全 文 ：
摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
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摇 摇 第 猿源卷 第 员园期摇 摇 圆园员源年 缘月摇 渊半月刊冤
目摇 摇 次
前沿理论与学科综述
景观可持续性与景观可持续性科学 赵文武袁房学宁 渊圆源缘猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
生态系统服务付费的诊断框架及案例剖析 朱文博袁王摇 阳袁李双成 渊圆源远园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
湿地植物根表铁膜研究进展 刘春英袁陈春丽袁弓晓峰袁等 渊圆源苑园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
水生生态环境中捕食信息素的生态学效应 覃光球袁卢豪良袁唐振柱袁等 渊圆源愿员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
脊椎动物传播植物肉质果中的次生物质及其生态作用 潘摇 扬袁罗摇 芳袁鲁长虎 渊圆源怨园冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
个体与基础生态
中亚热带天然林土壤 悦匀源吸收速率对模拟 晕沉降的响应 陈朝琪袁杨智杰袁刘小飞袁等 渊圆源怨愿冤噎噎噎噎噎噎
塔里木盆地南缘旱生芦苇生态特征与水盐因子关系 贡摇 璐袁朱美玲袁塔西甫拉提窑特依拜袁等 渊圆缘园怨冤噎噎噎
黄刺玫叶片光合生理参数的土壤水分阈值响应及其生产力分级 张淑勇袁夏江宝袁张光灿袁等 渊圆缘员怨冤噎噎噎噎
亚热带杉木和米老排人工林土壤呼吸对凋落物去除和交换的响应 余再鹏袁万晓华袁胡振宏袁等 渊圆缘圆怨冤噎噎噎
施钾提高蚜害诱导的小麦茉莉酸含量和叶片相关防御酶活性 王摇 祎袁张月玲袁苏建伟袁等 渊圆缘猿怨冤噎噎噎噎噎
高浓度 韵猿及太阳辐射减弱对冬小麦 孕杂域光合活性及光能耗散的影响
孙摇 健袁郑有飞袁吴荣军袁等 渊圆缘源愿冤
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蜡样芽孢杆菌 月猿鄄苑在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果
黄秋斌袁张摇 颖袁刘凤英袁等 渊圆缘缘怨冤
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有限供水下冬小麦全程耗水特征定量研究 张兴娟袁薛绪掌袁郭文忠袁等 渊圆缘远苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
抗真菌转基因水稻生态适合度评价 李摇 伟袁郭建夫袁袁红旭袁等 渊圆缘愿员冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
花生叶片蛋白组对 哉灾鄄月辐射增强的响应 杜照奎袁李钧敏袁钟章成袁等 渊圆缘愿怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
南海南部悬浮颗粒物脂肪酸组成 刘华雪袁柯常亮袁李纯厚袁等 渊圆缘怨怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
年龄尧集群尧生境及天气对鄱阳湖白鹤越冬期日间行为模式的影响 袁芳凯袁李言阔袁李凤山袁等 渊圆远园愿冤噎噎噎
咱树暂麻雀羽再生的能量预算和水代谢散热调节 杨志宏袁吴庆明袁杨摇 渺袁等 渊圆远员苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
低剂量杀虫剂对星豹蛛捕食效应的影响及其机理 李摇 锐袁李摇 娜袁刘摇 佳袁等 渊圆远圆怨冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
空心莲子草叶甲对越冬保护的响应与控害效能 刘雨芳袁王秀秀袁李摇 菲袁等 渊圆远猿愿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
种群尧群落和生态系统
气候变化对鄱阳湖白鹤越冬种群数量变化的影响 李言阔袁钱法文袁单继红袁等 渊圆远源缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
不同退耕年限下菜子湖湿地土壤磷素组分特征变化 刘文静袁张平究袁董国政袁等 渊圆远缘源冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
查干湖湿地浮游植物与环境因子关系的多元分析 李然然袁章光新袁张摇 蕾 渊圆远远猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
闽江河口区淡水和半咸水潮汐沼泽湿地土壤产甲烷菌多样性 曾志华袁杨民和袁佘晨兴袁等 渊圆远苑源冤噎噎噎噎噎
环境及遗传背景对延河流域植物叶片和细根功能性状变异的影响 郑摇 颖袁温仲明袁宋摇 光袁等 渊圆远愿圆冤噎噎噎
衡阳紫色土丘陵坡地植被恢复阶段土壤特性的演变 杨摇 宁袁邹冬生袁杨满元袁等 渊圆远怨猿冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎
海平面上升影响下广西钦州湾红树林脆弱性评价 李莎莎袁孟宪伟袁葛振鸣袁等 渊圆苑园圆冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
中国南方 猿种主要人工林生物量和生产力的动态变化 杜摇 虎袁曾馥平袁王克林袁等 渊圆苑员圆冤噎噎噎噎噎噎噎噎
杉木人工林土壤真菌遗传多样性 何苑皞袁周国英袁王圣洁袁等 渊圆苑圆缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
科尔沁固定沙地植被特征对降雨变化的响应 张腊梅袁刘新平袁赵学勇袁等 渊圆苑猿苑冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
黄土丘陵区退耕还林地刺槐人工林碳储量及分配规律 申家朋袁张文辉 渊圆苑源远冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
景观尧区域和全球生态
南亚热带森林演替过程中小气候的改变及对气候变化的响应 刘效东袁周国逸袁陈修治袁等 渊圆苑缘缘冤噎噎噎噎噎
黄淮海平原典型站点冬小麦生育阶段的干旱特征及气候趋势的影响 徐建文袁居摇 辉袁刘摇 勤袁等 渊圆苑远缘冤噎噎
资源与产业生态
基于 郧陨杂的山西省矿产资源规划环境影响评价 刘摇 伟袁杜培军袁李永峰 渊圆苑苑缘冤噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎噎
基于效益分摊的水电水足迹计算方法要要要以密云水库为例 赵丹丹袁刘俊国袁赵摇 旭 渊圆苑愿苑冤噎噎噎噎噎噎噎
学术信息与动态
全球土地计划第二次开放科学大会渊郧蕴孕 圆灶凿 韵责藻灶 杂糟蚤藻灶糟藻 酝藻藻贼蚤灶早冤会议述评 段宝玲袁卜玉山 渊圆苑怨远冤噎噎噎
期刊基本参数院悦晕 员员鄄圆园猿员 辕 匝鄢员怨愿员鄢皂鄢员远鄢猿源愿鄢扎澡鄢孕鄢 预 怨园郾 园园鄢员缘员园鄢猿远鄢圆园员源鄄园缘
室室室室室室室室室室室室室室
封面图说院 鄱阳湖越冬的白鹤群要要要白鹤为国家一级保护动物袁世界上白鹤东部种群的迁徙路线是从俄罗斯西伯利亚的雅库
特袁向南迁飞 缘员园园噪皂到中国长江下游的鄱阳湖越冬袁其中途经俄罗斯的雅纳河尧印迪吉尔卡河和科雷马河流域袁进
入中国后主要停歇地有扎龙尧林甸尧莫莫格以及双台河口尧滦河口尧黄河三角洲和升金湖等地遥 多年的监测表明袁世
界 怨园豫以上的白鹤种群都在鄱阳湖越冬遥 越冬初期和末期是白鹤补充能量的关键阶段袁因此袁研究鄱阳湖国家级自
然保护区越冬白鹤种群数量和当地气候变化的相关性具有重要意义遥
彩图及图说提供院 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 耘鄄皂葬蚤造院 糟蚤贼藻泽援糟澡藻灶躁憎岳 员远猿援糟燥皂
第 34 卷第 10 期
2014年 5月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.10
May,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(30771435,30971952,31200069);棉花生物学国家重点实验室开放课题(CB2013A27)
收稿日期:2013鄄07鄄22; 摇 摇 修订日期:2014鄄03鄄27
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: wangg@ henu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201307221929
黄秋斌,张颖,刘凤英,王淼,王刚.蜡样芽孢杆菌 B3鄄 7 在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果.生态学报,2014,34(10):
2559鄄2566.
Huang Q B, Zhang Y, Liu F Y, Wang M, Wang G.Colonization dynamics of Bacillus cereus B3鄄7 on wheat roots and control efficiency against sharp eyespot
of wheat.Acta Ecologica Sinica,2014,34(10):2559鄄2566.
蜡样芽孢杆菌 B3鄄 7在大田小麦根部的定殖动态
及其对小麦纹枯病的防治效果
黄秋斌1,张摇 颖1,刘凤英1,王摇 淼1,王摇 刚1,2,3,*
(1. 河南大学生命科学学院, 开封摇 475004; 2. 棉花生物学国家重点实验室, 开封摇 475004;
3. 河南大学生物工程研究所, 开封摇 475004)
摘要:为了阐明蜡样芽孢杆菌 B3鄄7在大田条件下的生态适应性以及对于小麦纹枯病的生防效果,通过利用绿色荧光蛋白编码
基因 gfp标记生防菌株 B3鄄7,室内比较了 GFP 标记菌株和原始出发菌株在菌落形态、生长特性,生物薄膜产生以及在小麦根部
定殖等方面的特性,结果发现 GFP 标记菌株和出发菌株在上述特性方面无明显差别。 在此基础上,大田条件下测定了 GFP 标
记菌株在小麦根部的定殖动态和对于小麦纹枯病的生防效果。 结果发现,GFP 标记菌株在小麦根部能够长期定殖,其存在量在
小麦分蘖期最大,每克根重达到 105 CFU,拔节期后,该细菌数量一直维持在 104 CFU之上。 同时发现,生防菌株能够有效降低
小麦纹枯病的严重度和提高罹病小麦的产量。 小麦分蘖期、孕穗期和灌浆期生防菌对于小麦纹枯病的防治效果分别达到 60%、
34%,34%,小麦成熟后产量提高 13%—15%。 结果表明,B3鄄7在大田条件下具有较好的生态适应性和防治小麦纹枯病的能力。
关键词:定殖;生物防治;小麦纹枯病;蜡样芽孢杆菌
Colonization dynamics of Bacillus cereus B3鄄7 on wheat roots and control
efficiency against sharp eyespot of wheat
HUANG Qiubin1, ZHANG Ying1, LIU Fengying1, WANG Miao1, WANG Gang1,2,3,*
1 College of life sciences, Henan University, Kaifeng 475004, China
2 State Key Laboratory of Cotton Biology,Henan University, Kaifeng 475004, China
3 Institute of Bioengineering, Henan University, Kaifeng 475004, China
Abstract: Sharp eyespot of wheat is caused by the fungus Rhizoctonia cerealis and is an important soil鄄Borne disease of
wheat worldwide. At present, no commercially cultivated disease resistant varieties are available to efficiently protect wheat
against infection by this pathogen. Control of the plant disease sharp eyespot currently relies on application of pesticides
such as Triadimefon and Validamycin; however, pesticides are expensive and pose serious health and environmental
hazards. Persistent application of pesticides can cause selection of pesticide resistant pathogenic fungi. Biological control is
an environmentally sound and effective means of reducing or mitigating plant diseases and the effects of plant pathogens
through the use of natural microorganisms. In the rhizosphere (on the plant root or in close vicinity to the root) bacteria are
abundant, most often organized in microcolonies. Bacteria in the rhizosphere, known as rhizobacteria, not only benefit from
the nutrients secreted by the plant root but also beneficially influence the plant in a direct or indirect way, resulting in
stimulation of plant growth. Among the beneficial microorganisms isolated from the rhizosphere, Bacillusspp. offer several
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advantages over fluorescent pseudomonads and other Gram鄄negative bacteria as seed inoculants for protection against root
pathogens. Bacillus spp. have a long shelf life because of their ability to form endospores and their unique mechanisms of
action as they can produce broad鄄spectrum antibiotics and compete for ecological niches against plant pathogenic fungi.
Bacillus cereus B3鄄7, a biological control strain isolated from the wheat rhizosphere, shows potential for control of sharp
eyespot and for efficient yield increase in wheat. To elucidate the ecological adaptability of B3鄄 7 and its efficacy for
biological control of sharp eyespot of wheat under field conditions, the green fluorescent protein (gfp) gene was inserted
into the B3鄄7 genome and a GFP鄄tagged B3鄄 7 strain was constructed. Colony shape, growth rate, biofilm formation and
colonization dynamics on wheat roots were analyzed with B3鄄 7 and the GFP鄄tagged strain in our laboratory. No significant
differences were obtained for any of the characteristics tested between the two strains. Colonization ability of the B3鄄7 GFP鄄
tagged strain on wheat roots was assessed under field conditions. The results indicated that the GFP鄄tagged strains could
persistently colonize the roots of wheat. The number of colonizing bacteria was highest during the tillering period at 105
CFU / g roots. The colonization number decreased to 104 CFU / g roots in the heading period, and persisted through the
milking period. Efficacy of B3鄄7 and the GFP鄄tagged strain as biological control agents against sharp eyespot of wheat was
also evaluated under field conditions. The results revealed that the two strains could reduce disease severity and effectively
increase the yield of wheat. The disease control efficacy of the two strains for sharp eyespot of wheat reached 60% to 62%,
34% to 39%, and 34% to 38% during the tillering, heading, and milking periods, respectively. The yield of wheat treated
with the biological control strain increased 13% to 15% compared with that of the untreated control. The results indicated
that Bacillus cereus B3鄄7 has the capacity for environmental adaptability and the potential to act as a biological control agent
against sharp eyespot of wheat under field conditions.
Key Words: colonization; biological control; sharp eyespot of wheat; green fluorescent protein
摇 摇 小麦纹枯病(sharp eyespot of wheat)是由植物病
原真菌禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis)侵染引起一
种分布广泛、危害严重的土壤传播病害。 病菌以菌
丝或菌核在土壤和病残体上越冬或越夏。 播种后开
始侵染为害[1]。 在田间发病过程可分 5 个阶段即冬
前发病期、越冬期、横向扩展期、严重度增长期及枯
白穗发生期。 一般使小麦减产 10%—20%,严重地
块减产 50%左右,个别地块甚至绝收。 由于目前尚
缺乏高抗小麦纹枯病的小麦品种,生产上对于该病
的防治主要通过施用化学农药如井冈霉素和粉锈宁
等方法,不仅提高了小麦生产成本,而且容易导致抗
药性菌株的出现,进一步降低化学药剂的防治效
果[2]。 因此,寻找一种有效的小麦纹枯病防治方法
成为小麦生产上的当务之急。
植物根际细菌(rhizobacteria)作为一类存在于植
物根际,对于植物生长发育具有重要作用的一类微
生物[3]。 大量的研究表明,根际细菌中存在包括荧
光假单胞菌、枯草芽孢杆菌、和蜡样芽孢杆菌等多种
能够控制植物病害发生的细菌类型[4鄄5]。 不同的微
生物可以通过产生抗菌物质、生态位与营养竞争以
及诱导植物产生抗性等多种机制发挥作用[6鄄7]。 利
用根际细菌防治植物病害,对于替代或者减少化学
农药的使用,促进农业的可持续发展具有重要价值。
植物病害生物防治的本质是植物、病原菌以及生防
微生物之间的相互作用,通过三者的互作,减少病原
菌对于植物的危害。 因此,利用根际微生物防治植
物病害的前提是这些微生物能够在植物根部有效定
殖并具有较好的环境适应性。 研究生防细菌的环境
适应性和在植物根部的定殖能力,有助于认识生防
细菌的作用机制,提高生防细菌的防治效果。 蜡样
芽孢杆菌 B3鄄7 菌株是作者前期研究过程中从健康
小麦根际分离得到的 1 株生防菌株[8鄄9]。 该菌株能
够产生多种抗菌物质,可以在固体基质表面产生大
量的有助于其存在的生物膜(biofilm),在温室测定
中能够在小麦根部稳定定殖且对于小麦纹枯病和小
麦全蚀病具有较好的生防效果。 该生防菌株在大田
条件下是否能够在小麦根部长期定殖以及是否对于
病害具有防治效果,有待于进一步研究。 因此,本研
究通过利用绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,
GFP)标记菌株,利用标记菌株测定了其在大田小区
0652 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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中在小麦根部的定殖和对小麦纹枯病的生物防治。
1摇 材料与方法
1.1摇 供试材料
1.1.1摇 供试菌株、质粒和培养条件
本研究供试植物病原真菌、生防细菌及其衍生
菌株和和质粒的特征及来源见表 1。 大肠杆菌
(Escherichia coli ) 和生防细菌蜡样芽孢杆菌
(Bacillus cereus ) 常规培养采用 LB 培养基,生物薄
膜测定采用 Standard succinate medium ( SSM)培养
基[6]。 试验用抗生素浓度为氨苄青霉素(Ampicillin,
Amp)100滋g / mL、红霉素(Erythromycin,Erm) 10滋g /
mL、利福平(Rifampin,Rfp)100 滋g / mL。 凝胶回收试
剂盒、内切酶、 T4 DNA 连接酶, Taq 酶等均购自
Fermentas 公司。
表 1摇 本研究中使用的细菌、真菌和质粒
Table 1摇 Bacterial, fungal strains and plasmids used in this study
菌株和质粒
Strain and plasmid
相关性状
Relevant characteristics
来源
Source
大肠杆菌
Escherichia coli GM2163 甲基化酶缺陷菌株,具有链霉素抗性。 Fermentas 公司
蜡样芽孢杆菌
Bacillus cereus
B3鄄7
B3鄄7 (驻amy::gfp)
小麦纹枯病生防菌株,具有利福平抗性 。
amy基因缺失菌株,具有绿色荧光蛋白编码基因
本实验室保存
本研究
禾谷丝核菌
Rhizoctonia cerealis 小麦纹枯病致病菌 本实验室保存
质粒
Plasmid
pMAD
pAD123
pMAD-驻amY
含有温度敏感复制子的穿梭载体.
不含 gfp基因启动子的穿梭载体
gfp插入到 amy基因的 pMAD 质粒
[10]
[11]
本研究
1.1.2摇 农田土壤条件和小麦品种
选用的农田为河南省夏邑县太平村的麦田,种
植制度为多年小麦鄄玉米轮作,土壤呈弱碱性( pH,
7郾 7),有机质 7—9 g / kg,全氮含量 0.7—0.85g / kg,全
磷含量 0.5—0.6g / kg,全钾含量 19.8—20.2g / kg,速
效磷 2 mg / kg,速效钾,137 mg / kg。 小麦品种为当地
大面积种植的矮抗 58。
1.2摇 生防菌株 B3鄄 7绿色荧光蛋白(GFP)标记菌株
的构建
根据 B3鄄7菌株 琢鄄淀粉酶编码基因 amY的核苷
酸序列设计设计引物,上游的一对引物分别是 amY鄄
up鄄S ( CCCAGGATCCTTTAAAAGAATAACAATAGTC,
划线部分为 BamH I 位点) 和 amY鄄up鄄A ( CCAA
AAGCTTCAAAATCAAGATCCGCATACA,划线部分为
Hind III位点),下游的一对引物分别是 amY鄄down鄄S
(CCCAAAGCTTTGCGAATGAAATGAAAAAATG,划线部
分 为 Hind III 位 点 ) 和 amY鄄down鄄A ( CAAA
GTCGACCTGCTGAACATATATGGAAAC,划线部分为
Sal I位点)。 利用引物 amY鄄up鄄S 和 amY鄄up鄄A 扩增
出 amY 基因上游片段,利用 amY鄄down鄄S 和 amY鄄
down鄄A扩增出 amY 基因下游片段,然后用内切酶
Hind III 分别酶切后,与同样用 Hind III 酶切质粒
pAD123得到的绿色荧光蛋白编码基因 gfp片段等浓
度混合,经 T4 连接酶连接后,用 amY鄄up鄄S 和 amY鄄
down鄄A扩增出插入 gfp 基因的 amY 基因片段,将此
片段用 BamH I和 Sal I 双酶切后,插入到穿梭载体
pMAD的对应位点内,构建 amY 基因的敲除载体
pMAD鄄驻amY,将此敲除载体转化进入生防菌 B3鄄 7
的电击转化感受态细胞,根据 Maryvonne 等[9]的方
法获得产淀粉酶缺陷并在蓝光照射下发出绿色荧光
的突变株。
1.3摇 生防菌株 B3鄄7及其 GFP 标记突变株生物学性
状比较
1.3.1摇 菌落形态和群体生长特性比较
分别将野生型 B3鄄 7及其 GFP 标记突变株接种
于液体 LB培养基中,于 30 益振荡(200 r / min)培养
24 h后,离心收集细菌,加入新鲜的 LB 液体培养基
中,调整浓度 OD600 = 0.1,用移液器分别取 2滋L 点接
1652摇 10期 摇 摇 摇 黄秋斌摇 等:蜡样芽孢杆菌 B3鄄7在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果 摇
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到 LB平板上,于 30益培养箱中培养 5 d,观察 B3鄄 7
及其 GFP 标记突变株菌落形态是否存在差别。 同
时,分别取 OD600 = 0.1 的菌液 300滋L 加入深孔培养
板中,然后将培养板至全自动生长曲线分析仪
(Bioscreen C),进行生长曲线测定(参数设置为:振
荡温度,30益;振荡时间,57 h;测定时间间隔,1 h;测
定吸光度 OD(530—580),比较 B3鄄 7及其 GFP 标记突变
株群体生长曲线是否存在差别。
1.3.2摇 生物薄膜形成能力比较
分别挑取野生型 B3鄄7菌株及其 GFP 标记菌株,
接种于液体 LB培养基中,30益、200 r / min 的摇床中
培养至对数期,用 LB 培养基分别稀释菌液至 OD600
= 0郾 1,取 20 滋L菌液加入到含有 2mL 培养基的玻璃
管中(直径 D = 0.8 cm),轻轻混匀后于 22益静止培
养 5 d,观察不同菌株在玻璃管内壁生物薄膜的形成
情况。 之后,轻轻吸去每个管中的菌液(注意不要触
碰管壁),向玻璃管中加入 1.5 mL 的蒸馏水,轻轻晃
动,再用枪头将蒸馏水吸出,反复清洗 3 次,去除管
底菌体,加入 2郾 5 mL 0.1%(w / v)的结晶紫溶液,室
温染色 20 min,吸去染色液,加入蒸馏水轻轻冲洗 3
次,直到水变为无色。 加入 2.5 mL 10% SDS,反复晃
动试管溶解生物薄膜,用 10% SDS稀释 5倍,吸取 2.
5 mL至比色皿中,以 2.5 mL 10% SDS 作为对照,测
定 OD590的光吸收值。 每个处理设置 8 个重复,试验
重复 3次。
1.3.3摇 室内条件下测定 B3鄄 7及其 GFP 标记菌株在
小麦根部的定殖状况
利用 LB液体培养基培养 B3鄄 7 及其 GFP 标记
菌株,离心去除上清后,加入 1%的羧甲基纤维素钠
(carboxymethyl cellulose,CMC),调整浓度至 OD600 =
1.5,将已经催芽的小麦种子(品种为中国春)浸入菌
液中 1 h,播种至盛有无菌土的一次性塑料杯中,每
个杯子中央播种 3粒种子。 将各个处理随机放入 22
益培养室内培养,待小麦出苗后,每隔 5 d取样,轻轻
抖掉麦苗所带的泥土并剪去地上部,分别称重后将
根放入定量的 0.1% Tween鄄 20 溶液中,剧烈振荡 3
min后梯度稀释并涂布含有利福平的 LB平板,30 益
培养 24 h后,统计平板菌落数,同时,在蓝光下观察
GFP 标记菌株的荧光菌落并计数,计算单位根重含
有的菌落数(CFU / g根)。 每个处理设置 15 个重复,
试验重复 3次。
1.4摇 GFP 标记菌株在大田小麦根部的定殖情况及
其对小麦纹枯病的防治效果
利用上年小麦纹枯病严重发病的麦田,从中选
取 15 m伊12 m(长伊宽)的区域设置试验小区,共设 9
个试验小区(纵横各 3 个小区)。 每个小区为 6 m2
(3m伊2m,长伊宽),小区与小区之间间隔 2 m,用于保
护行,小区的外侧设置 1 m 的距离用作保护行。 试
验设置 B3鄄7、GFP 标记菌株和阴性对照 3个处理,每
个处理设置 3 个重复,即每个小区为 1 个重复。 播
种时间为 10月上旬,播种前,利用 LB 液体培养基培
养细菌,经离心后,将细菌悬浮于 1% CMC 溶液中,
调整细菌浓度约至 109 CFU / mL,将麦种浸入菌液
1h,捞出麦种晾干后进行播种,播种量为 10 kg / 666.
7m2。 阴性对照和保护行小麦处理时,仅在不含有细
菌的 1% CMC浸种。 小麦出苗后,分别于冬前分蘖
期、越冬期、拔节期、孕穗期和灌浆期取样调查。 调
查小麦发病情况时,每个小区随机调查 100 株小麦,
根据 Clarkson和 Cook[12]的方法进行调查,统计病害
的严重度。 同时计算出不同时期的病害防治效果。
测定生防菌株的定殖数量时,从 GFP 标记菌株
处理的小区五点取样(3 个小区共 15 个取样点)。
每个取样点取 20 株小麦,轻轻地连根挖出小麦植
株,带土分别放入无菌牛皮纸袋中带回实验室,根据
1.3.3 所述的方法统计小麦根部 GFP 菌株的数量。
为了证实分离出的荧光菌株就是接种的 GFP 标记菌
株,从分离得到的荧光菌落中随机挑取部分菌落,利
用根据 B3鄄7基因组序列设计的两对特异引物进行
进行菌落 PCR,根据扩增结果判断分离菌落的正
确性。
2摇 结果与分析
2.1摇 生防菌 B3鄄7绿色荧光蛋白标记菌株的构建
为了测定 B3鄄 7 菌株在大田小麦根系的定殖动
态,需要构建能够区分土著微生物的标记菌株。 为
此,将绿色荧光蛋白(GFP)的编码基因 gfp插入到生
防菌的基因组中。 利用 PCR 对 琢鄄淀粉酶编码基因
amY阅读框内的上游和下游片段进行,成功扩增出
上游 711 bp的片段和下游 840bp 片段,经过序列测
定正确后,分别利用 Hind III 酶切上述两个片段,然
后与同样用 Hind III 酶切的 gfp 基因及其启动子片
段混合,经 T4连接酶连接后扩增出 2.5 kb的片段,将
2652 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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此片段插入穿梭载体 pMAD 中,构建成功 amY 基因
敲除载体 pMAD鄄驻amY(图 1)。 在此基础上,将敲除
载体 pMAD鄄驻amY转化进入 B3鄄 7菌株,通过热处理
和蓝白斑筛选等一系列步骤,获得基因双交换白色
菌落,该菌落在蓝光下发绿色荧光,经过多次传代后
菌落的荧光特性不发生改变,表明 GFP 标记菌株构
建成功(图 1)。
图 1摇 生防细菌 B3鄄7绿色荧光蛋白(GFP)标记突变菌株的构建
Fig.1摇 Construction of green flurescence protein (GFP) tagging mutant of biocontrol strain B3鄄7
a: 基因敲除载体图谱:绿色荧光蛋白编码基因 gfp 插入到 琢鄄淀粉酶编码基因 amY 之间 Map of gene knockout vector with green flurescence
protein encoding gene gfpinsertion within alpha鄄amylase encoding gene amY; b: GFP 标记菌株 GFP tagging strains
2.2摇 生防菌株 B3鄄7及其 GFP 标记突变株生物学性
状比较
图 2摇 生防细菌 B3鄄7及其 GFP标记突变株的群体生长曲线
Fig.2摇 Growth curves of biocontrol bacteria B3鄄 7 and its GFP
tagging mutant
2.2.1摇 菌落形态和群体生长状态比较
通过测定生防菌株 B3鄄 7及其 GFP 标记菌株在
LB培养基平板上菌落形态,发现两者之只是菌落颜
色方面存在差别,GFP 标记菌株呈现淡绿色,而野生
型 B3鄄7菌株为乳白色。 只有由于标记菌株 GFP 表
达的结果,其它形态特征如生长速度、菌落形态和菌
落大小等方面没有明显差别。 通过测定上述两个菌
株在 LB液体培养基内的群体生长,发现二者不存在
差别,在生长过程中表现出相同的迟缓期,对数生长
期和稳定期(图 2)。 上述结果表明 GFP 标记不影响
该细菌在固体基质和液体基质内的生长。
2.2.2摇 生防菌 B3鄄7及其 GFP 标记菌株的生物膜形
成能力
采用定性和定量测定相结合的方法测定了 B3鄄7
及其 GFP 标记衍生菌株在固体基质表面(试管内
壁)形成生物膜的能力,结果发现两者没有明显差异
(图 3)。 生物膜作为自然状态下微生物存在的方
式,微生物通过形成生物膜附着在固体基质表面,提
高对于环境胁迫的抗性,上述两个菌株在生物膜形
成方面不存在差异,表明 GFP 标记菌株可能与其野
生型具有相似的定殖能力。
2.2.3摇 室内条件下生防菌 B3鄄 7及其 GFP 标记菌株
在小麦根部的定殖能力
室内限菌条件下测定了生防菌 B3鄄 7 及其 GFP
标记菌株在小麦根部的定殖能力,结果发现二者均
能高效地在小麦根部定殖。 在测定的 30 d 内,随着
时间的延长,定殖数量总体呈现下降趋势,但是保持
在每克根重 105菌落形成单位(CFU)之上。 测定的
两个菌株之间无显著差异,表明 GFP 标记后至少在
3652摇 10期 摇 摇 摇 黄秋斌摇 等:蜡样芽孢杆菌 B3鄄7在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果 摇
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室内条件下不影响生防菌的定殖。 综合上述 GFP 标
记菌株的菌落形态、群体生长、生物膜形成以及在小
麦根部的定殖动态测定结果,认为 GFP 标记不影响
菌株的生物学特性。
图 3摇 生防细菌 B3鄄7及其 GFP标记突变株的生物薄膜形成
Fig 3摇 biofilm formation of biocontrol strain B3鄄7 and its GFP tagging mutants
a: 菌株在试管内壁形成的生物薄膜;A,B为 B3鄄7菌株,C,D为 B3鄄7(GFP)菌株 Biofilm formation on inner wall of glass tubes: A,B strains of
B3鄄7, C,D strains of B3鄄7(GFP); b: 生物薄膜的定量测定 Quantitative measure for biofilm formation
2.3摇 GFP 标记菌株在大田小麦根部的定殖动态
在室内测定生防菌 B3鄄 7菌株的 GFP 标记突变
体基本生物学特性的基础上,于 2002—2003 年测定
了该标记菌株在大田小区条件下在小麦根系的定殖
能力和对小麦纹枯病的生物防治效果。 结果发现,
小麦的整个生育期均能在小麦根部分离出发绿色荧
光的菌株,利用 PCR方法对发光菌株进行特异性扩
增,证明其为施用的 GFP 标记菌株(图 4)。 GFP 标
记菌株在小麦根部的定殖数量呈现明显的规律性,
即冬前分蘖期最多,每克根重的细菌数量达到 105
CFU,之后随着温度的降低,小麦进入越冬期,分离
出的 GFP 菌株数量达到最低,仅为 102 CFU,越冬后
小麦进入拔节期时,细菌数量虽然有所增加,但是与
越冬期没有明显的差别。 之后,随着温度的进一步
升高,小麦进入抽穗期和灌浆期,分离出的 GFP 标记
细菌迅速增加,到灌浆期时单位根重(g)的细菌数量
达到 104 CFU(图 5)。
图 4摇 大田小麦根部分离获得的 GFP标记菌株及其 PCR鉴定
Fig.4摇 PCR identification to GFP tagging strains isolated from roots of wheat grown in field
a: 绿色荧光菌落 Green fluorescent colonies; b: 绿色荧光菌落的 PCR 鉴定,泳道 A 和 A忆,B3鄄 7 的 GFP 标记菌株扩增出的 2 个特征片段;
Identification to green flurescent colonies by PCR: Lanes A and A忆 refer to two specific fragments amplified with GFP tagging mutant of strain B3鄄7;
泳道 B—H和 B忆—H忆,PCR鉴定随机挑选的 7个的荧光菌落 Lanes B to H and B忆 to H忆 refer to two specific fragments amplified with 7 strains
chosen randomized
2.4摇 GFP 标记菌株对大田小麦纹枯病的防治效果
分别于小麦冬前分蘖期、拔节期、孕穗期和灌浆
期调查大田不同小区施用生防菌 B3鄄 7及其 GFP 标
记菌株后小麦纹枯病的发病率和严重度,结果发现,
与不施用任何菌株的对照相比,施用 B3鄄 7及其 GFP
标记菌株后小麦纹枯病的发病率没有差别。 病害的
严重度除了在拔节期差别不明显外,在分蘖期、孕穗
期和灌浆期差异显著。 B3鄄 7 及其 GFP 标记菌株在
分蘖期、孕穗期和灌浆期对于小麦纹枯病的防治效
果分别为 60%—62%、34%—39%和 34%—38%,两
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图 5摇 GFP标记菌株在不同生育期小麦根部的定殖动态
Fig.5摇 Colonization dynamic of GFP tagging strain on roots of
different growth stages wheat
个菌株之间防病效果无明显差异。 病田通过施用生
防菌能够提高产量,B3鄄7菌株及其 GFP 标记菌株能
够提高产量 13%—15%(表 2)。
上述结果表明,GFP 标记后不改变生防菌 B3鄄 7
对于小麦纹枯病的防病效果,B3鄄 7通过降低病害的
严重度,增加小麦的产量,具有一定的应用前景。
3摇 讨论
植物在生长过程中,通过其根系向周围环境中
分泌大量的有机物,营造了适于微生物生长繁殖的
表 2摇 生防菌对于小麦纹枯病的防治效果
Table 2摇 Control efficacy to sharp eyespot of wheat by biocontrol bacteria
处理
Treatment
严重度 Severity
分蘖期
Tillering period
拔节期
Jointing stage
抽穗期
Heading period
灌浆期
Milking period
产量
Yield / (kg / 6m2)
B3鄄7 7.9 a 12.3 a 15.2 a 20.6 a 4.05依0.22
B3鄄7(GFP) 7.5 a 13.1 a 16.7 a 19.5 a 4.11依0.41
对照 Control 19.8 b 14.2 a 25.2 b 31.4 a 3.56依0.20
摇 摇 数据后不同小写字母表示差异显著(P<0. 05),产量为 3个试验小区产量的平均数依标准差
环境,导致大量微生物存活于于植物根部。 其中某
些根部细菌一方面利用根系分泌物获取营养,另一
方面通过其本身的代谢活动促进植物生长,这些细
菌被称为根际促生细菌 ( plant growth鄄promoting
rhizobacteria,PGPR)。 有研究表明,PGPR 可以通过
多种机制促进植物生长。 这些机制主要包括:1)促
生作用,某些种类的 PGPR能够通过生物固氮、产生
植物激素和解磷解钾等方式促进植物生长[6];2)抑
制有害生物对于植物的危害,PGPR可以通过产生抗
菌物质或者利用生态位和营养竞争作用减少包括植
物病原真菌在内的有害生物对于植物的危害,间接
促进植物生长[13];3)诱导植物产生对于逆境胁迫的
抗性,有些 PGPR 本身的细胞成分或者细胞分泌物
能够激发植物产生抗性,提高植物的对于逆境胁迫
的抗性[14]。 利用 PGPR 防治植物病害,尤其是土壤
传播病害对于替代化学农药的使用、减少抗药性病
原菌的产生、减少病害造成的损失和改善作物品质
具有重要价值。 国内外已有多种利用 PGPR 开发的
生物农药实现商业化应用[15]。
自然状况下,植物根际是一个复杂的生态环境,
不仅存在温度、湿度等环境因子的变化,而且不同微
生物之间存在营养和生态位竞争。PGPR生防菌株
发挥作用的前提是能够在植物根际长期定殖并形成
数量优势,这就需要生防菌株具有良好的生态适应
性。 芽孢杆菌作为一类在自然界中广泛存在的微生
物类型,其可以分泌多种胞外水解酶和抗菌物质,有
助于在竞争中获得优势[16]。 尤其重要的是,芽孢杆
菌可以在逆境胁迫下产生特殊的休眠结构芽孢,有
助于该类细菌在低温、高温和干旱等逆境条件下环
境中长期存在,待条件适宜时,芽孢萌发并快速分裂
形成大量个体,形成优势种群,促进其生防作用的发
挥。 本研究利用的 B3鄄7菌株是一株蜡样芽孢杆菌,
前期研究中发现在室内对于小麦纹枯病和小麦全蚀
病具有较好的生防效果。 该菌株已经授权国家发明
专利。 为了进一步解析该菌株在大田中的作用效
果,本研究利用广泛使用的标记蛋白 GFP 对其进行
标记。 通过比较标记菌株与 B3鄄 7的生物学特性,发
现 GFP 标记不改变生防菌的生物学特性和对于小麦
纹枯病的生防特性。 大田小区实验不仅证明了生防
菌株具有较强的适应性,而且证明了生防菌株 B3鄄 7
在大田条件下也对病害具有防治效果,为进一步开
发生防制剂奠定了基础。 本研究仅仅是单点小区试
验,对于 B3鄄 7在其它不同气候条件下的生态适应性
和对病害的防治效果,有待进一步研究。
5652摇 10期 摇 摇 摇 黄秋斌摇 等:蜡样芽孢杆菌 B3鄄7在大田小麦根部的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治效果 摇
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References:
[ 1 ] 摇 Han Y P,Chen X L,He Z T,Wang J R,Yang H F. Progress,
problem and prospect of wheat sharp eyespot research. Journal of
Triteceae Crops,2001,21(1): 81鄄84.
[ 2 ] 摇 Wen C Y,Wang K X,Wang M,Wang N,Wu Z. Colonization
trends of endophytic bacteria EBS05 in wheat and its control effect
on wheat sharp eyespot. Acta Phytophylacica Sinica, 2011, 38
(6):481鄄486.
[ 3 ] 摇 Jetiyanon K, Fowler W D, Kloepper J W. Broad鄄spectrum
protection against several pathogens by PGPR mixtures under field
conditions in Thailand. Plant Disease, 2003,87(11):1390鄄1394.
[ 4 ] 摇 Raupach G S, Kloepper J W. Biocontrol of cucumber diseases in
the field by plant growth鄄promoting rhizobacteria with and without
methyl bromide fumigation. Plant Disease, 2000, 84 ( 10 ):
1073鄄1075.
[ 5 ] 摇 Myoungsu P,Chungwoo K,Jinchul Y,Hyoungseok L,Wansik S,
Seunghwan K, Tongmin S. Isolation and characterization of
diazotrophic growth promoting bacteria from rhizosphere of
agricultural crops of Korea. Microbiological Research,2005,160
(4):127鄄133.
[ 6 ] 摇 Jos M R,Maria V, Jorge T. Antibiotic production by bacterial
biocontrol agents. Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 81 ( 1 ):
537鄄547.
[ 7 ] 摇 Niranjan R S,Chaluvaraju G,Amruthesh K N,Shetty H S,Reddy
M S,Kloepper J W. Induction of growth promotion and resistance
against downy mildew on pearl millet (Pennisetum glaucum) by
rhizobacteria. Plant Disease,2003,87(4):380鄄384.
[ 8 ] 摇 Wang G, Liu F Y, Wang M, Peng L. Motility of endophytic
bacteria strain B3鄄 7 involved in endophytic colonization of wheat
roots and biological control of wheat take鄄all. Acta
Phytopathologica Sinica,2011,41(5):526鄄533.
[ 9 ] 摇 Sun Y N. Construction of transposon inserted mutant library with
wheat endophytic bacillus and selection of mutants antagonism
against Rhizoctonia cerealis [ D ]. Kai Feng: Henan
University,2010.
[10] 摇 Maryvonne A,Arnaud C,Michel D. New vector for efficient allelic
replacement in naturally nontransformable, low鄄GC鄄content,gram鄄
positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 2004,
70(11):6887鄄6891.
[11] 摇 Dunn A K, Handelsman J. A vector for promoter trapping in
Bacillus cereus.Gene, 1999,226(2): 297鄄305.
[12] 摇 Clarkson J D, Cook R J. Effect of sharp eyespot ( Rhizocionia
cerealis) on yield loss in winter wheat. Plant Pathology,1983,32
(4):421鄄428.
[13] 摇 Handelsman J,Stabb E V. Biocontrol of soilborne plant pathogens.
The Plant Cell, 1996,8(10):1855鄄1869.
[14] 摇 Dutta S,Mishra A K,Kumar B S. Induction of systemic resistance
against fusarial wilt in pigeon pea through interaction of plant
growth promoting rhizobacteria and rhizobia. Soil Biology &
Biochemistry,2008,40(2):452鄄461.
[15] 摇 Borneman J,Becker J O. Identifying microorganisms involved in
specific pathogen suppression in soil. Annual Review of
Phytopathology,2007,45:153鄄172.
[16] 摇 Viviana Y,Houda Z,Inmaculada V,Rosario T,Josep U,Antonio
V,Alejandro P, Neus T. Biological control of peach brown rot
(Monilinia spp.) by Bacillus subtilis CPA鄄 8 is based on
production of fengycin鄄 like lipopeptides. European Journal of
Plant Pathology,2012,132(11):609鄄619.
参考文献:
[ 1 ] 摇 韩月澎,秀兰,何震天,王锦荣,杨鹤峰. 小麦纹枯病研究现状,
问题与展望. 麦类作物学报,2001,21(1):81鄄84
[ 2 ] 摇 文才艺,王凯旋,汪敏,王努,武哲. 内生细菌 EBS05在小麦体
内的定殖动态及其对小麦纹枯病的防治作用.植物保护学报,
2011,38(6):481鄄486.
[ 8 ] 摇 王刚,刘凤英,王淼,彭玲. 内生细菌 B3鄄 7的运动性参与其在
小麦根系的内生定殖和对小麦全蚀病的生物防治. 植物病理
学报,2011,41(5):526鄄533.
[ 9 ] 摇 孙勇娜. 小麦内生芽孢杆菌插入突变体库的构建及其对禾谷
丝核菌拮抗能力变异突变体的筛选 [ D]. 开封:河南大
学,2010.
6652 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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叶生态学报曳圆园员源年征订启事
叶生态学报曳是由中国科学技术协会主管袁中国生态学学会尧中国科学院生态环境研究中心主办的生态学
高级专业学术期刊袁创刊于 员怨愿员年袁报道生态学领域前沿理论和原始创新性研究成果遥 坚持野百花齐放袁百家
争鸣冶的方针袁依靠和团结广大生态学科研工作者袁探索生态学奥秘袁为生态学基础理论研究搭建交流平台袁
促进生态学研究深入发展袁为我国培养和造就生态学科研人才和知识创新服务尧为国民经济建设和发展服务遥
叶生态学报曳主要报道生态学及各分支学科的重要基础理论和应用研究的原始创新性科研成果遥 特别欢
迎能反映现代生态学发展方向的优秀综述性文章曰研究简报曰生态学新理论尧新方法尧新技术介绍曰新书评价和
学术尧科研动态及开放实验室介绍等遥
叶生态学报曳为半月刊袁大 员远开本袁圆愿园页袁国内定价 怨园元 辕册袁全年定价 圆员远园元遥
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标准刊号院陨杂杂晕 员园园园鄄园怨猿猿摇 摇 悦晕 员员鄄圆园猿员 辕 匝
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通讯地址院 员园园园愿缘 北京海淀区双清路 员愿号摇 电摇 摇 话院 渊园员园冤远圆怨源员园怨怨曰 远圆愿源猿猿远圆
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本期责任副主编摇 祖元刚摇 摇 摇 编辑部主任摇 孔红梅摇 摇 摇 执行编辑摇 刘天星摇 段摇 靖
生摇 态摇 学摇 报渊杂匀耘晕郧栽粤陨摇 载哉耘月粤韵冤渊半月刊摇 员怨愿员年 猿月创刊冤
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编摇 摇 辑摇 叶生态学报曳编辑部
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主摇 摇 编摇 王如松
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