchards on the Loess Plateau
ZHANG Lina,LI Jun, FAN Peng,et al (1907)
…………………………
………………………………………………………………………………………
Soil respiration and its responses to soil moisture and temperature under different tillage systems in dryland maize fields
ZHANG Dingchen, CAI Dianxiong, DAI Kuai, et al (1916)
……………
………………………………………………………………………
Photosynthetic characteristics of soybean and salvia in an agroforestry system in the Hilly Region, Shangluo, China
PENG Xiaobang, ZHANG Shuoxin (1926)
…………………
…………………………………………………………………………………………
Regulation of exogenous brassinosteroid on growth and photosynthesis of Helianthus tuberosus seedlings and cadmium biological
enrichment under cadmium stress GAO Huiling, LIU Jinlong, ZHENG Qingsong, et al (1935)…………………………………
Calibration coefficients of Granier original formula based on sap flow of Platycladus orientalis
LIU Qingxin,MENG Ping, ZHANG Jinsong, et al (1944)
…………………………………………
…………………………………………………………………………
Research Notes
An evaluation index system classifying the conservation value of wetland nature reserves based on AHP
SUN Rui, CUI Guofa, LEI Ting, et al (1952)
………………………………
………………………………………………………………………………………
Root biomass and its distribution of Azadirachta indica and Acacia auriculiformis plantations in the Dry鄄hot Valley
GAO Chengjie, TANG Guoyong, LI Kun, et al (1964)
…………………
……………………………………………………………………………
Physiological response of Vitex trifolia to sand burial in the sand coast ZHOU Ruilian, WANG Jin, YANG Shuqin, et al (1973)…
Soil fertility under different forest types in the Helan and Liupan Mountain ranges of Ningxia Province
JIANG Lin, GENG Zengchao, ZHANG Wen, et al (1982)
………………………………
…………………………………………………………………………
Opinions
Dynamic of litterfall in ten typical community types of Xiaoxing忆an Mountain, China
HOU Lingling,MAO Zijun,SUN Tao, et al (1994)
…………………………………………………
…………………………………………………………………………………
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进生态学研究深入发展,为我国培养和造就生态学科研人才和知识创新服务、为国民经济建设和发展服务。
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第 33 卷摇 第 6 期摇 (2013 年 3 月)
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