全 文 ：植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2012, 47 (4): 357–365, www.chinbullbotany.com
doi: 10.3724/SP.J.1259.2012.00357
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收稿日期: 2012-03-08; 接受日期: 2012-05-26
基金项目: 国家自然科学基金(No.30900789)和国家自然科学基金委员会-广东省人民政府联合基金(No.U0631001)
* 通讯作者。E-mail: wangxj@scnu.edu.cn
拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应
张盛春, 鞠常亮, 王小菁*
华南师范大学生命科学学院, 广东省植物发育生物工程重点实验室, 广州 510631
摘要 植物漆酶基因家族在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中共有17个成员, 目前各基因的具体功能尚不十分清楚。该研究
利用过量表达的方法初步分析了拟南芥AtLAC4的功能。GUS染色显示AtLAC4在拟南芥的维管组织中有较强的表达, 并在
叶片排水器中特异表达。AtLAC4过量表达导致植株木质素含量增多、次生壁加厚、植株变小和莲座叶叶柄变短。ABA对
AtLAC4的表达具有明显的诱导作用, AtLAC4过量表达植株对外源ABA敏感; 干旱处理后, AtLAC4过量表达植株的耐旱能
力比野生型明显增强。以上结果表明, AtLAC4基因在调控植物生长发育及非生物胁迫响应中具有重要作用。
关键词 ABA, 拟南芥, AtLAC4, 漆酶, 木质素
张盛春, 鞠常亮, 王小菁 (2012). 拟南芥漆酶基因AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应. 植物学报 47, 357–365.
漆酶(Laccase)是一种含铜的多酚氧化酶, 最早
是从漆树(Rhus venicifera)的分泌物中发现的。按其
来源主要分为植物漆酶(Rhus Laccase)和真菌漆酶
(Fungal Laccase)两大类。植物漆酶一般是由约500
个氨基酸的单一多肽组成。Cu2+以配位键与特定的氨
基酸相连, 并处于漆酶的活性部位, 在漆酶的催化氧
化过程中起决定作用。最初报道漆酶在植物中的主要
生理功能是与木质素的合成相关, 并参与植物细胞次
生壁的合成与木质部组织的木质化, 说明漆酶在植物
的生长发育过程中具有重要作用(Mayer and Staplesb,
2002; 王国栋和陈晓亚, 2003)。此外, 作为多酚氧化酶
家族的漆酶还能够使酚类化合物聚合, 参与对伤害的
防御反应, 使植物免受昆虫和病原体的侵袭(Lavid et
al., 2001; Weech et al., 2008)。生化研究证据表明, 漆
酶还与植物中铁的代谢有关(Pourcel et al., 2005)。
拟南芥中漆酶基因家族(Laccase gene family)共
有17个成员。McCaig等(2005)运用构建系统进化树
等生物信息学方法将此17个基因归类至6个漆酶亚家
族中。Turlapati等(2011)对拟南芥17个漆酶基因成员
的表达模式进行了详细研究, 发现它们的时空表达模
式有较大差异。
最近, 植物漆酶的功能已逐步成为研究的热点。
Cai等(2006)对拟南芥漆酶家族功能缺失突变体进行
了研究, 发现lac2在PEG诱导的脱水条件下能够抑制
根的伸长; lac8能够提早开花; lac15种子的颜色变成
淡黄色或者乳白色, 说明漆酶在植物器官的发育及胁
迫应答方面具有重要作用。Pourcel等(2005)揭示了
tt10(AtLAC15)突变体种皮颜色变化的机理 , 表明
TT10改变种皮颜色与类黄酮的氧化聚合有关。Liang
等(2006)也对AtLAC15进行了研究, 发现AtLAC15不
但能够引起种皮颜色的改变, 还能够影响种子的萌发
和根的延长, 并为AtLAC15参与木质素的合成提供了
遗传学方面的证据。Zhou等(2009)和Berthet等(2011)
对拟南芥的研究发现, AtLAC4 (Arabidopsis thaliana
LACCASE 4)可能在木质素及植物次生壁合成过程中
起重要作用。
迄今为止, 拟南芥中关于漆酶家族的研究主要集
中在生物信息学及表达模式的研究等方面, 关于漆酶
家族成员生物学功能的研究则报道较少。虽然
AtLAC4基因可能参与木质素及植物次生壁的合成,
但是其在植物生长发育中的具体生物学功能尚不十
分清楚, 需要更多的实验数据来阐明。本文主要以过
量表达AtLAC4植株和AtLAC4启动子与 β-glucur-
onidase(GUS)报告基因融合表达植株为材料, 研究
在植物生长发育过程中和响应外界环境时该基因的
功能, 以期为AtLAC4基因及植物漆酶基因家族的功
·研究论文·
358 植物学报 47(4) 2012

能研究提供证据。
1 材料与方法
1.1 植物材料与处理
拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)为Columbia-0生态
型; AtLAC4基因的基因编号为At2g38080。拟南芥种
子先经70%乙醇表面消毒30秒, 之后加入10%次氯
酸钠消毒10分钟, 无菌水冲洗4–5次后均匀播种于
MS平板上。4°C保湿黑暗冷藏3天打破休眠, 之后移
至拟南芥培养室中培养。10天后移至土壤中生长, 培
养温度为(22±2)°C, 光暗周期为16小时光照/8小时黑
暗, 光照强度为120–150 μmol·m–2·s–1。
取MS培养基上生长14天的野生型拟南芥, 分别
用无菌水、100 μmol·L–1赤霉素、100 μmol·L–1萘乙
酸、100 μmol·L–1脱落酸、1 mmol·L–1水杨酸、30
mmol·L–1蔗糖、15%聚乙二醇、5 μmol·L–1 CuSO4以
及4°C处理3个小时, 然后取样, 用于提取RNA进行
基因表达检测。植物激素均为Sigma公司产品, 其它
化学试剂均购于上海生工生物工程有限公司。
表型分析主要按照Boyes等(2001)对拟南芥生长
进行的分期进行。以野生型为对照, 观察各转基因植
株及突变体在不同生长发育时期的生长状况, 拍照并
测定相关数据。种子萌发以胚根突破种皮为标准; 叶
柄长度统计时, 分别取16株野生型与35S:AtLAC4植
株的第5–10片莲座叶进行测定。取生长20天左右的
野生型和过量表达植物进行干旱胁迫处理, 连续处理
10天和20天后进行表型观察。所有表型分析实验均在
相同条件下重复进行3次。
1.2 转基因拟南芥的获得
GUS基因的植物表达载体为pCAMBIA1303, 利用引
物5′-ACTGAGCTCACCATAGTTTTCATTGGAC-3′和
5′-ATACCATGGCTCCCTCTCTATCTTTCTC-3′从植
物基因组DNA中扩增AtLAC4的启动子序列; 测序正
确后, 利用SacI和NcoI将启动子构建到GUS植物表
达载体中。过量表达载体为改造过的pCAMBIA-
1390。利用引物 5′-AGTTCTAGAATGGGGTCTC-
ATATGGTTTG-3′和 5′-ATTGGATCCTTAGCACTT-
GGGAAGATC-3′将AtLAC4基因的CDS连接到T载体
上; 测序正确后, 利用XbaI和BamHI将CDS连接到植
物过量表达载体中。分别以pCAMB- IA1303和改造过
的pCAMBIA1390质粒为对照, 用连接成功的植物表
达载体质粒转化农杆菌LBA4404, 并用花粉管浸染
法转化拟南芥, 潮霉素筛选转基因植株并进行PCR
检测, 选取单位点插入的纯合转基因株系用于后续
实验。
1.3 半定量RT-PCR
利用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA后 , 用DNA-
ase I (Takara)处理以消除基因组DNA的污染。定量
后, 吸取等量的RNA并用PrimeScriptTM反转录试剂
盒(Takara)进行cDNA第1链的合成; 再吸取等量的
cDNA为模板进行PCR反应, 进行26个循环。取15
μLPCR产物进行电泳检测。
检测目的基因AtLAC4的引物为5′-TCATCGTT-
CTAGGTGAATGGTGG-3和 5′-TCTTGAAGGACA-
AGCTGAACAGTG-3′; 内参Actin基因的引物为5′-
GTATGTGGCTATTCAGGCTGT-3′和 5′-CTGGCG-
GTGCTTCTTCTCTG-3′。
RT-PCR电泳后, 利用Bio Image (Gene com-
pany Ltd.)系统拍照。采用Gene Tools软件(Gene
company Ltd.)对PCR产物进行量化计算。目的基因的
相对表达量以基因电泳条带的吸光度峰值与内参基因
Actin的吸光度峰值的比值来表示。在严格保证样品处
理、总RNA提取、cDNA合成、PCR和拍照等过程中
各条件和参数条件一致的情况下进行3次重复实验。
1.4 GUS组织化学染色
GUS组织化学染色参考Jefferson等(1987)所述方法
并略有改动。在含有1 mmol·L–1EDTA、0.1% Triton
X-100、100 μg·mL–1氯霉素、2 mmol·L–1铁氰化钾和
2 mmol·L–1亚铁氰化钾的50 mmol·L–1磷酸缓冲液(pH
7.0)中, 加入100 mg·mL–1X-Gluc母液(N,N-二甲基甲
酰胺溶解), 使X-Gluc终浓度为1 mg·mL–1。取幼苗或
组织剪成小块置于1 mL配制好的上述染色液中 ,
37°C温育12小时, 期间摇动数次, 70%乙醇脱色至透
明。在Nikon显微镜(10×10倍)下观察并拍照。X-Gluc
为Genview公司产品。
1.5 木质素相对含量的测定
参考Pomar等(2002)和Barceló(2005)所述的方法测
张盛春等: 拟南芥漆酶基因 AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应 359

定木质素相对含量。称取1 g间苯三酚溶于100 mL配
好的10.1 mol·L–1HCl/乙醇(25/75,v/v)溶液中; 取拟
南芥花茎靠近基部的一节, 徒手制作横截面切片, 切
片厚度约为100 μm; 将切片置于配好的间苯三酚-盐
酸-乙醇溶液中, 染色约30分钟; 之后, 倒出染色液,
用清水冲洗3次, 洗掉浮色; 将切片置于载玻片上制
成临时装片。在显微镜下观察并拍照。
2 结果与分析
2.1 AtLAC4的时空表达
为了研究AtLAC4基因的具体功能 , 我们首先利用
AtLAC4基因启动子与β-glucuronidase(GUS)报告基
因融合表达系统详细研究了AtLAC4基因的时空表达
模式。构建载体转化拟南芥获得纯合转基因植株, 取
转基因植株的不同器官和组织进行GUS染色。结果表
明, AtLAC4基因启动子驱动GUS可以在萌发3天种子
的子叶和胚根(图1A)、萌发5天幼苗的根维管束(图
1B)、10天幼苗的子叶叶脉(图1C)、45天植株花器官
中的萼片、雌蕊柱头、雄蕊花丝以及角果与果柄连接
处(图1J, K)等明显表达, 且AtLAC4在以上部位的表
达模式与Berthet等(2011)的研究结果基本一致。此
外, AtLAC4基因启动子驱动GUS在植物的茎尖(图
1I)、根与花序轴的维管组织(图1E, G)、下胚轴与根
的连接处以及根的维管组织中(图1F)也有非常强的
表达, 并在真叶(图1D)和莲座叶叶缘排水器(图1H)中
有非常特异的表达。
2.2 AtLAC4过量表达引起植株变小
由于AtLAC4基因在植物发育的各个时期均有表达,
暗示着其可能在植物的不同生长阶段均有作用。拟南
芥漆酶基因家族成员较多 , 并且大多数成员(包括
AtLAC4基因)的单一缺失突变体没有明显表型, 故各
成员间可能存在着功能冗余(Cai et al., 2006)。因此,
我们利用过量表达的方法对AtLAC4的可能功能进行
了研究。我们利用转基因方法共获得24个AtLAC4过
量表达转基因株系, 并选取其中潮霉素筛选过程中幼
苗黄绿比符合1:3并且纯合的2个转基因株系进行后
续的功能分析。首先, 我们对筛选的纯合35S:AtLAC4
转基因植株进行AtLAC4基因表达水平检测。RT-PCR
结果(图2B)表明, 转基因植株中AtLAC4基因表达水
平明显升高。
表型分析发现, 与野生型拟南芥相比, AtLAC4过
量表达会引起植株变小。主要表现在以下两点: (1) 在
由营养生长转化为生殖生长的过程中, 特别是在抽薹
后(30–40天), AtLAC4过量表达植株的花茎比野生型




图1 pAtLAC4::GUS转基因植株的GUS组织化学染色
(A), (B) 分别为3天和5天的幼苗; (C) 10天幼苗的子叶; (D) 10天幼苗真叶叶缘排水器; (E) 花序轴维管组织; (F), (G) 根维管组织;
(H) 莲座叶叶缘排水器; (I) 茎尖; (J) 幼嫩的角果; (K) 花器官。Bar=500 μm。

Figure 1 Histochemical localization of GUS activity in pAtLAC4::GUS plants
(A), (B) 3-day-old and 5-day-old seedlings; (C) 10-day-old cotyledon; (D) 10-day-old hydathodes of the first leaves; (E) Vascular
of inflorescence stem; (F), (G) Root vascular; (H) Hydathodes of rosette leaves; (I) Shoot apex; (J) Immature siliques; (K) Flower
organs. Bar=500 μm.
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图2 35S:AtLAC4植株的表型及分子鉴定
(A) 35天和40天的35S:AtLAC4转基因植株的表型, 其中40天为去除花茎的植株(Bar=1 cm); (B) RT-PCR检测35S:AtLAC4转基因植
株中AtLAC4基因的表达水平; (C) 叶柄长度统计(* P<0.05; ** P<0.01)

Figure 2 Phenotype and molecular identification of the 35S:AtLAC4 plants
(A) Phenotype of the 35- and 40-day-old 35S:AtLAC4 plants; the inflorescence stem was removed in the 40-day-old plants
(Bar=1 cm); (B) Detection of AtLAC4 gene expression by RT-PCR; (C) Measurement of the petiole length (* P<0.05; ** P<0.01)


伸长得慢, 莲座叶的直径明显小于野生型(图2A); (2)
40天的植株去除花茎后, AtLAC4过量表达植株各莲
座叶所形成的莲座大小明显小于野生型(图2A)。由于
莲座直径的大小主要与第5–10片莲座叶叶柄的长短
有关, 因此, 我们测定了拟南芥的第5–10片莲座叶叶
柄的长度。结果表明, AtLAC4过量表达植株的叶柄长
度明显比野生型的短, 所选野生型的平均叶片叶柄长
度一般为1.0–1.2 cm, 而AtLAC4过量表达植株的叶
柄长度仅为0.8 cm左右(图2C)。
2.3 AtLAC4过量表达植株木质素相对含量增多
在AtLAC4过量表达植株变小的同时, 我们还发现转
基因植株的叶片硬度比野生型的要大。已有的研究表
明, 漆酶基因可能与木质素的合成有关(Mayer and
Staplesb, 2002; Liang et al., 2006; Zhou et al.,
2009)。因此我们推测, AtLAC4过量表达植株叶片变
硬可能与木质素的含量增加有关。
木质素是一种复杂的酚类聚合物, 主要存在于植
物木质组织中的次生壁上。在盐酸存在的情况下, 木
质素可与间苯三酚聚合形成一种紫红色化合物
(Pomar et al., 2002)。染色愈深且染色细胞愈多说明
木质素含量越高, 据此我们可以测量木质素的相对含
量。参照Barceló(2005)的方法, 取40天的野生型和
35S:AtLAC4拟南芥的花序轴靠近基部一节的相同部
位, 进行徒手切片, 然后以盐酸为介质分别对其进行
间苯三酚染色。结果表明, AtLAC4过量表达植株木质
部中的木质素含量明显比野生型的高(图3A, B, 方框
所示), 并且其细胞的次生壁亦变厚(图3C, D)。研究
结果与我们的推测相一致。
以上研究结果表明, AtLAC4的过量表达可以引
起植株出现变小、叶柄变短和叶片硬度增大的表型,
并且这些表型的出现可能与木质素含量的增加有关。
张盛春等: 拟南芥漆酶基因 AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应 361




图3 35S:AtLAC4植株中木质素的相对含量增加
(A), (C) Col-0; (B), (D) 35S:AtLAC4。Bar=50 μm。

Figure 3 Relative content of lignin was increased in the 35S:
AtLAC4 plants
(A), (C) Col-0; (B), (D) 35S:AtLAC4. Bar=50 μm.

2.4 非生物胁迫和激素对AtLAC4表达的影响
在正常培养条件下, AtLAC4过量表达植株除出现植
株变小的表型外, 没有观察到其它表型出现。为了进
一步探讨在外界胁迫条件下AtLAC4的功能, 首先,
我们对AtLAC4基因的启动子区域进行了生物信息学
分析, 发现其启动子区域含有大量与植物激素以及
非生物胁迫相关的顺式作用元件。根据对AtLAC4启
动子顺式作用元件的生物信息学分析 , 我们推测
AtLAC4可能与激素及其它非生物胁迫相关, 并进一
步考察了相关激素及非生物胁迫对AtLAC4表达的影
响。选取在MS培养基上生长14天的拟南芥幼苗, 经
GA3、NAA、ABA、SA、蔗糖(Suc)、聚乙二醇(PEG)
和CuSO4等各种激素和非生物胁迫因素处理3小时,
利用RT-PCR检测AtLAC4基因的表达情况。结果表
明, 与对照相比, ABA和SA能够促进AtLAC4的表达,
而蔗糖、低温和Cu2+则抑制其表达(图4)。其中ABA
对AtLAC4基因表达的诱导作用最为明显, ABA处理
组AtLAC4的表达量与对照相比增加了3倍多(图4B),
表明AtLAC4基因可能在响应ABA信号过程中起
作用。




图4 外界因素与激素对AtLAC4表达的影响
(A) RT-PCR电泳检测(4°C(无菌水), CuSO4(5 μmol·L–1)); (B)
RT-PCR结果的量化, 比值=目的带吸光度峰值/Actin吸光度峰
值。CK: 对照(无菌水); GA: 赤霉素(100 μmol·L–1); NAA: 萘乙
酸(100 μmol·L–1); ABA: 脱落酸(100 μmol·L–1); SA: 水杨酸
(1 mmol·L–1); Suc: 蔗糖(30 mmol·L–1); PEG: 15%聚乙二醇

Figure 4 Effect of bio- and abio-factor on the expression of
AtLAC4
(A) RT-PCR assay (4°C (sterile water), CuSO4 (5 μmol·L–1));
(B) Quantification of RT-PCR. Ratio=absorbance peak value
of purpose gene electrophoresis band/absorbance peak
value of Actin. CK: Control (sterile water); GA: Gibberellin
(100 μmol·L–1); NAA: Naphthylacetic acid (100 μmol·L–1);
ABA: Abscisic acid (100 μmol·L–1); SA: Salicylic acid
(1 mmol·L–1); Suc: Sucrose (30 mmol·L–1); PEG: 15% polye-
thylene glycol

2.5 AtLAC4过表达植株对外源ABA敏感
已有的研究表明, 植物种子的正常萌发需要适当的
ABA含量。当内源或者外界ABA含量过高时, 植物种
子的萌发过程就会延长或者受到抑制。通过对启动子
的生物信息学分析发现, AtLAC4启动子中应答ABA
的顺式作用元件最多。此外, 通过RT-PCR检测激素
处理过的拟南芥, 发现AtLAC4的表达受ABA的影响
最明显(图4)。为了进一步研究AtLAC4基因在响应
ABA胁迫中的功能, 我们将Col与35S:AtLAC4同时播
种于含5 μmol·L–1 ABA的MS培养基上(对照组种植于
不含ABA的MS培养基上), 每天统计其萌发率。结果
发现, 35S:AtLAC4种子的萌发受到ABA的明显抑制。


362 植物学报 47(4) 2012

在含有ABA的培养基上萌发4天后, 野生型种子的萌
发率可达40%, 而AtLAC4过量表达植株种子的萌发
率仅为8%(图5B)。到萌发12天时, 虽然二者的萌发率
已基本相近, 但是AtLAC4过量表达植株的胚根生长
明显受到抑制(图5A)。以上结果表明, AtLAC4过量表
达植株对外源ABA的敏感性增加 , 进一步说明At-
LAC4基因可能在植物响应ABA过程中起一定作用。
2.6 AtLAC4过量表达植株耐旱能力增强
一般来说 , 对ABA敏感的植物往往耐旱能力较强
(Zhang et al., 2007)。为了进一步研究AtLAC4过量表



图5 AtLAC4过量表达植株对ABA敏感
(A) 萌发12天的幼苗; (B) ABA对种子萌发率的影响

Figure 5 AtLAC4 over-expression plants are sensitive to
exogenous ABA
(A) Seedlings that germinated for 12 days; (B) Effect of ABA
on the germination rate of seeds

达植株对ABA敏感性的增加是否通过ABA信号途径
增强了植物的耐旱能力, 我们分析了AtLAC4过量表
达植株在干旱条件下与野生型植株的差异。结果发现,
生长20天的植株经过干旱处理10天后, AtLAC4过量
表达植株的表型与野生型相比差别更加明显, 过量表
达植株的莲座叶明显变小, 叶柄变短(图6A, B), 可能
是因为干旱胁迫诱导ABA合成后, ABA进一步上调了
AtLAC4基因的表达量, 从而引起木质素的含量增加,
导致过量表达植株的表型更加明显。当干旱胁迫处理
第20天时, 相同生长时期的野生型拟南芥基本上已
经全部萎蔫, 而AtLAC4过量表达植株仍然能够正常
生长(图6C), 表明AtLAC4过量表达植株的耐旱能力
比野生型明显增强。



图6 AtLAC4过量表达植株耐旱能力增强
(A) 生长30天的幼苗; (B) 经干旱处理10天的30天龄幼苗; (C)
经干旱处理20天的40天龄植株

Figure 6 AtLAC4 over-expression plants showed enhanced
drought tolerance
(A) The 30-day-old seedlings; (B) The 30-day-old seedlings
treated by drought for 10 days; (C) The 40-day-old plants
treated by drought for 20 days
张盛春等: 拟南芥漆酶基因 AtLAC4参与生长及非生物胁迫响应 363

3 讨论
3.1 AtLAC4参与植物木质素的合成
植物的维管组织起源于原形成层细胞, 这些细胞来源
于植物的顶端分生组织(Fukuda, 2004)。木质素是维
管组织细胞次生壁的重要组分, 主要存在于次生细胞
壁中, 影响维管的厚度和硬度(Boerjan et al., 2003)。
木质素含量越高, 细胞的次生壁也越厚, 其含量的高
低对植物维管系统的发育起重要决定作用。
目前, 虽然有些漆酶基因被认为与木质素的合成
有关, 例如, lac15突变体种皮中的木质素含量比野生
型植株低30%(Liang et al., 2006), 但是漆酶在植物
木质化过程中的功能仍不清楚。AtLAC4基因在茎、
叶柄、根以及胚轴维管组织中的表达非常明显, 并且
在茎尖顶端分生组织处有非常强烈的表达(图1), 这
些表达部位与维管组织的起始和发育部位十分一致,
表明AtLAC4可能在维管系统的发育过程中起重要作
用。Berthet等(2011)研究发现lac4或者lac17突变体
中的木质素含量在长日照或者连续光照条件下均比
野生型的低10%左右, 但是没有出现明显的表型; 而
在lac4 lac17双突变体中, 漆酶活性降低到野生型的
50%, 木质素含量最低只有野生型的60%, 并且在连
续光照条件下出现半矮化的表型。在我们的研究中,
采用间苯三酚对花序轴横切面进行染色, 发现 At-
LAC4过量表达植株的木质化细胞与野生型相比明显
增多, 木质素含量明显升高且次生壁明显加厚(图3)。
以上研究结果表明, AtLAC4在调控木质素的合成过
程中确实起着重要作用。MYB58和MYB63是参与植
物细胞次生壁合成的2个重要转录因子, 它们在木质
化程度较高的维管组织及木质部细胞中特异表达; 在
MYB58和MYB63过量表达的植株中, AtLAC4的表达
量明显上升(Zhou et al., 2009), 进一步表明AtLAC4
可能通过影响木质素的合成而参与植物次生壁的
合成。
植物细胞壁是一个高度复杂的动态结构, 在决定
细胞的形状和大小时起重要作用, 植物的生长与细胞
壁的松弛及是否加厚有关 (Carpita and Gibeaut,
1993)。虽然lac4突变体的木质素含量有所降低, 但是
其在各种培养条件下并未出现明显的发育表型(Ber-
thet et al., 2011), 表明只有当植物体类木质素含量
发生较大改变时才会导致细胞生长的变化, 从而引起
发育表型的出现; 或者是基因之间的功能冗余导致了
lac4突变体的表型不明显。AtLAC4过量表达引起植株
变小和叶柄变短, 进而导致植株出现莲座直径变小、
花序轴及叶片变硬等表型, 推测其根本原因在于植株
中木质素含量的大量增加导致拟南芥细胞次生壁加
厚, 从而限制了植物的生长, 并且由于木质化程度的
加大导致了花序轴的变硬。另外, 我们还发现AtLAC4
过量表达的植株中, 叶绿素含量明显增多(未发表资
料)。但从已有的文献来看 , 还没有相关证据表明
AtLAC4与叶绿素的合成相关, 因此我们认为这可能
是更为下游的一个事件, 即叶绿素含量的增多并非由
AtLAC4过量表达直接引起。
3.2 AtLAC4与外源激素及非生物胁迫的关系
AtLAC4与激素和非生物胁迫的关系至今尚未见报
道。对漆酶家族启动子顺式作用元件的生物信息学分
析表明, AtLAC4的启动子中ABA应答元件的数目最
多。我们通过RT-PCR检测发现, ABA能使AtLAC4表
达明显增强(图4)。因此, 我们研究了ABA对AtLAC4
转基因植株种子萌发的影响, 结果表明, AtLAC4过量
表达植株种子的萌发受到明显抑制且对ABA的敏感
性增强(图5)。其原因可能是在35S:AtLAC4转基因植
株中, AtLAC4的过量表达增强了ABA对种子休眠的
作用。我们也研究了lac4突变体对ABA的敏感性, 其
敏感性与野生型相比无明显差异(未发表资料)。ABA
对lac4突变体种子萌发的影响与野生型相比差异不
大, 可能是因为拟南芥漆酶家族有17个成员, 彼此之
间存在功能冗余。该实验结果说明, AtLAC4可能与
ABA信号途径有关, 但其具体的分子机制还需要进一
步的实验来验证和阐明。同时, 根据AtLAC4启动子驱
动GUS时空表达的结果来看, 其在叶缘排水器及根
部维管组织中有较强的表达, 说明AtLAC4可能与植
物的抗旱性有关。我们进一步对野生型及AtLAC4过
量表达植株进行干旱处理, 结果表明AtLAC4过量表
达植株的耐干旱能力明显增强(图6)。目前, 已有大量
的研究表明耐干旱能力强的植株往往对外源ABA敏
感, 这与AtLAC4过量表达植株对外源ABA敏感的结
果相一致。同时, 我们还发现干旱处理后AtLAC4过量
表达植株与野生型的差异更加明显(图6), 表明干旱
可能促进ABA的合成, 进而促进AtLAC4的表达。过量
表达植株中AtLAC4表达显著增强, 从而导致植株更
364 植物学报 47(4) 2012

加矮小。
维管组织在植物的结构、水分和营养运输及信号
物质传递等各方面均起重要作用(Sieburth and Dey-
holos, 2006)。AtLAC4过量表达植株的木质素含量升
高可能导致维管组织发育模式的改变, 从而影响了植
物对水分以及植物激素(如ABA)的运输能力, 导致过
量表达植株对ABA敏感并表现出耐旱能力增强的表
型。我们将在后续实验中利用不同木质素含量的拟南
芥突变体(如35S:AtLAC4和lac4 lac17), 或者通过构
建不同AtLAC4基因表达量的RNAi植株等来研究木质
素含量与植物水分运输及激素响应之间的联系, 为阐
明漆酶基因通过调控木质素含量来调控植物生长发
育以及响应外界生物、非生物胁迫的机理提供进一步
证据。另外, 我们还将采用northern印迹杂交等各种
方法来检测不同干旱处理时间对AtLAC4表达的影响,
以进一步说明AtLAC4与植物抗旱及ABA之间的相
关性。
目前, 有关漆酶基因对植物激素及非生物胁迫响
应的研究还非常少, 并且对拟南芥漆酶基因功能及其
作用的分子机理研究也还不够深入。因此利用分子生
物学方法来详细阐明AtLAC4基因的作用机理能够为
植物漆酶家族基因的研究提供重要的理论依据。
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Arabidopsis Laccase Gene AtLAC4 Regulates Plant Growth
and Responses to Abiotic Stress
Shengchun Zhang, Changliang Ju, Xiaojing Wang*
Guangdong Provincial Key Laboratory of Biotechnology for Plant Development, College of Life Sciences, South China
Normal University, Guangzhou 510631, China
Abstract The plant laccase gene family has 17 genes in Arabidopsis, but their functions have not been clearly demon-
strated. We analyzed the function of AtLAC4 by overexpressing it in wild-type plants. GUS staining revealed that AtLAC4
strongly expressed in vascular tissues and specifically in the leaf hydathodes. AtLAC4-overexpressor plants were dwarf
and had shorter leaf petioles, both caused by increased lignin content and secondary wall thickness. The expression of
AtLAC4 was induced significantly by abscisic acid (ABA), and AtLAC4-overexpressor plants were sensitive to exogenous
ABA. Drought tolerance was enhanced in AtLAC4 overexpression than in wild-type plants. AtLAC4 may play important
roles in regulating plant growth, and responding to abiotic stress.
Key words abscisic acid, Arabidopsis, AtLAC4, laccase, lignin
Zhang SC, Ju CL, Wang XJ (2012). Arabidopsis laccase gene AtLAC4 regulates plant growth and responses to abiotic
stress. Chin Bull Bot 47, 357–365.
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* Author for correspondence. E-mail: wangxj@scnu.edu.cn
(责任编辑: 孙冬花)