全 文 ：第 34 卷第 20 期
2014年 10月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol.34,No.20
Oct.,2014
http: / / www.ecologica.cn
基金项目:国家自然科学基金(31070005, 31270057); 中央高校基本科研业务费专项资金资助(DC12010103)
收稿日期:2013鄄03鄄24; 摇 摇 修订日期:2014鄄08鄄02
*通讯作者 Corresponding author.E鄄mail: liuqiu@ dlnu.edu.cn
DOI: 10.5846 / stxb201303240500
于基成, 刘秋, 邵阳, 刘长建, 闫建芳, 齐小辉.大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性.生态学报,2014,34(20):5896鄄5906.
Yu J C,Liu Q,Shao Y, Liu C J, Yan J F, Qi X H.Activity and diversity of culturable Streptomyces isolated from marine sediments of sea areas of Dalian.
Acta Ecologica Sinica,2014,34(20):5896鄄5906.
大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性
于基成, 刘摇 秋*, 邵摇 阳, 刘长建, 闫建芳, 齐小辉
(大连民族学院 生命科学学院, 大连摇 116600)
摘要:以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和尖孢镰刀枯萎病菌作为测试靶目标,采用 9种分离培养基从大连海域 13个不同采样点的
海洋沉积物样品中分离到 165株海洋链霉菌。 从 165株海洋放线菌中筛选到对金黄色葡萄球菌具有抑制活性的菌株 85株,占
总菌株数的 51.5%;对大肠杆菌具有抑制活性的菌株 27株,占总菌株数的 16.4%;对尖孢镰刀枯萎病菌具有抑制活性的菌株仅
有 6株,占总菌株数的 3.6%。 因此,海洋链霉菌的活性更多地表现为对细菌的抗性,尤其对革兰氏阳性细菌具有更高的抑制活
性。 对其中具有抑制活性或形态独特的菌株进行了 16S rDNA序列分析,并构建系统发育树,显示活性海洋链霉菌具有丰富的
种类多样性和广谱抗菌活性。 同种海洋链霉菌与土壤链霉菌活性比较结果也表明,海洋链霉菌多表现抗革兰氏阳性细菌活性。
关键词:海洋链霉菌; 种群多样性;活性
Activity and diversity of culturable Streptomyces isolated from marine sediments
of sea areas of Dalian
YU Jicheng,LIU Qiu*,SHAO Yang, LIU Changjian, YAN Jianfang, QI Xiaohui
Dalian Nationalities University, College of Life Science, Dalian 116600, China
Abstract: Actinomycetesare an important source of microorganisms used in medicine. Tens of thousands of biologically
active substances of microbial origin have been found, about 45% of which are produced by actinomycetes. The marine
environment has high salinity, high pressure, low temperature, low nutritive content and other characteristics, so that the
population characteristics and metabolic pathways of marine actinomycetes are different from those of terrestrial
actinomycetes, and can be a source of novel species and metabolites. In total, 165 antimicrobial isolates were screened
from13 marine sediment samples collected in the seas around Dalian using nine different media. The results showed that
improved humic acid vitamin agar medium (HV鄄2) and glycerol arginine agar medium (M2) were the best types of medium
for isolating marine actinomycetes, followed by improved LSE鄄SE鄄2 agar medium (LSE鄄SE鄄2) and oat agar medium (OM).
Using agar block methods, the antagonistic activity of the 165 strains against three pathogens (Fusariumoxysporium f sp.
cucumarinum, Staphylococcus aureus and Escherichia coli) was analyzed in vitro. Among the 165 isolates, 95 strains showed
antagonistic activity against these three test pathogens. Of the 165 isolates, 85 (51.5%) strains showed activity against S.
aureus. The diameter of the inhibition zone of four of the 85 strains was more than 30 mm; 27 strains (16.4% of the total
isolates)showed activity against E. coli, and the diameter of the inhibition zone of strains YH6 and YH21 against E. coli was
more than 27mm. Six strains (M95, M108, HV14, HL9, HE16,HE66), 3. 6% of the total isolates, showed activity
against F. oxysporumf sp. cucumarinum. The results indicated that marine actinomycetes often show antagonistic activity
against bacteria, especially Gram鄄positive bacteria.Meanwhile, 16S rDNA sequences of interesting strains with either special
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phenotypes or strong antimicrobial activity were analyzed.Phylogenetic analysis using 16S rDNA sequencing revealed that
marine Streptomyces showed abundant species diversity and broad activity. Apart from the hygroscopicus group,95 marine
Streptomyces showed antagonistic activity covering all groups of Streptomyces. The 95 marine Streptomyces belong to different
groups such as the roseosporusgroup, golden group, albosporus group, cinereus group, yellow group, blue group,
lavendulae group, black group, griseorubroviolaceus group, griseofuscus group and green group. According to the SciFinder
substances library, the biological activity of recorded species from the NCBI library, which had sequences approximately
homologous to the 95 marine Streptomyces isolates, was analyzed. The 95 marine Streptomyces showed bioactivity, but 23
strains among the recorded species failed to exhibit activity against the pathogens. Meanwhile, 13 isolates from the 95
marine Streptomyces exhibited bioactivity, whereas the 13 corresponding recorded species failed to exhibit activity. This
suggested that different habitats give the same species different activities. The same species isolated from marine sediments
and soil showed different activities. Streptomyces species from marine sediments often showed antagonistic activity against
Gram鄄positive bacteria, and had low antagonistic activity against fungi and Gram鄄negative bacteria.Through the analysis of
the antagonistic activity of marine Streptomyces,the results will help researchers to improve our understanding of microbial
diversity,and the isolates obtained will also help us to search for metabolites with novel activity.
Key Words: marine Streptomyces; species diversity; activity
摇 摇 放线菌是一类非常重要的药源微生物,目前已
发现的数万种微生物来源的生物活性物质中,约有
45%是由放线菌产生的[1]。 海洋环境所具有的高盐
度、高压、低温和低营养等特点,因此海洋放线菌具
有不同于陆生放线菌的种群特点和独特的代谢途
径,使其成为新型放线菌和放线菌代谢产物的重要
新资源[2鄄3]。
自从 1926 年 Aronson 首次描述了海洋放线菌
Mycobacterium marinum 新种开始,人们陆续从海洋
环境中分离筛选到多种海洋放线菌[4]。 但筛选到的
海洋放线菌仍和陆地放线菌相似,以 Streptomyces、
Micromonospora和 Rhodococcus 数量最多。 尤其是海
洋链霉菌,仍是海洋放线菌中的主要类群。 近年来
的研究也表明,从海洋放线菌中发现结构新颖并具
有强生理活性的物质已达 100 多个,其中 90%以上
产生于链霉菌属[5]。 但目前对海洋放线菌活性的研
究多集中筛选新型放线菌种群或针对某一菌株进行
活性代谢产物的分离纯化、结构分析以及功能性评
价等,以期获得新型化合物。 但对海洋放线菌整体
活性的统计分析报道较少。 本文以海洋链霉菌作为
研究对象,分别以植物病原真菌、革兰氏阴性和阳性
细菌作为指示菌,通过对海洋链霉菌活性分析,拟分
析海洋链霉菌的抑菌活性特点,为目标性开发利用
海洋放线菌资源奠定基础。
1摇 材料与方法
1.1摇 样品的采集
于大连的泊石湾、王家庄、杏树屯、小窑湾、大连
湾、拉树房、毛莹子、庄河花园村、龙王塘西村附近海
域,采用抓斗式采样器采集海洋沉积物样品。 采集
后的样品用冰盒保存并立即带回实验室进行海洋放
线菌菌株的分离。
1.2摇 抗菌活性筛选指示菌及土壤链霉菌
分别以大肠杆菌(Escherichia coli),金黄色葡萄
球菌(Staphyloccocus aureus)和尖孢镰刀菌(Fusarium
oxysporum F. sp. cucumarinum)作为指示菌。 所有指
示菌均来自于大连民族学院生命科学学院放线菌资
源与应用实验室。 试验所用土壤链霉菌(表 1)菌株
编号分别为 H86、 K1、 LQ1、 LQ23、 LQ37、 LQ69、
LQ137、M3、M5、V6、R11、高 30 和高 F-9,均为大连
民族学院生命科学学院放线菌资源与应用实验室分
别从温室土壤和大田作物土壤分离筛选及鉴定
获得。
1.3摇 分离培养基及海洋放线菌的分离
以常用的陆生和海洋放线菌分离培养基作为基
础培养基[6鄄8],并进行适当的改良。 各种培养基的配
方见表 1。 分别称取各海洋沉积物样品 5 g,转入装
有 45 mL无菌天然海水的 150 mL三角瓶中,将三角
瓶置 55 益水浴锅中加热 6 min。 然后采用稀释分离
7985摇 20期 摇 摇 摇 于基成摇 等:大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性 摇
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法分别涂布于 9种培养基上。 28 益下培养 5—15 d。
根据菌落形态,挑选类似链霉菌的菌株,分别初步统
计各培养基中分离获得的链霉菌菌株数目。
1.4摇 放线菌 16SrRNA基因序列分析
根据形态差异,对分离获得的放线菌通过 16S
rRNA基因序列分析进行初步鉴定。 采用微波法提
取分离到的放线菌基因组 DNA,PCR 扩增后,进行
16S rRNA基因序列分析。 所用引物为细菌通用引
物[9],由上海生工合成。
F27: 5忆鄄AGAGTTTGATCCT GGCTCAG鄄3忆;
R1492: 5忆鄄TACCTTGTTACGAC TT鄄3忆。
1.5摇 可培养海洋放线菌的抗菌活性筛选
将分离的海洋放线菌分别接种于用天然海水和
蒸馏水配制的高氏玉号培养基,28 益培养 10—14 d
(不同菌株的培养时间不同),用打孔器切下直径约
为 1 cm菌饼,测定其抑菌活性[10]。 细菌在 37益培
养 24h,真菌在 28 益培养 72 h 后,观察并测量抑菌
圈直径的大小,进行记录。
1.6摇 海洋链霉菌的活性比较
1.6.1摇 不同种海洋链霉菌的活性分析
参照 1.5抗菌活性测定方法,比较海洋链霉菌的
抑菌活性。
表 1摇 海洋放线菌分离培养基
Table 1摇 Isolation medium for marine actinomyces
培养基名称 Medium name 培养基组分 Medium components
高氏玉号培养基
Gause No.1 medium (GM)
可溶性淀粉 20 g,KNO3 1 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,FeSO40.01 g,琼脂 20 g,天然海水
定容至 1000 mL,pH 7.2
甘油精氨酸培养基
Glycerol arginine medium (M2)
甘油 5 mL, 精氨酸 0.5 g, K2HPO4 1 g, MgSO40.5 g, 琼脂 18 g,天然海水定容至
1000 mL,pH 7.2
M13培养基
M13 medium
酵母浸出粉 4 g,可溶性淀粉 15 g,K2HPO41 g,MgSO40.5 g,琼脂 18 g,天然海水定
容至 1000 mL,pH 7.2
燕麦琼脂培养基
Oat agar medium (OM) 燕麦粉 20 g,微量盐溶液 1 mL,琼脂 18 g,天然海水定容至 1000 mL,pH7.2
葡萄糖天冬氨酸培养基
Glucose aspartic acid medium (GAM)
葡萄糖 10 g,天冬氨酸 0.5 g,K2HPO4 0.5 g,琼脂 15 g,天然海水定容至 1000 mL,
pH 7.2
腐殖酸维生素培养基
Humic acid vitamin medium (HV鄄1)
腐殖酸 1. 0 g,CaCO3 0. 02 g,Na2 HPO4 0. 5 g,MgSO4 ·7H2 O 0. 5 g,KCl 1. 7 g,
FeSO 4·7H2O 0.01 g,VB母液 1 mL,天然海水定容至 1000 mL,pH 7.2
改良腐殖酸维生素培养基
Improved humic acid vitamin medium (HV鄄2)
虾皮壳 2 g,腐殖酸 1 g,CaCO3 0.02 g,Na2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 1.7
g,FeSO 4·7H2O 0.01 g,VB母液 1 mL,天然海水定容至 1000 mL,pH 7.2
改良 LSE鄄SE鄄1培养基
Improved LSE鄄SE medium鄄1 (LSE鄄SE鄄1)
虾皮壳 2 g, CaCO3 0.02 g,Na2HPO40.5 g,MgS04·7H2O 0.5 g,KCl 1.7 g,FeSO 4·
7H2O 0.01 g,VB母液 1 mL,天然海水定容至 1000 mL,pH 7.2
改良 LSE鄄SE鄄2培养基
Improved LSE鄄SE medium鄄2 (LSE鄄SE鄄2)
虾皮壳 2 g,豆饼粉 0.2 g,CaCO3 0.02 g,Na2HPO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl
1郾 7 g,FeSO 4·7H2O 0.01 g,VB母液 1 mL,天然海水定容至 1000 mL,pH 7.2
摇 摇 VB母液:维生素 B1、核黄素、烟酸、维生素 B6、肌醇、泛酸、对氨基苯酸各 0.1 g,生物素 0.05 g,去离子水定容至 100 mL;微量盐溶液:FeSO4·
7H2O 、MnCl2· 4H2O、 ZnSO4各 0.1 g,去离子水定容至 100 mL
1.6.2摇 活性海洋链霉菌物种系统发育分析
将有抗菌活性的放线菌的 16S rDNA PCR 扩增
产物测序,测序结果提交到 NCBI 的 GeneBank 数据
库,并利用 Blast软件和 MEGA软件构建活性海洋放
线菌及其相似种的系统发育树,分析具有活性海洋
放线菌种群多样性。 同时,利用 SciFinder 物质数据
库查询同源种的生物活性物质情况,分析获得的海
洋链霉菌潜在的生物活性物质。
1.7摇 同种海洋链霉菌与土壤链霉菌的活性比较
按照 1.5抗菌活性测定方法,比较本实验分离到
的海洋链霉菌和来自土壤的同种链霉菌的抑菌活
性。 同时以 50%海水配制的高氏玉号培养基培养土
壤链霉菌后,以同种的海洋链霉菌为对照,比较其抑
菌活性。 分析相同培养条件下同种不同来源的链霉
菌的抑菌活性。
2摇 结果与分析
2.1摇 不同培养基对海洋放线菌的分离效果
利用 9 种培养基共分离获得放线菌 165 株(图
1)。 结果表明,分离效果较好的培养基是改良 LSE鄄
SE 鄄2培养基(LSE鄄SE鄄2)和燕麦琼脂培养基(OM)。
但细菌在这两种培养基上生长迅速,影响后期放线
菌的分离纯化。 培养基甘油精氨酸培养基(M2)中
有放线菌偏好的两种营养成分甘油和精氨酸,分离
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效果也较好,且污染较少。 培养基改良腐殖酸维生
素培养基(HV鄄 2)分离的放线菌数目较 LSE鄄SE鄄 2
少,但培养基受污染程度小,放线菌的检出率最高,
是一种高效的分离培养基。 高氏玉号培养(GM)、葡
萄糖天冬氨酸培养基(GAM)和腐殖酸维生素培养
基(HV鄄1)也获得一定量的放线菌种群。 HV鄄 1、M13
培养基上只分离到了少量海洋放线菌。 因此, HV鄄 2
和 M2是两种高效分离海洋放线菌的培养基,其次为
LSE鄄SE鄄2和 OM培养基。
图 1摇 不同培养基对海洋放线菌的分离效果
Fig.1摇 The separation effect for marine actinomyces on
different medium摇
图中字母均为各培养基名称简写,如 GM 为高氏玉号培养基名
称简写,其余与表 1所列培养基一致
2.2摇 放线菌的初步鉴定
根据形态特征及其放线菌的 16S rDNA 基因序
列分析,经排重,共获得 165 株放线菌,其中 7 株为
拟诺卡氏菌(Nocardiopsis sp.),其余 158 株全部为链
霉菌,部分菌株 NCBI 登录号为 HQ696525—HQ696549,
HM007148—HM007161, HM209312—HM209318。
2.3摇 可培养海洋放线菌的抗菌活性分析
采用琼脂块法对分离到的海洋放线菌分别进行
抗金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及尖孢镰刀菌活性
试验,结果表明,分离获得的 158 株海洋链霉菌中,
95株菌株分属不同的链霉菌种,且表现不同的抗菌
活性。 不同种的链霉菌中,85 株放线菌对金黄色葡
萄球菌具有抗菌活性,占总分菌数的 51.5%;其中抑
菌圈直径大于 30 mm 的菌 4 株。 27 株放线菌对大
肠杆菌具有抗菌活性,占总分菌数的 16.4%。 其中
抑菌圈直径为 27 mm 的菌株编号分别为 YH6 和
YH21,对尖孢镰刀菌有活性的菌株分别为 M95、
M108、HV14、 HL9、 HE16、 HE66,仅占总分菌数的
3郾 6%。 由图 2可见,海洋放线菌更多地显示抗金黄
色葡萄球菌的活性,且高活性菌株也多表现抗金黄
色葡萄球菌。 另外,27 株表现抗大肠杆菌活性的菌
株中有 23株同时表现抗革兰氏阳性菌活性,6 株抗
尖孢镰刀菌活性的菌株也均同时具有抗革兰氏阳性
菌活性。
图 2摇 海洋放线菌对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及尖孢镰刀菌
抑菌活性比较
Fig.2摇 Antagonism comparison of marine actinomyces against
F. oxysporium f sp. cucumarinum, S.aureus and E. coli
2.4摇 活性海洋放线菌的系统发育分析
以上述拮抗放线菌及再利用 Blast 软件从
GenBank,EzTaxon server 2.1数据库中搜索出的亲缘
关系近的已报道菌株为基础,分别构建不同拮抗活
性菌株的系统发育树,分析拮抗海洋放线菌多样性
(图 3和图 4)。 可以看出,拮抗海洋放线菌涵盖链
霉菌各个类群如粉红孢类群、金色类群、白孢类群、
烬灰类群、黄色类群蓝色类群、淡紫灰类群、青色类
群、灰红紫类群、灰褐类群和绿色类群,而 7 种拟诺
卡氏菌独立成支。
同时,根据各分离菌株的 16S rDNA 序列及其生
理生化特性,确定各分离菌株的同源近似种(表 2)。
结合分离菌株对革兰氏阴性细菌、阳性细菌和植物
病原真菌的抑菌活性测定结果,比较 SciFinder 物质
数据库报道的各同源近似种的生物活性。 结果表
明,95株分离菌株中具有抑菌活性,而其同源近似种
未见活性报道的有 24 株。 在 24 株分离菌株中,其
中 23株均表现抑制金黄色葡萄球菌活性,且 10 株
同时表现抑制大肠杆菌活性;菌株 PH26仅表现抑制
大肠杆菌活性,菌株 M95、HE66 同时表现抑制尖孢
镰刀菌活性,HV14 对 3 种指示菌均表现抑菌活性
(表 2)。 在 95株分离菌株中,其近似同源种报道具
有生物活性,而分离菌株未检测出相应活性的有 13
株,近似同源种报道的具有抑制革兰氏阴性菌活性,
而分离菌株未检出相应活性的 9 株,同源近似种报
道的具有抑制丝状真菌活性,而分离菌株未检出相
9985摇 20期 摇 摇 摇 于基成摇 等:大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性 摇
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应活性的 2株(HE11、HE71)。
图 3摇 拮抗大肠杆菌的海洋放线菌种群多样性分析
Fig.3摇 Species diversity analysis of antagonistic marine actinomyces against E. coli
图中字母+数字如 M10、YH21等为分离的海洋放线菌菌株编号
表 2摇 分离菌株及其相似菌株的同源性分析和活性比较
Table 2摇 Homology analysis and activity comparison for isolates and similar strains
菌株名称
Strain name
分离菌株的抑菌活性*
Antagonism activity of isolates
Es吟 St Fu
同源近似种
Homologous species
相似率 / %
Similarity
rate
同源种的生物活性*
Bioactivity of homologous species
HA1 30 S.malachitofuscus 99.156 抑制金黄色葡萄球菌
HA2 39 S.diastaticus 100.000 拮抗性有限,轻度抑制芽孢杆菌
HA5 37 S.matensis 98.875 产生抗革兰氏阳性菌的马塔霉素(Matamycin)
HA9荫 S.corchorusii 100.00 抑制真菌、革兰氏阳性菌
HA14 S.mexicanus 99.697 未见报道
HA15 S.tricolor 99.789 未见报道
HB2 S.coerulescens 99.472 抑制小球藻
HB3# 10 S.sampsonii 99.699 未见活性报道
HB12荫 S.violaceoruber 100.00 抑制革兰氏阳性菌、阴性菌
HB13# 11 S.sannanensis 99.328 未见活性报道
HB14荫 S.toxytricini 99.925
抑制金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、白色假丝酵
母、颗粒青霉
HB21荫 S. flavotricini 100.00 强烈抑制革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母菌和丝状真菌
HC5 S.ciscaucasicus 100.000 未见报道
HC7荫 S.atrovirens 98.140 抑制革兰氏阳性菌
HC9# 22 S.coerulescens 99.925 抑制小球藻
HC10 S.violaceochromogenes 100.00 抑制革兰氏阳性菌和大肠杆菌
HC12 20 S.flavotricini 98.883 强烈抑制革兰氏阳性菌、阴性菌、酵母菌和丝状真菌
0095 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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续表
菌株名称
Strain name
分离菌株的抑菌活性*
Antagonism activity of isolates
Es吟 St Fu
同源近似种
Homologous species
相似率 / %
Similarity
rate
同源种的生物活性*
Bioactivity of homologous species
HC13荫 S.collinus 99.925 产生抑制革兰氏阳性菌的覆盖霉素(Collinomycin)
HR10 13 24 S.venezuelae 100.000
多种活性,产生氯霉素 ( Chloramphenicol)、核酸霉素
(Rinamycin)、去氧核酸霉素(Derinamycin)、双氢苦霉素
(Dihydropicromycin)和莱马杀菌素(Lemacidin)
HR13荫 S.violaceoruber 100.000 抑制革兰氏阳性菌、阴性菌
HS1 S.violaceorubidus 99.851 未见报道
HS5 16 S.pilosus 100.00 具有拮抗作用
YH2 18 S.cyaneofuscatus 99.225 抑制革兰氏阳性细菌
YH6 27 17 S.griseoplanus 99.857 抑制革兰氏阳性 \阴性细菌和肉瘤,产生新碱性抗生素SF鄄1739
YH17 17 S.lateritius 98.967 强抑制革兰氏阳性细菌
YH21# 27 32 S.hyderabadensis 99.033 未见活性报道
YH23 17 29 S.afghaniensis 99.364 产生抑制革兰氏阳性菌的泰东霉素(Taitomycin)
YH37# 12 21 N. flavescens 100.00 未见活性报道
YH66# 11
S.phaeogriseichroma鄄
togenes 97.994 未见活性报道
YH58 14 S.resistomycificus 99.152 产生抑制革兰氏阳性细菌、 分枝杆菌的拒霉素(Resistomycin)
YH68 17 11 S.rimosus 99.820
广谱活性,产生土霉素 ( Oxytetracycline)、龟裂杀菌素
(Rimocidin )、 巴 龙 霉 素 ( Paramomycin )、 中 性 霉 素
(Neytramycin)、抗生素 K鄄16
YH73 10 S.griseoaurantiacus 99.489 抑制革兰氏阳性菌、分枝杆菌和德巴利氏酵母
YH80 12 S.coerulescens 99.864 抑制小球藻
YH91 9 S.diastaticus 99.142 拮抗性有限,轻度抑制芽孢杆菌
M53 10 S.finlayi 99.855 对藤黄八叠球菌和某些放线菌有效
M8# 11 13 S.bacillaris 98.947 未见活性报道
M10 11 16 S.violascens 99.146 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌十分微弱且不稳定的活性
M71 9 S.ramulosus 99.680 产生醋霉素(Acetomycin),抑制革兰氏阳性菌、阴性菌、毛滴虫和阿米巴
M76 10 23 S.arenae 97.863 抑制结核杆菌
M77# 17 11 S.radiopugnans 98.892 未见活性报道
M95# 8 8 S.specialis 99.155 未见活性报道
M105 12 S.vinaceusdrappus 99.272 产生友霉素(Amicetin),抑制革兰氏阳性菌、分枝杆菌
M107 7 S.griseosporeus 99.174 产生泰东霉素,抑制革兰氏阳性菌
M108 16 8 S.laurentii 98.856 产生硫链菌素(Thiostrepton), 抑制革兰氏阳性菌、分枝杆菌
M109 16 7 S.luteogriseus 99.928 产生对 Hela细胞有毒性的佩里霉素(Peliomycin),有报道对革兰氏阳性菌有作用
MH6 17 34 S.lydicus 99.568 产生利迪链菌素( Streptolydigin),抑制革兰氏阳性、阴性、真菌、滴虫和抗真菌的利迪霉素(Lydimycin)
MH28 N. dassonvillei 97.445 未见活性报道
GH1 13 S.turgidiscabies 99.331 引起植物病害
GH27# 10 S.haliclonae 99.398 未见活性报道
GH31 16 S.capillispiralis 97.366 产生头孢菌素 C鄄4
GH68 8 S.bellus 99.378 产生抗革兰氏阳性菌的马塔霉素(Matamycin)
GH69 S.asterosporus 98.796 未见活性报道
1095摇 20期 摇 摇 摇 于基成摇 等:大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性 摇
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续表
菌株名称
Strain name
分离菌株的抑菌活性*
Antagonism activity of isolates
Es吟 St Fu
同源近似种
Homologous species
相似率 / %
Similarity
rate
同源种的生物活性*
Bioactivity of homologous species
GH71 17 S.rochei 99.481 拮抗作用广泛,产生疏螺菌素 ( Borrelidin)、抗生素 T鄄2636、束菌素(Bundin)、兰卡杀菌素(Lankacidin)
GH72 9 S.scabiei 98.575 引起植物病害
GH74荫 S.lincolnensis 97.837
抑制革兰氏阳性、阴性细菌,产生林肯霉素
(Lincomycin)、郎西纳霉素(Rancinamycins)
PH6# 11 25 S.radiopugnans 98.822 未见活性报道
PH26# 16 N. dassonvillei 97.516 未见活性报道
PH33 22 28 S.parvus 97.486 产生抗革兰氏阳性细菌和肿瘤的放线菌素(Actinomycin)
PH34 16 S.ambofaciens 97.937
抑制革兰氏阳性、阴性细菌、原虫、真菌和肿瘤,产生螺
旋霉素(Spiramycin)、刚果杀锥虫素( Congocidin)、纺锤
菌素(Netropsin)、偶氮霉素(Duazomycin)和偶氮亮氨酸
(DON)
RH26 26 S.anulatus 99.711 抑制革兰氏阳性、阴性细菌和真菌
HV3# 11 13 N. terrae 98.552 未见活性报道
HV14# 11 10 9 N. dassonvillei 98.657 未见活性报道
HW3# 12 S.neopeptinius 99.182 未见活性报道
HW6 14 S.griseorubens 99.634 抑制革兰氏阳性细菌和颗粒青霉,对阴性细菌和白色假丝酵母无作用
HW8 17 S.tauricus 98.804 对革兰氏阳性细菌微弱作用,在菌丝体内产生抑制肿瘤的公牛菌素(Tavromycetin)
HW9 10 S.violaceolatus 100.00 对部分链霉菌微弱作用
HW16 13 S.cuspidosporus 98.254
产生抑制革兰氏阳性、阴性细菌以及肿瘤的稀疏菌素
(Sparsomycin ) 和 抑 制 分 枝 杆 菌 的 杀 结 核 菌 素
(Tubercidin)
HW17 13 S.cinereorectus 99.927 抑制革兰氏阳性和阴性细菌
HW27 10 S.fimicarius 98.341 具有拮抗活性
HW45# 13 11 S.heliomycini 99.703 未见活性报道
HW47# 10 N. dassonvillei 99.641 未见活性报道
HW66 16 S.pluricolorescens 98.287 产生抑制革兰氏阳性细菌的色硫霉素(Chrothiomycin)和抑制肿瘤的多色霉素(Pluramycin)
HW72 11 S.rubiginosohelvolus 99.139 抑制革兰氏阳性细菌和颗粒青霉
HW83 11 S.lusitanus 99.298 产生四环素(Tetracycline)和金霉素(Chlorotetracycline),抑制革兰氏阳性、阴性细菌、分枝杆菌和大型病毒
HW85 13 S.regensis 100.00 产生放线菌素(Actinomycin),抑制革兰氏阳性细菌和肿瘤
HW87# 17 17 S.marinus 99.104 未见活性报道
HL9 11 12 S.fradiae 97.474
广泛抗菌活性,产生新霉素 ( Neomycin)、弗氏菌素
(Fradicin)、泰乐菌素( Tylosin)、大环内酯类抗生素 B鄄
61269A、B鄄587和氨基苷菌素(Aminosidine)
HE9# 8 N. aegyptia 98.028 未见活性报道
HE11 13 13 S.cellulosae 98.867 产生抑制真菌、酵母菌的制霉色基素( Fungichromin)和制霉色质素(Fungichromatin)和放线菌素(Actinomycin)
HE16 9 16 9 S.atrovirens 98.821 抑制革兰氏阳性细菌
HE18# 11 S.coelicoflavus 97.945 产生淀粉酶抑制剂
2095 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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续表
菌株名称
Strain name
分离菌株的抑菌活性*
Antagonism activity of isolates
Es吟 St Fu
同源近似种
Homologous species
相似率 / %
Similarity
rate
同源种的生物活性*
Bioactivity of homologous species
HE23 12 S.rishiriensis 99.129
产生香豆霉素(Coumermycin)、新核苷抗生素 AT鄄 265、枝
三烯菌素(Mycotrienins),对革兰氏阳性、阴性细菌、真
菌、酵母菌均有抑制作用,对肿瘤作用微弱
HE34荫 11 S.pristinaespiralis 98.961 产生抑制革兰氏阳性细菌的原始霉素(Pristinamycims)
HE55 8 S.cinereorectus 98.922 具有抑制革兰氏阳性和阴性细菌活性
HE65 10 S.pactum 98.433
广谱抗菌活性,产生抗肿瘤抗生素密旋霉素
(Pactamycin)、密旋菌素(Pactacin)和杀虫的杀粉蝶菌素
(Piericidin)
HE66# 12 10 S.thermocarboxydus 99.561 未见活性报道
HE67 9 S.somaliensis 99.031 寄生菌,引起足菌病
HE68# 18 S.carpaticus 99.564 未见活性报道
HE69 9 S.avermitilis 99.600 产生除虫菌素复合体,杀线虫活性
HE71荫 13 14 S.xantholiticus 99.869 抗革兰氏阳性细菌、分枝杆菌、酵母菌和丝状真菌
SC2# 16 17 S.bacillaris 99.383 未见活性报道
SC3# 12 S.carpinensis 99.284 未见活性报道
SC12 14 24 S.fradiae 99.905
广泛抗菌活性,产生新霉素(Neomycin)、弗氏菌素
(Fradicin)、泰乐菌素( Tylosin)、大环内酯类抗生素 B鄄
61269A、B鄄587和氨基苷菌素(Aminosidine)
MA2 10 S.tateyamensis 99.033 强抑制革兰氏阳性细菌,产生硫肽菌素(Thiopeptins)
MA3 7 S.corchorusii 99.368 抑制真菌、革兰氏阳性细菌,产生盐屋霉素(Siomycin)
摇 摇 表中数据为 3次重复实验,抑菌圈直径平均值; 表示没有抑菌活性;*同源种的生物活性由 SciFinder 物质数据库查询,网址:http: / /
scifinder.cas.org / ;#分离菌株具有抑菌活性,而其同源近似种未见活性报道的菌株;荫近似同源种报道具有生物活性,而分离菌株未检测出相应
活性的菌株;吟 Es表示各菌株对大肠杆菌(E. coli)的抑菌活性;St表示各菌株对金黄色葡萄球菌(S.aureus)的抑菌活性;Fu 表示对尖孢镰刀菌
(F. oxysporum F sp. cucumarinum)的抑菌活性
2.5摇 同种海洋链霉菌与土壤链霉菌活性比较
由表 3可见,9个种分别来源于土壤和海洋链霉
菌的 24株菌株中,其抗菌活性表现差异较大。 来自
海洋的链霉菌除菌株 HR13 外,均对金黄色葡萄球
菌表现抗菌活性,分别分属链霉菌的 9 个种。 而来
自土壤的链霉菌则只有 4 株分属链霉菌的 3 个种。
表现抗真菌活性的 6 株链霉菌均来自土壤样品,分
属 4个种。 对大肠杆菌具有抑菌活性的 12 株链霉
菌中,10 株来自土壤,来自海洋样品的仅有 2 株,其
中,土壤源占 6个种,海洋源占 2 个种。 研究结果进
一步表明,海洋源链霉菌更多地表现为抗革兰氏阳
性菌活性,土壤源链霉菌更多地表现抗真菌活性。
同时,研究也表明,利用海水培养的与不利用海水培
养的土壤链霉菌其活性没有差异。
3摇 结论与讨论
3.1摇 海洋放线菌的活性
Pisano 等[11]对海洋沉积物放线菌抗菌活性进行
研究时发现,尽管拮抗放线菌的比例有的低至
15郾 8%,有的高至 73%,但均表现为主要抑制革兰氏
阳性细菌,其次是真菌,对革兰氏阴性细菌的拮抗最
小。 Sujatha从南印度 Tuticorin海岸沉积物样品中分
离的 64 株链霉菌中,44 株链霉菌表现抗细菌活性,
占分离到的链霉菌株数的 68.8%[12]。 Zhang 等对黄
海海洋沉积物中 24 株需要海水才能生长很好的放
线菌活性时发现,其中 17 株均具有抗细菌活性[13]。
在本实验中,具有拮抗活性的菌株共有 95 株,占总
分菌数的 57.6%。 其中抑制革兰氏阳性细菌的比例
最高,占总分菌比例的 51.5%,其次为革兰氏阴性细
菌,占总分菌比例的 16.4%,对真菌的抑制比例很
小,只有 3.6%,且活性也很低。 本研究结果与 Pisano
的研究结果相似,即海洋链霉菌更多地表现抗革兰
氏阳性细菌活性,且活性远远高于相应的土壤链霉
菌。 而对真菌和革兰氏阴性细菌的活性均较低,尤
其对真菌活性,其数量及活性大小均远远低于土壤
链霉菌。 由于许多革兰氏阳性细菌多分布于海洋沉
3095摇 20期 摇 摇 摇 于基成摇 等:大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性 摇
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积物和海洋生物共生系统中,本研究分离获得的 165
株链霉菌中均来自渤海和黄海海域-20—-40 m 水
下海洋沉积物样品,50%以上的菌株表现抗革兰氏
阳性细菌活性,可能与样品中存在大量革兰氏阳性
菌有关[14]。 是否这些革兰氏阳性菌株与海洋放线
菌在营养或空间分布上存在竞争,而促使海洋放线
菌进化为更多的表现抗革兰式阳性活性还有待进一
步研究。 但本文的研究结果,对于研究者更好地理
解微生物多样性,科学解释微生物种群间的关系,利
用共培养技术提高微生物次级代谢产物的产量,发
现新型活性代谢产物以借鉴。
图 4摇 拮抗金黄色葡萄球菌的放线菌多样性分析
Fig.4摇 Species diversity analysis of antagonistic marine actinomyces against S.aureus
4095 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 34卷摇
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表 3摇 土壤放线菌和海洋放线菌对不同病菌的活性比较
Table 3摇 Activity comparison of actinomyces from soil and marine against pathogens
菌株名称
Strain name
菌株编号
Strain number
抑菌活性 Antagonism activity / mm
黄瓜枯萎病菌 大肠杆菌 金黄色葡萄球菌
来源
Sources
浅天蓝链霉菌 S.coerulescens YH80 12 海洋
LQ137 11 温室土壤
LQ1 9 温室土壤
粪生链霉菌 S.fimicarius HW27 10 海洋
M5 大田土壤
毛链霉菌 S.pilosus HS5 16 海洋
V6 13 大田土壤
紫阔链霉菌 S.violaceolatus HW9 10 海洋
K1 12 大田土壤
HR13 海洋
LQ69 9 温室土壤
R11 16 大田土壤
淀粉酶链霉菌 S.diastaticus HA2 39 海洋
LQ37 13 14 12 温室土壤
高 30 16 15 13 大田土壤
龟裂链霉菌 S.rimosus YH68 17 11 海洋
高 F鄄9 26 18 大田土壤
葡萄牙链霉菌 S.lusitanus HW85 13 海洋
LQ123 11 温室土壤
深红紫链霉菌 S.violaceorubidus HS1 海洋
M3 11 10 大田土壤
弗氏链霉菌 S.fradiae SC12 14 24 海洋
HL9 13 11 海洋
H86 12 8 大田土壤
摇 摇 表中数据为 3次重复实验,抑菌圈直径平均值; :表示没有抑菌活性
摇 摇 95株分离菌株中具有抑菌活性,而其同源近似
种未见活性报道的有 23 株。 这一结果说明,在海洋
链霉菌中可能存在着大量的新型活性物质。 近似同
源种报道具有生物活性,而分离菌株未检测出相应
活性的菌株有 13株。 同时,相应近似种报道具有抑
制革兰氏阴性菌活性,而其对应的分离菌株则未检
出相应活性。 究其原因,可能是由于微生物在不同
的环境条件下通过不同途径代谢不同的活性代谢产
物。 有关同种海洋链霉菌与土壤链霉菌活性比较结
果也进一步表明,即使同一种链霉菌,由于其栖境不
同,其活性也存在很大差异。 同时,9 个种土壤和海
洋链霉菌的 24 株菌的活性比较也再次证明海洋链
霉菌多表现抗革兰氏阳性菌活性。
3.2摇 活性海洋放线菌的系统发育地位
链霉菌属的种群异常繁多,阎逊初先生根据国
内外大量的分类鉴定资料和多年的实践经验,将链
霉菌分为 12个类群[15],本研究筛选的 95 株活性海
洋放线菌涵盖除吸水类群外的所有链霉菌类群,且
多表现广谱抗性。 在 27 株表现阴性菌的活性菌株
中 23株同时表现抗革兰氏阳性菌,6 株抗尖孢镰刀
菌活性的菌株也同时抗革兰氏阳性菌,据结论可推
测抗革兰氏阳性菌的活性海洋放线菌菌株表现更为
广谱的抗菌活性,具备产生广谱性代谢产物的潜能,
进一步说明海洋链霉菌是获得新型广谱性活性代谢
产物的重要资源。
95株分离菌株中具有抑菌活性,而其同源近似
种未见活性报道的 23株分离菌株,对目标菌株均将
作为新型活性化合物筛选的潜在菌株。 同时,即使
分离菌株的生物活性与近似同源种报道的生物活性
相近,具体分析其活性也有一定的差异。 如根据筛
选菌株的亲缘关系分析,如图 3 和表 3 中 M10 与
S.violascens亲缘关系最近 (同源性 99. 146%),
S.violascens的文献资料表明其对大肠杆菌有十分微
弱且不稳定的活性[15],但菌株 M10 的对革兰氏阳性
5095摇 20期 摇 摇 摇 于基成摇 等:大连海域沉积物中可培养海洋链霉菌活性及其多样性 摇
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和阴性菌株的抑菌活性都很稳定,3次重复实验结果
均表现抑菌活性。 同样,菌株 HA2与 S.diastaticus亲
缘关系最近(100%同源性),但相关文献报道该链霉
菌拮抗活性有限,只有轻度抑制枯草芽孢杆菌的活
性,并未发现抑制金黄色葡萄球菌的活性[15鄄16],而菌
株 HA2对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径高达 39.0
mm,且活性稳定。 因此,有待于对这些菌株的活性
代谢产物进行进一步的研究。
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