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摇 摇 摇 摇 摇 生 态 学 报
摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 (SHENGTAI XUEBAO)
摇 摇 第 32 卷 第 19 期摇 摇 2012 年 10 月摇 (半月刊)
目摇 摇 次
中国野生东北虎数量监测方法有效性评估 张常智,张明海,姜广顺 (5943)……………………………………
城市居民食物氮消费变化及其环境负荷———以厦门市为例 于摇 洋,崔胜辉,赵胜男,等 (5953)………………
珠江口水域夏季小型底栖生物群落结构 袁俏君,苗素英,李恒翔,等 (5962)……………………………………
2010 年夏季雷州半岛海岸带浮游植物群落结构特征及其与主要环境因子的关系
龚玉艳,张才学,孙省利,等 (5972)
……………………………
……………………………………………………………………………
阿根廷滑柔鱼两个群体间耳石和角质颚的形态差异 方摇 舟,陈新军,陆化杰,等 (5986)………………………
黄河三角洲滨海草甸与土壤因子的关系 谭向峰,杜摇 宁,葛秀丽,等 (5998)……………………………………
盘锦湿地净初级生产力时空分布特征 王莉雯,卫亚星 (6006)……………………………………………………
菜豆根瘤菌对土壤钾的活化作用 张摇 亮,黄建国,韩玉竹,等 (6016)……………………………………………
花生植株和土壤水浸液自毒作用研究及土壤中自毒物质检测 黄玉茜,韩立思,杨劲峰,等 (6023)……………
遮荫对金莲花光合特性和叶片解剖特征的影响 吕晋慧,王摇 玄,冯雁梦,等 (6033)……………………………
火干扰对小兴安岭草丛、灌丛沼泽温室气体短期排放的影响 顾摇 韩,牟长城,张博文,等 (6044)……………
古尔班通古特沙漠南部植物多样性及群落分类 张摇 荣,刘摇 彤 (6056)…………………………………………
黄土高原樟子松和落叶松与其他树种枯落叶混合分解对土壤的影响 李摇 茜,刘增文,米彩红 (6067)………
长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响 秦摇 华,刘卜榕,徐秋芳,等 (6076)………………………
H2O2 参与 AM真菌与烟草共生过程 刘洪庆,车永梅,赵方贵,等 (6085)………………………………………
北京山区防护林优势树种分布与环境的关系 邵方丽,余新晓,郑江坤,等 (6092)………………………………
旱直播条件下强弱化感潜力水稻根际微生物的群落结构 熊摇 君,林辉锋,李振方,等 (6100)…………………
不同森林类型根系分布与土壤性质的关系 黄摇 林,王摇 峰,周立江,等 (6110)…………………………………
臭氧胁迫下硅对大豆抗氧化系统、生物量及产量的影响 战丽杰, 郭立月,宁堂原,等 (6120)…………………
垃圾填埋场渗滤液灌溉对土壤理化特征和草本花卉生长的影响 王树芹,赖摇 娟,赵秀兰 (6128)……………
稻麦轮作系统冬小麦农田耕作措施对氧化亚氮排放的影响 郑建初,张岳芳,陈留根,等 (6138)………………
不同施氮措施对旱作玉米地土壤酶活性及 CO2 排放量的影响 张俊丽,高明博,温晓霞,等 (6147)…………
北方农牧交错区农业生态系统生产力对气候波动的响应———以准格尔旗为例
孙特生,李摇 波,张新时 (6155)
…………………………………
…………………………………………………………………………………
辽宁省能源消费和碳排放与经济增长的关系 康文星,姚利辉,何介南,等 (6168)………………………………
基于 FARSITE模型的丰林自然保护区潜在林火行为空间分布特征 吴志伟,贺红士,梁摇 宇,等 (6176)……
不同后作生境对玉米地天敌的冬季保育作用 田耀加,梁广文,曾摇 玲,等 (6187)………………………………
云南紫胶虫种群数量对地表蚂蚁多样性的影响 卢志兴,陈又清,李摇 巧,等 (6195)……………………………
阿波罗绢蝶种群数量和垂直分布变化及其对气候变暖的响应 于摇 非,王摇 晗,王绍坤,等 (6203)……………
专论与综述
海水养殖生态系统健康综合评价:方法与模式 蒲新明,傅明珠,王宗灵,等 (6210)……………………………
海草场生态系统及其修复研究进展 潘金华,江摇 鑫,赛摇 珊,等 (6223)…………………………………………
水华蓝藻对鱼类的营养毒理学效应 董桂芳,解绶启,朱晓鸣,等 (6233)…………………………………………
环境胁迫对海草非结构性碳水化合物储存和转移的影响 江志坚, 黄小平,张景平 (6242)……………………
生态免疫学研究进展 徐德立,王德华 (6251)………………………………………………………………………
研究简报
喀斯特峰丛洼地不同森林表层土壤有机质的空间变异及成因 宋摇 敏,彭晚霞,邹冬生,等 (6259)……………
准噶尔盆地东南缘梭梭种子雨特征 吕朝燕,张希明,刘国军,等 (6270)…………………………………………
期刊基本参数:CN 11鄄2031 / Q*1981*m*16*336*zh*P* ￥ 70郾 00*1510*35*
室室室室室室室室室室室室室室
2012鄄10
封面图说: 岸边的小白鹭———鹭科白鹭属共有 13 种,其中有大白鹭、中白鹭、白鹭(小白鹭)、黄嘴白鹭等,体羽皆是全白,世通
称白鹭。 夏季的白鹭成鸟繁殖时枕部着生两条狭长而软的矛状羽,状若双辫,肩和胸着生蓑羽,冬季时蓑羽常全部
脱落,白鹭虹膜黄色,嘴黑色,脚部黑色,趾呈黄绿色。 小白鹭常常栖息于稻田、沼泽、池塘水边,以及海岸浅滩的红
树林里。 白天觅食,好食小鱼、蛙、虾及昆虫等。 繁殖期 3—7月。 繁殖时成群,常和其他鹭类在一起,雌雄均参加营
巢,次年常到旧巢处重新修葺使用。
彩图提供: 陈建伟教授摇 北京林业大学摇 E鄄mail: cites. chenjw@ 163. com
第 32 卷第 19 期
2012 年 10 月
生 态 学 报
ACTA ECOLOGICA SINICA
Vol. 32,No. 19
Oct. ,2012
http: / / www. ecologica. cn
基金项目:浙江省自然科学基金项目(Y3080337);浙江农林大学人才启动基金资助(2351000731)
收稿日期:2011鄄08鄄25; 摇 摇 修订日期:2012鄄05鄄17
*通讯作者 Corresponding author. E鄄mail: xuqiufang@ zafu. edu. cn
DOI: 10. 5846 / stxb201108251240
秦华,刘卜榕,徐秋芳,白建峰,李永夫,李永春.长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响.生态学报,2012,32(19):6076鄄6084.
Qin H, Liu B R, Xu Q F, Bai J F, Li Y F, Li Y C. Effects of long鄄term intensive management on soil ammonia oxidizing archaea community under
Phyllostachys praecox stands. Acta Ecologica Sinica,2012,32(19):6076鄄6084.
长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响
秦摇 华1,2,刘卜榕1,2,徐秋芳1,2,*,白建峰3,李永夫1,2,李永春1,2
(1. 浙江省森林生态系统碳循环与固碳减排重点实验室,浙江农林大学,临安摇 311300;
2. 浙江农林大学环境与资源学院,临安摇 311300; 3. 上海第二工业大学城市建设与环境工程学院,上海摇 201209)
摘要:应用荧光定量 PCR以及 PCR鄄DGGE技术研究了雷竹林长期集约种植过程中土壤氨氧化古菌种群数量及群落结构的演变
趋势,并利用典范对应分析(CCA)方法研究影响土壤氨氧化古菌群落的主要环境因子。 研究结果表明,水稻田改种雷竹后,土
壤氨氧化古菌种群数量显著增加,在 4 a时达到最高,但在集约种植后快速下降,9 a 雷竹林土壤氨氧化古菌数量最低,随后逐
渐稳定。 雷竹林土壤氨氧化古菌种群主要为不可培养泉古菌,聚类分析结果表明集约种植前后氨氧化古菌群落结构存在明显
差异,长期集约经营雷竹林土壤以适应较低 pH值的物种为主要优势种群。 CCA分析表明,集约种植时间较长的 11 a和 15 a林
地群落结构较为类似,与 7 a和 9 a样地明显区分。 土壤 NO-3 鄄N与氨氧化古菌群落变化的相关性最强,说明氨氧化古菌在雷竹
林土壤硝化过程中发挥着重要作用。 土壤 pH值及速效养分对土氨氧化古菌群落也具有较大影响,它们与 NO-3 鄄N 合计解释了
59. 7%的样本总变异,表明土壤酸化以及过量养分的积累对氨氧化古菌群落具有重要影响。
关键词:集约种植;雷竹林土壤;氨氧化古菌;典范对应分析
Effects of long鄄term intensive management on soil ammonia oxidizing archaea
community under Phyllostachys praecox stands
QIN Hua1,2, LIU Borong1,2, XU Qiufang1,2,*, BAI Jianfeng3, LI Yongfu1,2, LI Yongchun1,2
1 Zhejiang Provincial Key Laboratory of Carbon Cycling in Forest Ecosystems and Carbon Sequestration, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin忆an
311300, China
2 School of Environmental and Resources, Zhejiang Agriculture and Forestry University, Lin忆an 311300, China
3 School of Urban Development and Environmental Engineering, Shanghai Second Polytechnic University, Shanghai 201209, China
Abstract: Phyllostachys praecox is a favorable bamboo species for the production of edible shoots, and has been widely
planted in southern China. Intensive management practices such as regular high rate of fertilization and annual heavy winter
mulch in the stands established more than 5 years, has been employed by many bamboo growers to improve yields.
However, these practices may have adverse effects on the ecosystem. Ammonia鄄oxidizing archaea (AOA) has been found in
various habitats and played a key role in soil nitrification. There is no published information available on the impact of long鄄
term intensive land management practices on the population size and community structure of soil AOA in Phyllostachys
praecox stands. In this study, the abundance and composition of soil AOA communities across a long鄄term chronosequence
under intensive managed Phyllostachys praecox stands were investigated using real鄄time polymerase chain reaction (PCR),
denaturing gradient gel electrophoresis ( DGGE), cloning and sequencing approaches based on amoA genes. Canonical
correspondence analysis (CCA) was also used to determine the environmental variables which are significantly correlated
with community structure.
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Treatments in this study were based on the cultivation history which corresponded to 4, 7, 9, 11 and 15 years after
establishment of bamboo stands. Paddy fields with similar topography were used as the control. Each cultivation history had
three replications. The archaeal amoA gene copy numbers ranged from 1. 79伊107 to 3. 93伊107 per gram of dry soil, and
changed greatly in response to the long鄄term intensive management. The 4鄄year鄄old treatment had the highest copy numbers
of amoA genes, whereas the lowest copy numbers were recorded in the 9鄄year鄄old treatment. Ammonia鄄oxidizing archaea
were more abundant than ammonia鄄oxidizing bacteria (AOB) in all the corresponding treatments though they were of the
same order of magnitude. There was no significant correlation between AOA abundance and soil nitrification potential. The
DGGE patterns revealed that the intensive management resulted in an obvious change of the AOA community, significant
change was also observed among the treatments with different intensive management history. Phylogenetic analysis of the
amoA gene fragments showed that all AOA sequences from different treatments were associated with uncultured
Crenarchaeote. The AOA species that adapt to low pH soils dominated in the 7鄄, 9鄄, 11鄄 and 15鄄year鄄old treatments while
species associated with paddy soil and sediment soil clone dominated in the control and 4鄄year鄄old treatment, indicating a
pronounced difference in the community composition of AOA in response to the long鄄term intensive management. Canonical
correspondence analysis exhibited a significant difference in microbial community structures between the treatments before
and after intensive management application. The 11鄄 and 15鄄year鄄old treatments were clustered together, and clearly
separated from the 7鄄 and 9鄄year鄄old treatments along both the first and second ordination axes. Concentrations of soil NO-3 鄄
N, NH+4 鄄N and available phosphorus, and soil pH together explained 62. 2% of the total variation of soil AOA community.
The first ordination axis explained 33. 9% of the variation and the second axis explained 25. 8% of the variation. Among
the four soil parameters measured, soil NO-3 鄄N concentration explained most of the variation of AOA community, but the
influence was not significant (P<0. 05). The results suggest that long鄄term intensive management had a significant impact
on AOA abundance and composition, and the soil acidification and nutrient accumulation should be important factors
influencing the shift of AOA community in the intensively managed P. praecox stands.
Key Words: intensive management; Phyllostachys praecox; ammonia鄄oxidizing archaea; Canonical correspondence analysis
雷竹(Phyllostachys praecox)是中国长江以南地区广泛分布的优良笋用竹种,近十几年来,以冬季覆盖和
大量施肥为主要特征的雷竹集约种植技术已在生产上大面积推广,成为当地农村收入的主要来源。 但是,长
期集约种植也产生了一系列的生态环境问题,如土壤有机质以及速效氮、磷、钾等含量显著增加,土壤 pH 值
急剧下降,以及土壤细菌群落结构发生改变等,从而导致雷竹林提前退化[1鄄2]。 另一方面,土壤中积累的养分
元素如氮、磷等通过挥发、径流、渗滤等途径进入周边环境,对大气和水体质量产生严重威胁[3]。
硝化作用是全球氮素循环的重要环节,其中由氨氧化微生物主导的将氨转化为亚硝酸的氨氧化过程为限
速步骤,因此氨氧化微生物也被认为是硝化作用的主要驱动者[4]。 过去一直认为土壤硝化作用由氨氧化细
菌(ammonia鄄oxidizing bacteria,AOB)进行,近年来的研究表明泉古菌门的一些古菌也具有 amoA 基因,并可以
进行硝化作用[5]。 目前已经发现,氨氧化古菌(ammonia鄄oxidizing archaea,AOA)的关键功能基因 amoA广泛存
在于海洋和陆地环境[6],且较为丰富。 自然环境中硝化古菌关键功能基因 amoA 的数量通常高于细菌,已知
的最大差别达 8000 倍[7]。 He等[8]对农田土壤生态系统中 AOA和 AOB的丰度、组成及对环境的响应进行了
研究,发现各处理中 AOA的丰度明显高于 AOB,且与 AOB 相比,长期施肥处理对 AOA 的群落结构组成产生
了更为明显的影响,可见 AOA在农田土壤生态系统中的重要作用。 目前的研究表明,土壤环境因子如铵浓
度、温度、施肥处理、pH值以及植被等对不同的氨氧化细菌及古菌种群均具有特异的选择性,氨氧化微生物作
为理想的土壤质量生物学指标受到了广泛关注[9鄄10]。
氨氧化古菌在氨氧化微生物中的重要地位已经被深刻认识,因此继氨氧化细菌后,非常有必要对不同生
态系统中的氨氧化古菌群落及其作用进行科学评价。 雷竹林长期集约种植过程中土壤氨氧化细菌的演变趋
7706摇 19 期 摇 摇 摇 秦华摇 等:长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响 摇
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势及其影响因素已经被初步揭示[11],而氨氧化古菌在长期集约种植雷竹林土壤中的功能及其演变趋势还没
有相关研究。 本文通过选取不同集约种植年限雷竹林,采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)、
变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)及荧光定量 PCR 方法研究氨氧化古菌数量
及种群结构的演变趋势,并利用典范对应分析方法探讨其主要影响因素,旨在评估集约种植条件下土壤氨氧
化古菌的生态功能,从而更好的了解土壤硝化过程,为提高肥料利用率、保护生态环境提供科学依据。
1摇 材料与方法
1. 1摇 研究地概况
土壤样品采自浙江省临安市太湖源镇(30毅18忆 N, 119毅33忆 E),该地属中纬度北亚热带季风气候,年降水
量 1420 mm,多年平均气温为 15. 8 益,历年平均日照时数 1939 h,无霜期 234 d。 雷竹栽培区属低山丘陵地
貌,土壤为粉砂岩母质上发育的红壤土类。 雷竹林种植之前均为水稻田,雷竹定植后的前 5 a 基本不施肥或
施少量复合肥,从雷竹栽培的第 5 年起开始实施集约种植,模式为:每年 11 月下旬至 12 月上旬对雷竹林地表
进行覆盖,保温保湿以利于竹笋早发。 通常是在雷竹林地表先覆 10—15 cm 稻草,再在上面覆盖 10—15 cm
的砻糠,稻草用量 40 t / hm2,砻糠用量 55 t / hm2,翌年 3、4 月揭去表层未腐烂的砻糠,而下层的稻草经过一个
冬春的发酵和雨雪水的淋泡已基本腐烂入土。 每年施 3 次肥,时间分别为 5 月上旬、9 月中旬和 11 月下旬
(覆盖前),每年施肥总量为无机复合肥(N 颐P 颐K= 15颐15颐15) 2. 25 t / hm2 和尿素(含 N 46% )1. 125 t / hm2,或
施等量养分的有机肥[2]。
1. 2摇 样品采集与处理
为研究集约种植年限对雷竹林土壤氨氧化古菌群落结构的影响,分别采取种植历史为 4、7、9、11 和 15 a
的雷竹林土壤,同时采集邻近同一母质且地形地貌特征相似的水稻田土壤作为对照(CK)。 随机取样法采取
各处理 0—20 cm土壤样品,每个雷竹林样地 10 个取样点,装入密封袋,放入冰桶带回实验室。 新鲜土样充分
混匀后,去除大的石块和植物残体,过 2 mm 钢筛。 样品分为两份,一份立即冷冻干燥,用于提取土壤细菌总
DNA,供氨氧化古菌群落结构及定量分析使用;另外一份于室内自然风干,研磨过筛后用于土壤基本理化性质
分析。
1. 3摇 主要试剂与引物
PowerSoilTM Total DNA Isolation Kit 试剂盒购于美国 Mo Bio 公司;Taq DNA 聚合酶、SYBR誖 Premix Ex
TaqTM、pMD 18鄄T 载体、凝胶回收试剂盒 Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0 以及质粒提取试剂盒
MiniBEST Plasmid Purification Kit均购于宝生物工程公司(TakaRa,大连);荧光染料 SYBR green 玉购于美国
Invitrogen公司;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
1. 4摇 分析方法
1. 4. 1摇 土壤理化性质
土壤理化性质参照文献[12]进行。 其中,土壤 pH值采用 1颐2. 5 土水比,复合电极测定;有机质含量采用重
铬酸钾鄄硫酸外加热法测定;总氮采用半微量凯氏定氮法;碱解氮采用碱解扩散法;有效磷采用 Bray 法,盐酸鄄
氟化铵溶液浸提,钼锑抗比色法测定;速效钾采用醋酸铵提取,火焰光度计测定;土壤矿质态氮采用氯化钾浸
提—流动分析仪测定法。 不同种植年限雷竹林土壤理化性质分析结果见表 1。
1. 4. 2摇 土壤总 DNA的提取及纯化
采用 PowerSoilTM Total DNA Isolation Kit试剂盒提取土壤总 DNA,称取 0. 25 g于-20 益保存的土壤样品,
按试剂盒说明书进行土壤 DNA提取,提取后的 DNA样品保存于-20 益。
1. 4. 3摇 土壤氨氧化古菌的 PCR鄄DGGE分析
采用一对氨氧化古菌 amoA基因特异引物 Arc鄄amoAF和 Arc鄄amoAR 对氨氧化古菌 amoA 基因进行扩增。
Arc鄄amoAF:5忆鄄STA ATG GTC TGG CTT AGA CG鄄3忆;Arc鄄amoAR:5忆鄄GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT鄄3忆,其中,
Arc鄄amoAR在 5忆端加一段 GC夹:cgc ccg ccg cgc ccc gcg ccc ggc ccg ccg ccc ccg ccc c[13]。 使用 Bio鄄Rad公司
8706 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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的 S鄄1000 PCR仪对土壤总 DNA进行扩增。 25 滋L反应体系如下:10 伊PCR Buffer(缓冲液)2. 5 滋L,MgCl2(25
mmol / L)2. 0 滋L,dNTP(2. 5 mmol / L)2. 0 滋L,引物(10 滋mol / L)各 0. 25 滋L,TaqDNA 聚合酶(5 U / 滋L)0. 25
滋L,模板 DNA 0. 5 滋L,用无菌双蒸水补足至 25 滋L。 PCR反应参数:94 益预变性 5 min,94 益变性 45 s,55 益
退火 1 min,72 益延伸 1 min,30 个循环,最后 72 益延伸 10 min。 取 3 滋L PCR反应产物用 1. 0%的琼脂糖凝
胶进行电泳,检测产物及其长度。
表 1摇 不同种植年限雷竹林土壤理化性质
Table 1摇 Soil characteristics of bamboo stands with different cultivation history
处理
Treatment
pH
(H2O)
有机质
Organic C
/ (g / kg)
全氮
Total N
/ (g / kg)
碱解氮
Available N
/ (mg / kg)
有效磷
Available P
/ (mg / kg)
速效钾
Available K
/ (mg / kg)
铵态氮
NH+4 鄄N
/ (mg / kg)
硝态氮
NO-3 鄄N
/ (mg / kg)
CK 6. 0(0. 4)c 15. 5(0. 2)ab 2. 20(0. 25)ab 174(10)b 15(2)a 42(8)a 42. 4(1. 6)b 11. 2(0. 1)a
4 a 5. 3(0. 4)b 13. 1(0. 2)a 1. 93 (0. 14)a 160(8)a 29(3)b 110(10)b 29. 9(2. 5)a 12. 3(0. 7)a
7 a 3. 6(0. 1)a 17. 7(0. 2)b 2. 38(0. 24)b 179(10)b 35(4)b 168(1)c 73. 1(4. 9)c 17. 3(0. 2)b
9 a 3. 7(0. 4)a 16. 2(0. 4)ab 2. 33(0. 35)b 201(6)c 209(11)c 212(19)d 88. 4(6. 6)d 38. 7(1. 4)d
11 a 3. 7(0. 3)a 16. 3(0. 2)ab 2. 40(0. 35)b 211(6)c 296(11)d 207(2)d 99. 5(4. 0)e 20. 2(0. 5)c
15 a 4. 2(0. 1)a 33. 6(0. 2)c 4. 30(0. 24)c 238(6)d 364(5)e 218(4)d 104. 0(2. 1)e 21. 0(1. 2)c
摇 摇 表中数据为平均值,括号内数值为标准差,同列中不同字母代表差异达显著水平(P<0. 05)
使用 DCodeTM Universal Mutation Detection System (Bio鄄Rad),在变性剂梯度为 30%—50%的 6%聚丙烯酰
胺凝胶上进行变性梯度凝胶电泳。 电泳前对 PCR产物定量、校正,使上样量一致。 在 60 益、80 V 条件下电泳
13 h 后,SYBR green I染色 30 min,染色结果用 Gel DocTM EQ (Bio鄄Rad) 凝胶成像系统成像,使用 Quantity One
4. 4 软件(Bio鄄Rad) 进行图像分析。
1. 4. 4摇 氨氧化古菌优势种群序列分析
将 DGGE图谱中的主要条带进行切胶,DNA 回收,然后再分别以不带 GC 夹的引物 Arc鄄amoAF / Arc鄄
amoAR对回收条带 DNA进行 PCR扩增,将扩增产物利用 pMD 18鄄T 载体进行克隆测序(Invitrogen 上海实验
室代测)。 将测序结果登陆 NCBI通过 Blast软件与 GenBank 中的已知序列比对来确定测定序列的微生物种
类。 利用 MEGA4 软件基于 DGGE条带序列,进行 Bootstrap验证系统发育分析,邻接法(Neighbor鄄joining,N鄄J)
构建系统发育树。
1. 4. 5摇 荧光定量 PCR
采用 SYBR誖 Premix Ex TaqTM 试剂盒,针对氨氧化古菌 amoA 基因进行荧光定量 PCR 扩增,每个样品 3
次重复,扩增在 Bio鄄Rad CFX96 扩增仪上进行。 荧光定量 PCR 反应体系 25 滋L,引物 Arch鄄amoAF 和 Arch鄄
amoAR(10 滋mol / L)各 0. 25 滋L,SYBR誖 Premix Ex TaqTM 12. 5 滋L,模板 1. 0 滋L,用无菌 ddH2O补足至 25 滋L。
荧光定量 PCR条件:95 益预变性 3 min;接着 95 益,30 s;55 益,30 s;72 益,45 s,35 个循环。
1. 4. 6摇 荧光定量 PCR标准曲线建立
参照 He等[8]报道的方法,以混合土样总 DNA 为模板进行氨氧化古菌的 amoA 基因 PCR 扩增。 将 100
滋L PCR产物用 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳,切下含有氨氧化古菌 amoA 基因的条带,用 Agarose Gel DNA
Purification Kit Ver. 2. 0(Takara)凝胶回收试剂盒纯化。 使用 pMD 18鄄T载体连接 PCR 产物,连接产物转化到
大肠杆菌 DH5琢感受态细胞,在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑筛选阳性克隆。 取部分阳性转化菌液送上海生
工进行测序,作为氨氧化古菌荧光定量 PCR 分析的标准 DNA。 利用 MiniBEST Plasmid Purification Kit
(TaKaRa)试剂盒提取重组质粒 DNA,质粒 DNA 浓度使用 Nanodrop誖 ND鄄1000 测定,氨氧化古菌 amoA 基因
重组质粒 40. 2 ng / 滋L。 根据已知重组质粒全序列和阿伏伽德罗常数(6. 02伊1023 分子数 / mol)计算 amoA基因
拷贝数,计算得到氨氧化古菌重组质粒为 1. 17伊1010 cells / 滋L。 以 10 倍梯度对重组质粒进行梯度稀释(10-3—
10-9),每个稀释度 3 次重复,荧光定量 PCR 扩增获得氨氧化古菌的 amoA 基因标准曲线,标准方程为 y=
9706摇 19 期 摇 摇 摇 秦华摇 等:长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响 摇
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-3郾 20x+37. 22,(R2 =0. 99)。
1. 5摇 数据处理与统计分析
采用 SPSS 18. 0 统计软件进行数据处理,Dunkun 单因素方差分析比较各处理之间的差异显著性(P<
0郾 05)。 采用 Bio鄄Rad公司的 Quantity One 4. 4 软件进行 DGGE 指纹图谱分析。 使用 CANOCO 4. 5. 1 软件
(Microcomputer Power, Ithaca, USA)对 DGGE揭示的细菌群落结构与环境参数进行典范对应分析(Canonical
correspondence analysis,CCA)。 以 DGGE 中条带的相对密度值作为微生物物种数据,使用软件中的 manual
selection选项预选影响最显著的一组环境变量,采用 499 次的蒙特卡罗排列检验(MonteCarlo permutation test,
499 permutations, full model)进行显著性检验[14]。
摇 图 1摇 不同集约种植年限雷竹林土壤氨氧化古菌的数量变化
Fig. 1摇 AOA population size under long鄄term intensive managed
Phyllostachys praecox stands
2摇 结果与分析
图 2摇 雷竹林土壤氨氧化古菌群落的 DGGE分析
摇 Fig. 2 摇 DGGE analysis of soil AOA community in Phyllostachys
praecox stands
2. 1摇 长期集约经营对土壤氨氧化古菌数量的影响
采用荧光定量 PCR检测不同集约种植年限雷竹林
土壤氨氧化古菌的数量变化,假定每个 AOA 细胞内含
有一个 amoA 拷贝,根据标准曲线计算出土壤中 AOA
的细胞数量。 由图 1 可以看出,雷竹林土壤氨氧化古菌
amoA基因拷贝数处于 1. 79伊107—3. 93伊107 copies / g干
土之间。 长期种植过程中,土壤 AOA 数量总体呈先上
升后下降的趋势。 在母竹定植后的雷竹成林期间,尽管
没有进行覆盖和大量施肥,4 a 处理与对照相比土壤
AOA的数量显著增加。 雷竹林从第 5 年开始进行集约
种植,此后土壤 AOA数量急剧下降,7 a处理其 AOA数
量显著低于 4 a,而集约经营 4a 和 6a 后的 9 a 及 11 a
处理其 AOA数量显著低于 7 a。 随着经营时间的延长,
土壤 AOA数量有逐渐回升的趋势, 15 a 处理其 AOA
数量与 7 a没有显著差异。
2. 2摇 长期集约经营对土壤氨氧化古菌群落结构的影响
采用氨氧化古菌特异性引物 Arc鄄amoAF 和 Arc鄄
amoAR对 amoA基因进行 PCR扩增,经 1. 0%的琼脂糖
凝胶电泳检测,氨氧化古菌的 amoA 基因扩增片段均为
635 bp,纯化后进行 DGGE分析,结果如图 2 所示。
图 2 中可以看出,随着雷竹种植年限的延长,DGGE
图谱出现了较明显的差异,水稻田改种雷竹后,土壤氨
氧化古菌群落变化明显,原有的优势种群如条带 6、10、
12 等减弱或消失,新的优势种群如条带 5、19、20 等出
现。 在雷竹林实施集约种植措施后,土壤氨氧化古菌群
落则再次发生变化,与 4 a 处理相比,种群丰富度显著
下降,7 a处理主要由条带 9、11、14 和 16 等 4 个种群组
成,而 9 a处理则只剩下条带 13—15 这 3 个优势种群,
表明集约种植对土壤 AOA种群产生了强烈的影响。 随
着集约经营时间的延长,土壤中 AOA 种群丰富度开始
恢复。 但是,除了条带 9 为所有种植雷竹林土壤样品的
共有种群外,AOA 优势种群与集约种植之前相比已经
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发生了明显的变化。
通过对主要的 DGGE条带进行序列分析来确定雷竹林集约经营过程中土壤氨氧化古菌的群落演变过程,
共选取了 20 条 DGGE条带进行分析(图 2)。 在 Genebank中进行 Blast序列比对,利用 MEGA4 构建系统发育
树(图 3)。 结果表明,雷竹林土壤中的氨氧化古菌均归类于不可培养的泉古菌(Uncultured Crenarchaeote)。
水稻田土壤中主要 AOA种群(条带 9、10、12)与已知的沉积物土壤中的 AOA种群距离较近,而集约经营后的
雷竹林土壤 AOA种群发生较大变化,除 15 a雷竹林土壤中的条带 2—5聚为一支,与水稻田土壤 AOA种群的
遗传距离较为接近外,11 a和 15 a雷竹林土壤中的主要条带 11、 14、17 和 18 等聚为一支,与集约经营之前的
AOA种群遗传距离较远,说明长期的集约经营改变了土壤氨氧化古菌的种群结构。
图 3摇 基于雷竹林土壤氨氧化古菌 DGGE条带序列的 N鄄J系统发育树
Fig. 3摇 Neighbor鄄joining tree of AOA sequences in Phyllostachys praecox stands
2. 3摇 环境因子对土壤氨氧化古菌群落结构的影响
对各样品的 DGGE条带进行典范对应分析(CCA),结果如图 4 所示。 结果表明,水稻田改种雷竹林后,土
壤氨氧化古菌群落结构发生明显改变,而随着集约种植措施年限的延长,不同种植阶段土壤氨氧化古菌群落
差异明显。 CK与 4 a样地较为接近,但是其与集约经营后的雷竹林样地差异较大。 集约经营雷竹林中,7 a
与 9 a样地较为接近,而长期集约经营的雷竹林样地 11 a和 15 a则聚为一簇,说明植被类型以及种植方式的
改变均对土壤氨氧化古菌群落产生了较大影响。
根据 Canoco的 forward分析,所有的 8 个环境因子中,土壤 NO-3 鄄N含量与氨氧化古菌群落的相关性最强,
但并未达到显著水平(P<0. 05),土壤 pH值、NH+4 鄄N以及有效磷含量与 AOA的相关性也大于其他环境因子,
因此选入这 4 个环境因子进行分析。 从图 4 中可以看出,土壤 pH 值与第一排序轴具负相关性,而速效磷以
及矿质态氮均与第一排序轴呈正相关,其中,速效磷与第二排序轴呈显著正相关(P<0. 05)。 由样点在环境变
量上的投影可以发现,CK以及 4 a样地中 AOA种群对于较高的 pH值具有较强的适应性,而 11 a 和 15 a 样
地中的 AOA种群则对于较高的速效氮、磷养分积累较为适应。 CCA分析结果显示,第一排序轴(Axis1)解释
了样本中 33. 9%的变异,第二排序轴(Axis2)解释了样本 25. 8%的变异,两者合并解释了样本 59. 7%的总变
异(表 2)。
1806摇 19 期 摇 摇 摇 秦华摇 等:长期集约种植对雷竹林土壤氨氧化古菌群落的影响 摇
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图 4摇 雷竹林土壤氨氧化古菌群落结构的典范对应分析
摇 Fig. 4摇 CCA on DGGE band data in soils of Phyllostachys
praecox stands
3摇 讨论
近年来,环境基因组学研究发现地球环境中大量存
在的泉古菌含有氨氧化关键功能基因(amoA),具有氨
氧化能力,这群微生物迅速引起了人们的关注,成为研
究的热点。 通过荧光定量 PCR手段研究自然环境中氨
氧化微生物关键功能基因 amoA 拷贝数,发现 AOA 数
量通常高于 AOB,且相差好几个数量级[7]。 Leininger
等[15]首次报道了细菌和古菌关键功能基因 amoA 的相
对丰度,发现多数土壤中硝化古菌数量多于细菌数量;
最近的研究也表明农田土壤硝化古菌 amoA 基因约为
细菌 amoA数量的几十到上千倍[16]。 但是在森林土壤
中目前相关研究不多,本研究结果显示,在长期集约种
植的雷竹林土壤中,古菌 amoA 基因拷贝数处于 1. 79伊
107—3. 93伊107拷贝 / g干土之间,总体高于土壤中细菌
amoA数量(0. 52 伊107—1. 88 伊107拷贝 / g 干土) [11],但
在数量级上并没有差异。 Boyle鄄Yarwood等[17]也发现在
不同的林分下,土壤 AOA 及 AOB 种群数量比较相近,
均处于 2. 3伊106—6. 0伊106拷贝 / g干土范围内。 由此可
以看出,与氨氧化细菌相比,氨氧化古菌在森林土壤中
并没有显示出明显的优势,这可能与森林土壤中泉古菌
的丰度有较大关系。 Kemnitz等[18]研究表明,在酸化森林土壤中,尽管泉古菌在土壤总基因数量中占有相当
比例(12%—38% ),但是其总数却低于细菌数量。
表 2摇 土壤氨氧化古菌群落结构组成的典范对应分析
Table 2摇 CCA of soil AOA community compositions
典范对应分析指标
Index of CCA
第一排序轴
Axis 1
第二排序轴
Axis 2
第三排序轴
Axis 3
第四排序轴
Axis 4
特征值
Eigenvalues 0. 548 0. 417 0. 284 0. 185
样本鄄环境关联度
Species鄄environment correlation 1. 000 1. 000 0. 999 0. 992
物种累积关联度百分数
Cumulative percentage correlation of species data 33. 9 59. 7 77. 3 88. 7
物种鄄环境关系累积百分数
Cumulative percentage correlation of species鄄environment relation 38. 2 67. 3 87. 1 100. 0
长期集约种植过程中雷竹林土壤硝化势与 AOB 数量呈显著正相关关系(P<0. 01),而本研究发现 AOA
与土壤硝化势之间的相关性并不显著。 与此结果相类似的是,Di 等[19]发现在含氮量丰富的草地土壤中,尽
管 AOA数量众多,但与土壤硝化势之间没有显著相关性,而 AOB丰度与土壤硝化势显著相关,因此推断 AOB
是此类土壤中硝化作用的主要驱动者。 已有的大量研究表明,在养分丰富,特别是氮源丰富的土壤中,AOB
是土壤硝化过程的主要驱动者[16, 20]。 雷竹林在长期的集约经营过程中土壤养分大量积累,氮素含量远远高
于一般农田土壤,这也可能是导致 AOA与土壤硝化潜力相关性不显著的原因之一。 但是在不同的环境条件
下土壤 AOA和 AOB所发挥的作用也不尽相同,AOA一般在营养缺乏的生境中发挥更大的作用[21],因此推测
在水稻田刚改种雷竹以及雷竹林集约种植的初期,AOA 可能发挥着较大作用,但是随着土壤养分的快速积
累,AOA无论是数量还是活性都随之逐渐下降,最终趋于稳定。
2806 摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 32 卷摇
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土壤氨氧化古菌 PCR鄄DGGE分析结果表明,雷竹林土壤中氨氧化古菌与已发现的不同生境,如旱地、水
稻土以及湿地系统中的不可培养泉古菌较为相近。 作为对照的稻田土壤其 AOA种群与已发现的沉积物中的
AOA类似,而在雷竹成林过程中逐渐发生种群更替,4 a处理中出现了一些不同的种群,如条带 5 与已知的农
田土壤中的种群类似,而条带 19 和 20 则与水稻土以及沉积物中的 AOA种群类似。 实施集约经营措施以后,
由于 pH值的快速下降,土壤中出现了新的条带如 14—15 以及 17—18 等,聚类分析表明其都与酸性红壤中发
现的 AOA克隆较为接近,说明此时的 AOA群落已经由适应较低 pH 值的物种所组成。 同样的结果也可以在
对比土壤 AOB和 AOA 的拷贝数后发现,在长期集约经营后土壤 AOB 的丰度逐渐下降而 AOA 则保持稳
定[11],这也与 He等[8]发现的在酸性土壤中 AOA拷贝数高于 AOB一致。
PCR鄄DGGE虽然能直观的研究土壤 AOA群落结构的变化,但是难以揭示特定环境因子和微生物群落的
内在联系,因此有必要利用统计学方法对试验结果进行分析,如典范对应分析(CCA) [22]、主成分分析
(PCA) [23]、冗余分析(RDA) [24]等。 本研究采用 CCA 方法探讨了 8 个环境因子对土壤 AOA 群落结构的影
响,发现土壤 NO-3 鄄N含量与氨氧化古菌群落变化的相关性最强,但并未达到显著水平(P<0. 05),说明雷竹林
土壤硝化作用是 AOB 和 AOA 共同作用的过程,AOA 在其中也发挥了重要作用。 土壤 pH 值对 AOA 群落结
构的影响较大,这已经被很多研究证明。 董莲华等[25]研究发现 HA 的加入可以稳定土壤 AOA 数量,主要是
由于 HA能够缓冲土壤 pH值,从而间接影响了土壤 AOA群落。 CCA 分析结果同时表明,土壤中速效养分如
有效磷的累积与 AOA群落结构的变化也具有较强的相关性,可能是由于大量速效养分的累积对土壤 AOA产
生了胁迫作用,影响了优势种群的分布,具体的机理目前还没有明确,有待于进一步研究。 集约经营的雷竹林
作为一个高强度施肥的特殊生态环境,在更大的时间尺度上研究其土壤氨氧化古菌群落结构及其活性将是今
后的重点工作,这对于评价生态系统稳定性,提高肥料利用率,减少氨的损失以及环境保护等方面均具有重要
的意义。
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ACTA ECOLOGICA SINICA Vol. 32,No. 19 October,2012(Semimonthly)
CONTENTS
Assessment of monitoring methods for population abundance of Amur tiger in Northeast China
ZHANG Changzhi, ZHANG Minghai, JIANG Guangshun (5943)
…………………………………………
…………………………………………………………………
Changes of residents nitrogen consumption and its environmental loading from food in Xiamen
YU Yang,CUI Shenghui,ZHAO Shengnan, et al (5953)
…………………………………………
……………………………………………………………………………
Analysis of the meiobenthic community in the Pearl River Estuary in summer
YUAN Qiaojun, MIAO Suying, LI Hengxiang, et al (5962)
…………………………………………………………
………………………………………………………………………
Community characteristics of phytoplankton in the coastal area of Leizhou Peninsula and their relationships with primary environ鄄
mental factors in the summer of 2010 GONG Yuyan, ZHANG Caixue, SUN Xingli, et al (5972)………………………………
Morphological differences in statolith and beak between two spawning stocks for Illex argentinus
FANG Zhou, CHEN Xinjun, LU Huajie, et al (5986)
………………………………………
……………………………………………………………………………
Relationships between coastal meadow distribution and soil characteristics in the Yellow River Delta
TAN Xiangfeng, DU Ning, GE Xiuli, et al (5998)
…………………………………
…………………………………………………………………………………
Variation analysis about net primary productivity of the wetland in Panjin region WANG Liwen, WEI Yaxing (6006)………………
Mobilization of potassium from Soils by rhizobium phaseoli ZHANG Liang, HUANG Jianguo, HAN Yuzhu, et al (6016)……………
Autotoxicity of aqueous extracts from plant, soil of peanut and identification of autotoxic substances in rhizospheric soil
HUANG Yuqian, HAN Lisi, YANG Jinfeng, et al (6023)
……………
…………………………………………………………………………
Effects of shading on the photosynthetic characteristics and anatomical structure of Trollius chinensis Bunge
LV Jinhui,WANG Xuan, FENG Yanmeng, et al (6033)
…………………………
……………………………………………………………………………
Short鄄term effects of fire disturbance on greanhouse gases emission from hassock and shrubs forested wetland in Lesser Xing忆an
Mountains, Northeast China GU Han,MU Changcheng, ZHANG Bowen, et al (6044)…………………………………………
Plant species diversity and community classification in the southern Gurbantunggut Desert ZHANG Rong, LIU Tong (6056)…………
Effects of mixing leaf litter from Pinus sylvestris var. mongolica and Larix principis鄄rupprechtii with that of other trees on soil
properties in the Loess Plateau LI Qian,LIU Zengwen,MI Caihong (6067)………………………………………………………
Effects of long鄄term intensive management on soil ammonia oxidizing archaea community under Phyllostachys praecox stands
QIN Hua, LIU Borong, XU Qiufang, et al (6076)
…………
…………………………………………………………………………………
Hydrogen peroxide participates symbiosis between AM fungi and tobacco plants
LIU Hongqing,CHE Yongmei, ZHAO Fanggui, et al (6085)
………………………………………………………
………………………………………………………………………
Relationships between dominant arbor species distribution and environmental factors of shelter forests in the Beijing mountain
area SHAO Fangli, YU Xinxiao, ZHENG Jiangkun, et al (6092)…………………………………………………………………
Analysis of rhizosphere microbial community structure of weak and strong allelopathic rice varieties under dry paddy field
XIONG Jun, LIN Huifeng, LI Zhenfang, et al (6100)
……………
……………………………………………………………………………
Root distribution in the different forest types and their relationship to soil properties
HUANG Lin, WANG Feng, ZHOU Lijiang,et al (6110)
……………………………………………………
……………………………………………………………………………
Effect of silicon application on antioxidant system, biomass and yield of soybean under ozone pollution
ZHAN Lijie, GUO Liyue, NING Tangyuan, et al (6120)
………………………………
…………………………………………………………………………
Effect of landfill leachate irrigation on soil physiochemical properties and the growth of two herbaceous flowers
WANG Shuqin,LAI Juan,ZHAO Xiulan (6128)
………………………
……………………………………………………………………………………
Nitrous oxide emissions affected by tillage measures in winter wheat under a rice鄄wheat rotation system
ZHENG Jianchu, ZHANG Yuefang, CHEN Liugen, et al (6138)
………………………………
…………………………………………………………………
Effects of different fertilizers on soil enzyme activities and CO2 emission in dry鄄land of maize
ZHANG Junli, GAO Mingbo, WEN Xiaoxia,et al (6147)
…………………………………………
…………………………………………………………………………
The response of agro鄄ecosystem productivity to climatic fluctuations in the farming鄄pastoral ecotone of northern China: a case
study in Zhunger County SUN Tesheng, LI Bo, ZHANG Xinshi (6155)…………………………………………………………
The relationship between energy consumption and carbon emissiont with economic growth in Liaoning Province
KANG Wenxing,YAO Lihui,HE Jienan,et al (6168)
………………………
………………………………………………………………………………
Spatial distribution characteristics of potential fire behavior in Fenglin Nature Reserve based on FARSITE Model
WU Zhiwei, HE Hongshi, LIANG Yu, et al (6176)
……………………
………………………………………………………………………………
Chill conservation of natural enemies in maize field with different post鄄crop habitats
TIAN Yaojia, LIANG Guangwen, ZENG Ling, et al (6187)
……………………………………………………
………………………………………………………………………
Effect of population of Kerria yunnanensis on diversity of ground鄄dwelling ant
LU Zhixing, CHEN Youqing, LI Qiao, et al (6195)
…………………………………………………………
………………………………………………………………………………
Response of Parnassius apollo population and vertical distribution to climate warming
YU Fei,WANG Han,WANG Shaokun,et al (6203)
…………………………………………………
…………………………………………………………………………………
Review and Monograph
Integrated assessment of marine aquaculture ecosystem health: framework and method
PU Xinming,FU Mingzhu, WANG Zongling, et al (6210)
…………………………………………………
…………………………………………………………………………
Seagrass meadow ecosystem and its restoration: a review PAN Jinhua,JIANG Xin,SAI Shan,et al (6223)……………………………
Nutri鄄toxicological effects of cyanobacteria on fish DONG Guifang, XIE Shouqi, ZHU Xiaoming, et al (6233)………………………
Effect of environmental stress on non鄄structural carbohydrates reserves and transfer in seagrasses
JIANG Zhijian,HUANG Xiaoping,ZHANG Jingping (6242)
………………………………………
………………………………………………………………………
Advances in ecological immunology XU Deli, WANG Dehua (6251)……………………………………………………………………
Scientific Note
The causes of spatial variability of surface soil organic matter in different forests in depressions between karst hills
SONG Min, PENG Wanxia, ZOU Dongsheng, et al (6259)
…………………
………………………………………………………………………
Characteristics of seed rain of Haloxylon ammodendron in southeastern edge of Junggar Basin
L譈 Chaoyan, ZHANG Ximing, LIU Guojun, et al (6270)
…………………………………………
…………………………………………………………………………
《生态学报》2013 年征订启事
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(SHENGTAI摇 XUEBAO)
(半月刊摇 1981 年 3 月创刊)
第 32 卷摇 第 19 期摇 (2012 年 10 月)
ACTA ECOLOGICA SINICA
摇
(Semimonthly,Started in 1981)
摇
Vol郾 32摇 No郾 19 (October, 2012)
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